双黄连注射剂中黄芩苷致敏家兔后血清中特异性抗体的测定

目的酶联免疫吸附法(ELISA)检测双黄连注射剂中小分子半抗原物质黄芩苷致敏家兔后血清中特异性抗体效价。方法取新西兰种家兔10只,分为空白组、黄芩苷组,每组各5只。自家兔耳缘动脉采血10 m L,制备致敏前血清。将被液相色谱-质谱-血清白蛋白结合系统检测的黄芩苷与家兔血清体外孵育,制成黄芩苷-血浆蛋白完全抗原。将此完全抗原以皮下注射的方式对家兔进行免疫,免疫次数共5次。最后一次免疫结束后,间隔1周时间,将其麻醉,用采血针自家兔腹主动脉采血制备黄芩苷-血浆蛋白全抗原的抗血清。用ELISA法检测抗血清的抗体效价(OD值);间接竞争ELISA法测定家兔抗血清的特异性抗体;采用兔免疫球蛋白E(Ig E)ELISA试剂盒检测各组家兔抗血清中Ig E抗体的含量。结果黄芩苷的抗体效价(OD)与阴性对照组的(OD)比值2,因此说明黄芩苷具有致敏性。家兔体内产生的抗血清中的抗体具有一定的特异性。家兔体内明显产生了外源性Ig E型抗体。结论黄芩苷对家兔具有致敏性。     

双黄连注射剂中黄芩苷致敏原性的研究

目的:研究双黄连注射剂中黄芩苷的致敏原性.方法:通过运用酶联免疫双抗夹心和免疫指纹图谱2种方法结合对双黄连注射剂中黄芩苷的致敏原性进行研究.结果:运用酶联免疫双抗夹心法检测黄芩苷的致敏性,结果呈阳性反应;运用免疫指纹图谱法检测黄芩苷的致敏性,致敏率为86.28％.结论:通过运用以上方法结合确定了双黄连注射剂中黄芩苷为致敏原,建立了快速筛查中药注射剂中致敏原的分析方法.     

双黄连注射剂中绿原酸致敏家兔后血清中特异性抗体的测定

目的:ELISA法检测双黄连注射剂中小分子半抗原物质绿原酸致敏家兔血清中的特异性抗体效价。方法:取新西兰种家兔,自家兔耳中心动脉采血10ml,制备致敏前血清。将绿原酸与家兔血清体外孵育,制成绿原酸-血浆蛋白完全抗原,将完全抗原皮下注射以免疫动物,1月内共5次。末次注射后7天,麻醉动物,自腹主动脉取血,制备血清,即为绿原酸-血浆蛋白全抗原的抗血清,用ELISA法检测抗血清的抗体效价(OD值);间接竞争ELISA法测定家兔抗血清的特异性抗体;采用兔免疫球蛋白E(Ig E)ELISA试剂盒检测家兔抗血清中Ig E抗体的含量。结果:绿原酸的抗体效价高于致敏前血清OD值的2倍,说明绿原酸有潜在的致敏性。绿原酸免疫后的家兔抗血清中的抗体具有一定的特异性。经过多次免疫后的家兔体内产生了外源性Ig E型抗体。结论:绿原酸在本实验条件下对家兔有致敏性。     

双黄连注射剂中黄芩苷抗原合成及抗血清制备分析探讨

目的：对双黄连注射剂中黄芩苷抗原的合成以及抗血清成分的制备情况进行分析探讨,为今后药物研究工作提供可靠的参考依据。方法：将黄芪苷与牛血清白蛋白采用高碘酸钠法进行交联,鉴定方法为紫外扫描和SDS-PAGE法;经黄芩苷与牛血清白蛋白复合物对新西兰兔进行免疫产生抗血清,采取ELISA法进行检测。结果：经紫外扫描和SDS-PAGE法证实黄芩苷与牛血清白蛋白发生了交联,ELISA法在新西兰兔体内检测出黄芩苷与牛血清白蛋白复合物的抗血清,抗血清效价为1：8000。结论：经高碘酸钠法黄芩苷抗原合成成功,其为黄芩苷单克隆抗体的制备以及ELISA法快速检测黄芩苷提供了可靠的依据,值得关注。     

