脂肪干细胞在骨、软骨组织工程中的研究进展

脂肪干细胞是一类可以自我更新、繁殖产生更多的干细胞,进而可以分化成许多有特定功能的细胞系,具有一般干细胞的特点,可作为多种组织工程的种子细胞.本文主要介绍脂肪干细胞的生物学特性以及在骨、软骨组织工程领域中的研究进展.     

间充质干细胞对糖尿病病变模型大鼠血视网膜屏障的影响研究

目的：通过临床观察,对来源于脂肪的间充质干细胞影响糖尿病视网膜病变情况进行分析,并评价其对模型大鼠血视网膜屏障的干预效果,同时进一步研究脂肪来源的间充质干细胞在视网膜中的分化情况.方法：利用STZ腹腔注射干预下诱导构建DR大鼠模型,采用尾静脉注射来源于脂肪的间充质干细胞从而实现对模型进一步的干预,安排专人负责监测血糖变化情况.使用伊凡斯蓝灌注法对模型大鼠血视网膜屏障功能进行评价,利用免疫荧光法详细观察来源于脂肪的间充质干细胞在视网膜中的分化情况.结果：实施干预措施之后,大鼠血糖数值出现明显降低,视网膜中的来源于脂肪的间充质干细胞可对视网膜光感受器细胞以及胶质细胞中的独特成分进行感应.结论：来源于脂肪的间充质干细胞能够在DR的视网膜中明显地对向光感受器以及胶质细胞方向进行分化,可以有效改善模型大鼠血视网膜屏障功能,对于修复模型大鼠血视网膜屏障损伤起着十分积极的作用.实施干预之后,糖尿病动物模型血糖水平出现明显下降.     

生长分化因子5基因转染大鼠脂肪干细胞在RAD16-Ⅱ自组装肽纳米凝胶中的培养

目的:将生长分化因子5(GDF-5)基因转染于大鼠脂肪干细胞并将其培养于RAD16-Ⅱ自组装肽纳米凝胶,并比较其与二维培养大鼠脂肪干细胞成软骨细胞分化效率。方法:选取雄性SD大鼠采用酶消化-密度梯度离心法提取脂肪干细胞行体外培养,并通过流式细胞术鉴定脂肪干细胞。采用LipofectamineTM2000进行脂质体pcDNA3.1(+)/GDF-5重组质粒瞬间转染大鼠脂肪干细胞。将转染大鼠脂肪干细胞分别置于三维RAD16-Ⅱ自组装肽纳米凝胶(实验组)及普通二维培养基培养(对照组)。通过RT-PCR、免疫组化及免疫荧光等方法检测培养1和2周后特异性细胞外基质Ⅱ型胶原蛋白(CollagenⅡ)和蛋白聚糖(Aggrecan)表达水平。结果:RT-PCR、免疫组化及免疫荧光检测结果表明RAD16-Ⅱ自组装肽纳米凝胶组细胞在诱导7d后有CollagenⅡ和Aggrecan表达,并且RT-PCR检测结果表明RAD16-Ⅱ自组装肽纳米凝胶组细胞的CollagenⅡ和Aggrecan mRNA表达水平较对照组高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:三维RAD16-Ⅱ自组装肽纳米凝胶有利于生长分化因子5转染脂肪干细胞Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖的表达,促进生长分化因子5转染脂肪干细胞向成软骨细胞方向分化,RAD16-Ⅱ自组装肽纳米凝胶是较好的软骨组织工程细胞支架。     

生肌玉红膏提取液促进脂肪干细胞增殖的实验研究

目的:探查生肌玉红膏提取液对脂肪干细胞的增殖作用与机制,为构建中医药组织工程血管化支架提供前期基础。方法:实验分为空白组:仅加入细胞培养液与CCK-8溶液,对照组:空白组基础上加入细胞密度为4×104/m L P3代的脂肪干细胞悬液0.2 m L,实验组:对照组基础上加入生肌玉红膏梯度浓度为0.012 5、0.025、0.05、0.1 mg/m L的生肌玉红膏提取液。表面抗原及脂滴油红O染色与细胞茜素红S染色鉴定脂肪干细胞;CCK法测定脂肪干细胞增殖状况;流式细胞仪测定脂肪干细胞增殖周期及蛋白质印迹法(Western blot)测定脂肪干细胞凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax及促血管生长因子VEGF的表达。结果:脂肪干细胞P3代细胞表面抗原CD34阴性,CD90阳性,油红O染色可见细胞中的脂滴且细胞茜素红S染色阳性;生肌玉红膏提取液浓度由低到高刺激脂肪干细胞增殖率逐渐增加,0.05 mg/m L时增殖达到高峰,明显高于对照组及浓度为0.012 5 mg/m L与0.025 mg/m L组(P<0.01)及对照组;浓度为0.05 mg/m L生肌玉红膏提取液在培养后24 h与48 h脂肪干细胞细胞周期更多位于DNA合成期与合成后期,比例分别达24%与28%,高于对照组8%左右(P<0.01)并显著促进抑制凋亡蛋白Bcl-2与凋亡蛋白Bax的比例与刺激VEGF表达。结论:生肌玉红膏具有促进脂肪干细胞增殖疗效且0.05 mg/m L生肌玉红膏提取液疗效较佳,其作用机制与抗脂肪干细胞凋亡相关。     