BN大鼠用于评价中药注射液速发型过敏反应模型的建立及适用性评价

以清开灵注射液、双黄连注射液、黄芩苷、绿原酸为受试样本,以豚鼠为对照,通过观察BN大鼠(brown norway rats)过敏反应的特异性来建立中药注射液速发型过敏反应的动物模型,并对两者在评价中药注射液过敏反应中的适用性进行比较.本研究以中药注射液为致敏原,直接对BN大鼠进行致敏和攻击后,通过观察过敏症状、过敏反应率、过敏反应程度、组胺释放量、靶器官病变率和病变程度的变化,来评价BN大鼠过敏反应动物模型.结果显示中药注射剂致敏后,BN大鼠出现明显的过敏症状、血清和组织中组胺含量明显增加,肺组织和气管出现明显的病理改变,同时以青霉素和天花粉蛋白为阳性对照,也出现速发型过敏反应的表现;BN大鼠的过敏反应发生率、过敏反应程度、靶器官病变率和病变程度均显著高于豚鼠.试验结果说明BN大鼠为评价中药注射液过敏反应的适宜动物模型,且其敏感性高于豚鼠.     

双黄连注射液中8种主要成分对RBL-2H3细胞的影响

目的以双黄连注射液为研究对象,探讨其中8种主要成分的致敏性。方法采用RBL-2H3细胞模型,分别用双黄连注射液、黄芩苷、黄芩素、连翘苷、连翘酯苷A、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸处理细胞,测定细胞脱颗粒率以及β-氨基己糖苷酶和5-羟色胺的释放率。结果双黄连注射液、绿原酸及隐绿原酸能直接引起RBL-2H3细胞脱颗粒,并能显著提高细胞内β-氨基己糖苷酶和5-羟色胺的释放,其他成分无显著的致敏性。结论双黄连注射液的致敏性可能是由绿原酸和隐绿原酸引起的。     

绿原酸和双黄连粉针剂致敏性比较评价

目的：比较评价绿原酸和双黄连粉针剂的潜在致敏性，并初步探索可疑致敏原绿原酸的致敏机制。方法：绿原酸与含等剂量绿原酸的双黄连粉针剂同时进行BN大鼠全身主动致敏实验（ASA），激发前取血测定抗体（IgE、IgG、IgA、IgM）、补体（C3、C4）、淋巴细胞免疫表型（CD3/4/8），记录激发后症状；单次静脉给予绿原酸与含等剂量绿原酸的双黄连粉针剂，测定给药前，给药后5、10、30、60、120、240min血浆中绿原酸浓度。结果：比较ASA激发后过敏反应发生率和发生程度，可知绿原酸过敏反应程度低于含等剂量绿原酸的双黄连粉针剂；绿原酸组和双黄连组抗体（IgE、IgG、IgA、IgM）、补体（C3、C4）各有不同程度升高，淋巴细胞免疫表型也有一定变化；单次静脉给药测定绿原酸血药浓度，给药后5、10、30、60min时，绿原酸组血浆中绿原酸浓度显著低于双黄连粉针剂组。结论：绿原酸对BN大鼠致敏性低于含等剂量绿原酸的双黄连粉针剂，原因可能是单体和复方绿原酸的代谢差异，也可能是因为绿原酸并非唯一致敏原。     

双黄连注射剂中连翘酯苷A致敏家兔后血清中特异性抗体的测定

目的 ELISA法检测双黄连注射剂中小分子半抗原物质连翘酯苷A致敏家兔血清中的特异性抗体效价。方法取新西兰种家兔,自耳中心动脉采血10 m L,制备致敏前血清。将连翘酯苷A与家兔血清体外孵育,制成连翘酯苷A-血浆蛋白完全抗原。将完全抗原皮下注射以免疫动物,1月内共5次。末次注射后7 d,麻醉动物,自腹主动脉取血,制备血清,即为连翘酯苷A-血浆蛋白全抗原的抗血清,用ELISA法检测抗血清的抗体效价(D值)。若1∶128稀释血清的D值大于致敏前血清D值的2倍,即可判定产生了外源性抗体。用间接竞争ELISA法测定家兔抗血清的特异性抗体,并绘制抑制曲线,以证明其抗体是由连翘酯苷A-血浆蛋白特应性产生的。由于药物引起过敏反应与产生Ig E型抗体有关,因此采用兔免疫球蛋白E(Ig E)ELISA试剂盒检测家兔抗血清中Ig E抗体的含有量。结果抗体效价测定结果表明,连翘酯苷A的抗体效价高于致敏前血清D值的两倍,说明连翘酯苷A有潜在的致敏性。间接竞争ELISA测定抗体特异性结果表明,连翘酯苷A免疫后的家兔抗血清中的抗体具有一定的特异性。Ig E型抗体浓度的测定结果表明,经过多次免疫后的家兔体内产生了外源性Ig E型抗体。结论连翘酯苷A在此实验条件下对家兔有致敏性。     

双黄连口服液中有效成分的大鼠在体肠吸收研究

目的:研究双黄连口服液中黄芩苷、绿原酸、连翘苷、连翘酯苷A 4种主要有效成分在大鼠肠吸收动力学特征,了解双黄连口服液中药物配伍对其主要有效成分吸收的影响.方法:运用在体肠循环模型,研究比较双黄连口服液与其4种有效成分在体肠循环过程中的浓度变化的差异.结果:黄芩苷、绿原酸、连翘苷、连翘酯苷A分别在40～160,6～24,3～12,2.6～10.4 mg·L-1吸收量与浓度呈线性关系,无高浓度饱和现象,吸收转化速率常数Ka,单位时间百分吸收转化率A基本保持不变;除黄芩苷、绿原酸、连翘酯苷A外,在pH 5.0～7.43,连翘苷的吸收不受pH影响;4种成分在各肠段的Ka,A均无明显差异.黄芩提取液中的黄芩苷、金银花提取液中的绿原酸、连翘提取液中的连翘苷的Ka,A与双黄连口服液中相应成分的Ka,A相比,无显著性差异;但连翘提取液中的连翘酯苷A的Ka,A显著大于双黄连口服液中相应成分的Ka,A.结论:双黄连口服液中黄芩苷、绿原酸、连翘苷、连翘酯苷A在大鼠小肠主要以被动扩散方式吸收,且无特殊的吸收窗;双黄连口服液组方配伍显著改变了连翘酯苷A的吸收.     

双黄连系列制剂制备工艺再评价

目的对双黄连系列制剂的制备工艺进行再评价。方法以黄芩苷转移率为指标,采用对比试验优选黄芩静置工艺和黄芩中间体制备工艺;以绿原酸、连翘苷转移率为指标,采用对比试验判定浸泡工艺对绿原酸,连翘苷转移率的影响,优选浓缩液的精制工艺,判定醇沉液浓缩工艺对绿原酸和连翘苷转移率的影响;以黄芩苷、绿原酸、连翘苷每日用量加权平均值为指标,对剂型进行评价。结果静置工艺对黄芩苷转移率无明显影响,黄芩苷中间体制备工艺对黄芩苷转移率有明显影响,浸泡工艺对绿原酸、连翘苷转移率无明显影响,浓缩液精制中醇沉次数对绿原酸、连翘苷转移率有明显影响,醇沉液浓缩工艺对成分转移率无明显影响。结论双黄连系列制剂制备工艺对指标成分转移率有显著影响。     