中药有效成分及单体干预脂肪干细胞向骨细胞诱导分化研究进展

脂肪来源干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)具有多个方向的分化潜能,逐渐成为干细胞领域的研究热点。众学者在特定的诱导条件下对各种中药有效成分干预脂肪来源干细胞向骨细胞分化的影响进行了探索,并取得一些进展。目前研究使用的诱导剂多为激素和细胞因子之类。中医药在治疗骨折方面具有较多的临床经验,疗效好且安全性高。然而目前关于中药在干预脂肪来源干细胞向骨细胞诱导分化方面的研究较少,对其进行总结,以供参考。     

补肾中药对老龄小鼠骨髓脂质过氧化与氧化应激损伤的影响

目的观察脂肪干细胞移植及补肾中药给药对老龄小鼠骨髓脂质过氧化与氧化应激损伤的改善作用。方法 6、10、15、19个月龄雌性C57BL/6 (B6)小鼠随机分为正常对照组、健骨二仙丸组、金匮肾气丸组、脂肪干细胞组。流式细胞仪鉴定脂肪干细胞表型,检测ROS水平及细胞凋亡率;ELISA法检测4-HNE水平。结果与正常对照组比较,健骨二仙丸组、金匮肾气丸组、脂肪干细胞组19个月龄小鼠抑制4-HNE、ROS水平(P<0. 05,P<0. 01)。与正常对照组比较,健骨二仙丸组、金匮肾气丸组、脂肪干细胞组不同月龄小鼠抑制骨髓细胞凋亡率(P<0. 05)。结论补肾中药可显著下调19个月龄小鼠4-HNE水平,并抑制ROS水平,从而控制骨髓细胞的凋亡。     

大鼠脂肪干细胞的分离培养鉴定及多向诱导分化研究

目的:通过体外分离培养脂肪干细胞,并进行传代、表型鉴定及多向诱导分化,进一步了解其生物学特性,为临床运用奠定实验基础。方法:取SD大鼠附睾近心端,肾周及腹股沟韧带皮下脂肪组织,采用密度梯度离心和贴壁培养相结合方法,对脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增、表型鉴定及成骨成脂诱导分化,在倒置显微镜下观察原代及传代细胞形态变化,并采用MTT法检测第3、5、7、9代细胞增殖能力,用流式细胞仪检测细胞表面抗原标记,取第3代细胞进行成骨成脂诱导分化,并采用茜素红染色、油红O染色方法进行鉴定。结果:采用密度梯度离心和贴壁培养相结合方法得到的脂肪干细胞,其细胞形态较为均一,基本呈长梭形,旋涡状生长,并形成集落样生长。MTT法检测第3、5、7、9代ADSCs呈典型的"S"形增殖曲线,符合干细胞的特性,脂肪干细胞表型鉴定结果显示CD29阳性高表达,CD34阴性表达,CD45低表达,CD105弱阳性表达,脂肪干细胞能向成骨细胞及脂肪细胞分化。结论:脂肪干细胞取材较方便,含量丰富、并能够在体外分离培养,其稳定表达特异性的表面抗原,并且经过相应诱导培养后可向成骨及成脂多向分化,可作为优良的骨组织工程的种子细胞来源。     