双黄连即型凝胶体外释药性研究

目的:研究双黄连即型凝胶的体外释放特性。方法:以0.05 mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH 7.4)为释放介质,以HPLC同时测定释放液中绿原酸、黄芩苷、连翘苷的含量,用franz扩散池法研究双黄连即型凝胶的体外释放特性。结果:双黄连即型凝胶中绿原酸、黄芩苷、连翘苷的释放曲线均符合Ritger-Peppas方程,但绿原酸的释放速率明显快于黄芩苷和连翘苷的释放。结论:双黄连即型凝胶释药机理为非Fick扩散。     

高效液相色谱法测定双黄连有效部位中绿原酸的含量

目的：建立双黄连有效部位中绿原酸含量的测定方法。方法：采用Venusil XBP C18（250.0 mm×4.6 mm,5μm）色谱柱,流动相为甲醇-0.05%磷酸水（2080）,流速：1.0 mL.min-1,检测波长：324 nm。结果：绿原酸平均回收率为99.19%,RSD=2.82%。结论：高效液相色谱法简便、准确,可作为有效部位的质量控制方法。     

HPLC法测定双黄连注射液中黄芩苷和连翘苷的含量

目的：建立测定双黄连注射液中黄芩苷和连翘苷含量的高效液相色谱法。方法采用高效液相色谱法,色谱柱为Waters Symmery C18（250mm×4．6mm,5μm）,流动相为乙腈—水（25．75）,流速为1．0ml／min,检测波长为227nm,柱温为30℃。结果：黄芩苷、连翘苷的线性范围分别为1．63～8．51;0．43—2．14,重复性试验的RSD为0．91％、1．59％（n=6）,平均回收率为92．56％、95．75％,RSD分别为0．82％、2．39％（n=6）。结论：本方法简便易行,结果准确,可用于双黄连注射液的质量控制。     

注射用双黄连粉针在大鼠体内的药代动力学分析

目的： 建立HPLC同时测定绿原酸、连翘酯苷A和黄芩苷的血药浓度,探析注射用双黄连粉针中3种成分在大鼠体内的药代动力学特征。方法： 采用HPLC同时测定绿原酸、连翘酯苷A和黄芩苷含量,以葛根素为内标,流动相乙腈（A）-0.1%磷酸（B）梯度洗脱（0~10 min,10%~20% A;10~35 min,20%~35% A;35~40 min,35% A;40~40.5 min,35%~10% A;40.5~55 min,10% A）,绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷和葛根素的检测波长分别为328,328,277,249 nm。结果： 绿原酸和连翘酯苷A在0.2~20 mg·L^-1、黄芩苷在2.0~300 mg·L^-1线性关系良好（r>0.999 4）;日内和日间精密度的RSD均<13.6%,低、中、高3个质量浓度样品的方法回收率在88.3%~109.3%,提取回收率均>80.8%。绿原酸、连翘酯苷A和黄芩苷的主要药动学参数AUC_0-t分别为（8.406±1.175）,（9.696±2.349）,（145.35±22.02） mg·h·L^-1;MRT_0-t依次为（0.619±0.105）,（0.634±0.115）,（0.456±0.068） h;t1/2 Z分别为（0.532±0.064）,（0.732±0.357）,（0.542±0.175） h;Vz分别为（0.384±0.050）,（0.673±0.422）,（0.324±0.072） L·kg^-1;CL_Z分别为（0.504±0.067）,（0.634±0.150）,（0.426±0.066） L·h^-1·kg^-1。结论： 该方法灵敏、简便、准确,适用于大鼠血浆中绿原酸、连翘酯苷A和黄芩苷的测定及注射用双黄连粉针的药代动力学研究。     

双黄连冻干粉透过妊娠大鼠胎盘屏障的药物成分研究

目的:对不同孕期妊娠大鼠给予双黄连冻干粉,采用高效液相色谱技术,研究双黄连冻干粉透过胎盘屏障的药物成分。方法:早、中、晚孕期W istar大鼠尾静脉注射双黄连冻干粉,给药5 d,末次给药后12 h,取血及胚胎组织,采用高效液相色谱技术,分析生物样品中所含药物成分。结果:早、中、晚孕期大鼠血浆中均含有黄芩苷、木犀草素、汉黄芩苷;各孕期胚胎组织中均含有黄芩苷,早期胚胎组织中还含有汉黄芩苷。结论:黄芩苷是双黄连冻干粉透过胎盘屏障的主要药物成分,对其胚胎毒性的研究将成为评价双黄连冻干粉妊娠期应用安全性的关键。     

双黄连制剂及其组分动物体内化学成分的研究

目的:比较研究大鼠灌胃双黄连粉针剂及各单味药提取物入血前后主要成分的变化,为优化双黄连粉针剂处方提供实验依据。方法:建立双黄连粉针剂、各单味药提取物及大鼠灌胃后血浆成分的HPLC指纹图谱,分析鉴定双黄连粉针剂及其提取物给药后不同时间入血成分、相对含量、来源及其代谢产物。结果:灌胃双黄连后8个主要成分入血,分别为黄芩苷及其3个代谢产物,绿原酸及其代谢产物和1个金银花中原型化学成分;随着给药时间的延长绿原酸和黄芩苷等原型成分的相对含量逐渐减少,而它们的代谢物逐渐增加;未发现有明显连翘成分入血。结论:入血成分及其代谢产物是双黄连粉针剂的体内药效物质基础,对其进行深入研究,将有助于双黄连粉针剂的处方优化及临床合理用药。     

双波长高效液相色谱法同时测定双黄连口服液中黄芩苷、绿原酸、连翘苷、连翘酯苷A的含量

目的:建立同时测定双黄连口服液中黄芩苷、绿原酸、连翘苷、连翘酯苷A 4种成分含量的高效液相色谱法。方法:采用Hedera ODS-2色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),柱温30℃,甲醇-0.2%磷酸溶液为流动相梯度洗脱,流速为1.0mL/min,检测波长为324、280nm。结果:黄芩苷、绿原酸、连翘苷、连翘酯苷A分别在28.53-285.25、4.86-48.60、2.05-20.50、2.01-20.10μg/mL范围内线性关系良好,相关系数分别为0.9998、0.9993、0.9993、0.9997,4种成分平均回收率均符合含量测定要求。结论:本法简单易行,可用于双黄连口服液的质量控制。     

HPLC波长转换法同时检测双黄连口服液中4种有效成分的含量

目的建立高效液相色谱波长转换法同时测定双黄连口服液中绿原酸、连翘苷、黄芩苷和汉黄芩素含量。方法采用Phenomenex C18柱(4.6 mm×150 mm,5μm);流动相A为甲醇,流动相B为乙腈,流动相C为0.1%磷酸水溶液;流速为1.0 mL/min;柱温为30℃;进样器温度为5℃;洗脱程序:0～8 min为B∶C=12∶88,9～19 min为A∶B∶C=35∶12∶53,20～27 min为A∶B∶C=35∶40∶25,28～35 min为B∶C=12∶18;检测波长程序:0～8 min为326 nm,9～19 min为226 nm、278 nm,20～27 min为278 nm。结果绿原酸、连翘苷、黄芩苷和汉黄芩素保留时间分别为6.33,15.48,16.69,24.04 min。以峰面积对进样质量线性回归,绿原酸、连翘苷、黄芩苷、汉黄芩素的回归方程分别为Y=41.647X-0.158(r=0.9999),Y=31.391X-0.164(r=0.9999),Y=55.847X+2.290(r=0.9996),Y=74.652X+0.045(r=0.9997),线性范围分别为0.06～0.48μg,0.02～0.45μg,0.375～4.500μg,0.002～0.090μg。绿原酸、连翘苷、黄芩苷和汉黄芩素回收率分别为95.90%、97.02%、95.16%、91.34%。结论本方法简便可行、准确快速,可用于双黄连口服液中4种主要有效成分的含量测定。