淫羊藿苷对与复合支架共培养脂肪干细胞成骨分化的影响

目的探讨淫羊藿苷对与复合支架共培养的脂肪干细胞成骨分化的影响。方法将透明质酸溶液、丝素蛋白溶液、壳聚糖溶液按照1∶2∶4的比例配置成混合液,应用3D打印机制作复合支架。将脂肪干细胞随机分为对照组、共培养组和淫羊藿苷组。对照组常规培养脂肪干细胞,共培养组加入复合支架和脂肪干细胞培养,淫羊藿苷组加入复合支架、脂肪干细胞及10μg/L淫羊藿苷培养。成骨诱导7 d后,MTT法检测各组细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,实时荧光定量PCR检测碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)、Runt相关转录因子2(RUNX2)和I型胶原(Col-I)表达水平。结果共培养组和淫羊藿苷组细胞相对存活率明显低于对照组(P均<0.05),但淫羊藿苷组明显高于共培养组(P>0.05);3组间细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05);共培养组和淫羊藿苷组ALP、BSP、RUNX2、Col-I表达水平均明显高于对照组(P均<0.05),淫羊藿苷组BSP、RUNX2表达水平均明显高于共培养组(P均<0.05)。结论淫羊藿苷能促进与复合支架共培养的脂肪干细胞的增殖和成骨分化。     

生肌玉红复合胶原改善脂肪干细胞功能的实验研究

目的:探索生肌玉红复合胶原改善脂肪干细胞功能及其作用机制。方法:首先,将生肌玉红膏提取液分0.0125 g·L~(-1)、0.025 g·L~(-1)、0.05 g·L~(-1)、0.1 g·L~(-1)各浓度,以细胞增殖实验筛选生肌玉红膏提取液促进脂肪干细胞增殖的最佳浓度;将筛选的最佳浓度生肌玉红膏提取液、胶原及最佳浓度生肌玉红膏提取液复合胶原,分别以transwell小室实验刺激脂肪干细胞迁移;增殖培养48 h后提取脂肪干细胞蛋白,以免疫蛋白印迹法(Western blot)测定各组细胞外调节蛋白激酶类(extracellular regulated protein kinases,ERK)蛋白表达,同时以酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞培养液中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)含量。结果:在给药培养后24 h、48 h及72 h后,0.05 g·L~(-1)生肌玉红膏提取液增殖效果最为明显,均优于各时间观测点其他浓度的生肌玉红膏提取液,培养48 h后,生肌玉红复合胶原组相对于对照组增殖了46%,显著高于生肌玉红膏提取液组27.4%及胶原组27.6%,差异有显著统计学意义(P0.05);提高脂肪干细胞迁移率约220%,显著高于生肌玉红膏提取液组140%及胶原组50%;提高脂肪干细胞外调节蛋白激酶(ERK)蛋白表达40%左右,显著高于生肌玉红膏提取液组15%及胶原组10%;同时刺激脂肪干细胞分泌VEGF达411.4 ng·L~(-1),显著高于生肌玉红膏提取液组207.5 ng·L~(-1)及胶原组240.8 ng·L~(-1)。结论:生肌玉红复合胶原可以通过MARK/ERK通路信号通路显著促进脂肪干细胞功能并刺激血管内皮生长因子分泌,与脂肪干细胞结合可进一步提升促血管新生功效。     

干细胞移植治疗股骨头坏死的研究进展

股骨头坏死的发病目前呈现出年轻化的趋势,包括干细胞移植在内的各种保髋疗法成为了研究的热点。骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞在股骨头坏死的治疗中应用最为广泛,常用的治疗方式包括经血管灌注、经皮置管灌注及髓芯减压灌注。干细胞移植主要是通过其旁分泌作用、增殖能力、分化能力,促进坏死区骨组织再生、血管再生,从而缓解髋关节症状、延缓股骨头坏死进程。对于干细胞移植治疗股骨头坏死作用机制、细胞种类、细胞浓度及疗程的研究,将有助于进一步提高该疗法的疗效和安全性。     

通络生骨胶囊对骨髓基质干细胞成骨和成脂肪双向分化的影响

目的:研究通络生骨胶囊对体外培养糖皮质激素诱导骨髓基质干细胞(MSCs)成骨和成脂肪双向分化的影响.方法:使用地塞米松浓度10-8M诱导MSCs成脂肪和成骨双向分化,以通络生骨胶囊治疗,采用逆转录聚合酶链反应法检测脂蛋白脂酶,骨桥蛋白基因的表达水平,观察MSCs成骨和成脂肪分化的改变.结果:地塞米松10-8M可诱导MSCs成骨和成脂肪双向分化;通络生骨胶囊具有明显的抑制成脂肪分化,促进成骨分化的作用.结论:通络生骨胶囊治疗激素性股骨头坏死药效机制,可能是通过对MSCs成脂肪和成骨分化调控的影响而产生作用.     

不同功效中药诱导间充质干细胞定向分化的研究概况

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有分化成间质起源的任意组织的潜能，包括向神经元样细胞、软骨、脂肪、造血基质及骨等分化成熟的特征。MSCs不仅存在于骨髓中，也可从脐血、外周血中以及脂肪组织、肌肉、胎儿器宫、大脑、牙齿中分离，也有人从脐带静脉内皮下层分离出MSCs。由于MSCs向神经细胞等多种细胞分化的特性及其特有的免疫调节特性，故而成为目前研究的热点，使其作为最佳种子细胞在组织工程中令人看好。人们把间充质干细胞可以跨系，     

补肾法诱导骨髓间充质干细胞定向成骨分化的研究进展

中医学认为:肾主骨,生髓。骨的生成,发育,强弱,盛衰均与肾有密切关系。众多研究表明补肾法能诱导骨髓间质干细胞定向成骨分化,骨髓间质干细胞是多能细胞,通过诱导可分化成为骨、软骨、脂肪、肌腱,这是用现代科学技术更完善地阐释补肾法的理论依据,对防治骨质疏松症,骨坏死,骨缺损等也有重大价值。     

大鼠脂肪源性干细胞分离培养及在尿道周围移植后的分布

目的:探索大鼠脂肪组织源性间充质干细胞的分离、体外培养方法,并采用阴部神经切断术的方法制作压力性尿失禁的大鼠模型,为其将来应用于大鼠压力性尿失禁治疗的动物试验研究提供实验依据.方法:无菌技术下获取SD大鼠双侧腹股沟区脂肪垫,消化离心,长期培养的方法获取脂肪源性间充质干细胞.倒置相差显微镜观察细胞形态变化,对培养细胞进行免疫细胞化学染色,鉴定其表面分子标志.结果:原代培养显示培养的脂肪源性间充质干细胞2d左右开始壁,10d-14d左右可达90%融合,基本上为梭形成纤维样细胞形态,免疫细胞化学示 CD29阳性,CD34阴性.阴部神经切断术后10天,除模型组和对照组一各有1只大鼠死亡外,均进行尿流动力学检测,三组手术前后ALLP分别为:对照组一为27.1±5.1和29.1±3.2cmH2O,对照二为29.5±4.9和27.4±72.3,模型组为24.8±3.8和14.7±3.0.模型组手术后ALLP明显降低,且组织学检查亦证明模型组大鼠尿道周围括约肌明显萎缩.结论:大鼠脂肪组织中含有大量间充质干细胞,细胞来源充足、取材容易、体外易于培养、细胞增殖数量大,是细胞移植理想的种子细胞.双侧PNT后大鼠控尿能力明显下降,可以作为SUI模型.本研究建立了获取大鼠脂肪组织源性间充质干细胞经及制作SUI大鼠模型的方法,为进一步实验研究提供了依据.     

电针联合脂肪源性干细胞移植对脑缺血/再灌注大鼠BDNF及其受体TrkB表达的影响

目的:探讨电针联合脂肪源性干细胞(ADSC)移植对大鼠缺血/再灌注损伤后海马区BDNF及其受体TrkB表达的影响。方法:成年大鼠随机分为模型组、电针组、ADSC移植组、电针+ADSC组。NSS法行神经功能损害评分,采用Western bolt法及实时荧光定量PCR检测海马区BDNF和TrkB表达。结果:电针+ADSC组海马区PKH-26标记的细胞个数高于ADSC组。与模型组比较,各治疗组NSS评分均显著降低,海马区BDNF和TrkB表达上调。其中电针+ADSC组NSS评分低于电针组和ADSC组,而BDNF和TrkB表达显著增加。结论:电针联合脂肪源性干细胞移植促进脑缺血再灌注大鼠神经功能恢复作用优于单独治疗组,其机制可能与电针上调海马区BDNF和TrkB的表达,改善干细胞生存内环境,促进移植的ADSC迁移和存活有关。     

成骨细胞分化与骨骼发育的转录因子Cbfα1/Runx2

成骨细胞是参与骨形成，骨骼生长和发育的一类重要细胞，它起源于多能间充质干细胞，是间充质干细胞在体内的各种调控因素的调节下发育而成。然而，间充质干细胞具有多向分化潜能，不同刺激条件下可向成骨细胞、破骨细胞、成脂肪细胞、成软骨细胞和成肌细胞分化。Cbfα1／Runx2是新发现的一类调控间充质干细胞向成骨方向分化的特异性转录因子，因此了解Cbfα1／Runx2调控间充质干细胞的作用机理，可以加深对骨骼发育分子机制的认识。本文就当前研究领域内Cbfα1／Runx2与骨骼发育关系的研究进展综述如下。     

葛根素抑制间充质干细胞成脂肪分化的作用及机制

目的:探讨葛根素对骨髓间充质干细胞(bone-marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)成脂肪分化的抑制作用与分子机制。方法:Percoll梯度密度离心法分离BMSCs;采用BMSCs特异性无血清培养基进行培养及传代;流式细胞术鉴定BMSCs表面特异性抗原表达;0.2μM和0.5μM葛根素分别联合成脂肪分化诱导培养基BMSCs向脂肪细胞分化;油红染液在第12天鉴定脂肪细胞形成情况;real-time PCR和western blot分别鉴定成脂肪分化相关因子PPAR-γ、CEBP-α及CEBP-β的表达;观察0.2μM和0.5μM葛根素对成脂肪分化相关Wnt信号通路的影响。结果:葛根素可显著抑制BMSCs向脂肪细胞分化,并呈浓度依赖性(P0.05),成脂肪诱导分化12天时,未加葛根素的BMSCs中PPAR-γ、CEBP-α及CEBP-β表达水平高于加葛根素组;葛根素组BMSCs胞内β-cateinin表达受到明显抑制。结论:葛根素可以明显抑制BMSCs向成脂肪细胞转化。     

论能量物质在人体内存储异常为太阴病的病理基础

在中医学领域内,阴阳平衡和气机运行是人体生理病理基础。结合现代医学,人体内的阴阳可以分别定义为人体内的能量代谢过程和干细胞分裂分化过程,二者间的相互作用推动人体内能量转化,即人体内的气机运行。人体内的干细胞分裂分化过程是人体阴分形成的生理基础,这一过程需要能量物质作为物质基础,即能量物质进入人体后以脂肪、多糖、蛋白质等形式进行储备,为干细胞分裂分化过程提供物质基础,推动干细胞通过分裂分化生成体细胞,实现组织器管内细胞更新,维持组织器官结构稳定。能量物质被人体吸收后在人体内存储的生理过程就是太阴经的生理学基础。这一过程出现异常后就形成太阴病,并成为太阴病提纲证的病理生理基础。太阴病的主要治疗原则在于行气化湿,芳香温化。     

人脐带间充质干细胞治疗膝关节骨性关节炎及与中医药的相关性探讨

人体的各种组织,包括骨髓、脂肪、滑膜、外周血和脐带均含有间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)。人类脐带间充质干细胞(Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,HUMSCs)属于MSCs的一种,具有自身的独特之处。MSCs功能十分强大,可以分化成脂肪细胞、肌肉细胞、神经细胞、骨细胞等多种组织细胞。MSCs不仅可以更新修复旧的人体细胞,治疗多种免疫性疾病,还擅长治疗骨骼和肌肉衰退型疾病。基于此,MSCs备受推崇。膝关节骨性关节炎(Knee Osteoarthritis,KOA)是一种以关节软骨退变为主的迁延性疾病,患者以中老年患者居多。现有疗法中无论是口服药还是注射药,疗效都不是十分理想。文章介绍MSCs用于临床的潜力、HUMSCs对关节软骨的作用机制,以及中医药与HUMSCs的相关性等,旨在为临床及科研诊疗KOA提供新思路。     

脂肪干细胞定向诱导分化为成骨细胞及其鉴定

目的:探讨将脂肪干细胞定向诱导分化为成骨细胞的方法并对所诱导细胞的成骨特性进行鉴定。方法:取行脂肪抽吸术患者的脂肪组织,I型胶原酶消化进行培养,贴壁细胞传代,取第2代细胞进行诱导,培养基中添加成骨诱导剂地塞米松(0.01μM)、β-磷酸甘油钠(10mM)、2-磷酸抗坏血酸(50μM)和1,25-(OH)2VitD3(10mM)。鉴定诱导细胞的成骨特性:碱性磷酸酶(AKP)定量检测,免疫荧光化学检测骨钙素(OCN)、骨桥素(OPN)、I型胶原表达,Alizarn Red染色检测钙结节形成,RT-PCR检测AKP和OPN表达。结果:第2代脂肪干细胞诱导后AKP表达自第3天起各个检测点(第3、7、14、21、28天)诱导组与对照组差异皆具有统计学意义(P<0.05),免疫荧光检测OCN、OPN及I型胶原表达阳性,Alizarn Red染色可见钙结节形成,RT-PCR检测诱导组AKP和OPN表达阳性。结论:人ADSCs能够向成骨细胞表型诱导分化。