参环毛蚓中溶栓活性蛋白酶的纯化和检测

参环毛蚓Pheretima aspergillum (E．Perrier)为《中华人民共和国药典》2000年版一部中收载的地龙药材来源之一。地龙始载于《神农本草经》，具有通络、利尿、清热、定惊、平喘之功，临床常用于高热神昏、惊厥抽搐、关节痹痛、半身不遂、高血压等。日本学者从赤子爱胜蚓中提取出类似尿激酶的物质，     

镉胁迫条件下对参环毛蚓体壁结构影响的研究

目的:研究不同浓度镉离子胁迫条件下对参环毛蚓体壁肌肉结构的影响,探索重金属镉在参环毛蚓体内的生物富集部位。方法:采用不同浓度镉离子胁迫参环毛蚓染毒,HE组织切片染色,光学显微镜下观察体壁肌肉结构的变化,以分析参环毛蚓富集重金属的方式。结果:内侧的斜纹肌损伤要明显比体壁外侧的环肌肉层要严重得多。结论:参环毛蚓体壁的损伤来源于其身体的内部,即对其构成损伤的物质来源于肠道的主动吸收,而不是通过其表皮的被动扩散吸收。     

参环毛蚓对重金属镉离子耐受能力的考察

目的考察参环毛蚓对重金属镉离子的耐受能力,为进一步探索参环毛蚓富集重金属机制提供实验依据。方法在菜园土壤基础上设置7个组别的不同浓度的重金属镉污染环境,观察人工饲养条件下参环毛蚓在不同浓度镉离子环境中的生存状态,并利用原子吸收分光光度法分别测定参环毛蚓不同部位的镉离子量。结果参环毛蚓在土壤镉离子量为40倍、50倍两组养殖7 d后死亡;30倍组在10 d以后也有两条死亡,其余各组生长情况良好;参环毛蚓体内镉离子浓度随土壤镉离子浓度递增而增加。参环毛蚓能够在土壤中镉离子浓度12 mg/kg以下生存良好,其体内脏器中镉浓度可高达70~90 mg/kg。该浓度是中国对外贸易经济合作部发布的《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》中镉限量指标的233~300倍。结论参环毛蚓对重金属镉离子的耐受能力极强,这可能是其药材重金属超标的重要原因之一。     

参环毛蚓对土壤含水量及pH值因子的选择研究

目的 考察参环毛蚓对土壤含水量、pH值二因子的选择性,建立其生活所需要的土壤含水量、pH值单因子数学模型.方法 在养殖槽内设置不同土壤含水量、pH值区域,由参环毛蚓选择适宜的生活区域.结果 参环毛蚓生活适宜的土壤含水量为18.2%～24.6%,pH值为3.7～5.5.结论 参环毛蚓选择在湿度适中,偏酸性的土壤中生活;高湿及较干燥,强酸性和碱性的土壤不适宜其生活.     

中药地龙中参环毛蚓环介导等温扩增快速检测方法

[目的]建立中药材地龙中参环毛蚓的环介导等温扩增(LAMP)检测技术,实现对参环毛蚓的快速检测。[方法]采集不同产地地龙,提取总DNA后将所提取的总DNA进行线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基(COI)基因片段扩增、测序、比对,判断各产地地龙物种。用设计的LAMP引物组进行地龙LAMP实验,反应结束后向扩增产物中加入核酸染料SYBR GreenⅠ,分别在自然光、紫外光下直接通过肉眼来观察颜色变化及利用琼脂糖凝胶电泳来检测其引物的特异性。[结果]利用新设计的LAMP引物对参环毛蚓实现了特异性扩增,且检出限达40 fg/μL,具有极高的灵敏度。[结论]利用LAMP技术可实现参环毛蚓的现场快速检测。     

通俗环毛蚓的化学成分研究

目的：对中药通俗环毛蚓的化学成分进行分离鉴定。方法：乙醇、乙醚等溶剂提取物，用红外光谱仪和气相色谱-质谱联用方法以及氨基酸分析仪等技术鉴定化合物。结果：在通俗环毛蚓中测定有琥珀酸、18种脂肪酸和20种游离氨基酸。结论：通俗环毛蚓中的脂肪酸可能是其活性成分之一；另外其总游离氨基酸含量较高（含量为8.629%）。     

参环毛蚓MT-2基因及启动子的克隆研究

目的揭示参环毛蚓MT-2基因的转录调控机制,为今后采用基因工程技术改良参环毛蚓重金属富集性状奠定基础。方法根据已知的MT-2c DNA序列,设计特异引物,通过PCR扩增参环毛蚓MT-2基因的编码区基因组序列,扩增产物经测序后自行比对分析。基于该序列设计3条特异引物,采用基因步移技术克隆其上游的启动子序列,同时运用Promoter Prediction在线软件分析预测其顺式元件。结果经PCR扩增、测序后获得2 826 bp MT-2基因编码区序列,将该序列与已知MT-2 c DNA序列(登录号为KC787373.1)进行比对,发现MT-2编码区由4个外显子和4个内含子组成。基因步移技术克隆得到1 534 bp的启动子序列,经Promoter Prediction在线软件分析,结果显示该序列不仅含有TATA-box、CAAT-box等核心启动子软件,还具有3个特异响应重金属参与调控MT-2表达的MRE元件。结论参环毛蚓的MT-2基因能被重金属诱导表达,MT-2基因转录水平的金属调控是通过MT-2基因启动子区的金属调控元件MRE来实现的。     

地龙的多重位点特异性PCR鉴别

目的:近年来,中药材地龙的商品价格不断上涨,市场的混伪品随之增加。其主要鉴别特征在药材中大部分丢失,难以区分。因此,急需建立一种准确、稳定的中药材地龙基原鉴别方法。方法:根据地龙及其混伪品的COI基因序列差异找到变异位点,从而设计参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓及栉盲环毛蚓的特异性鉴别引物,优化反应体系并进行耐受性和适用性的考察和验证。在此基础上将特异性引物组合,构建多重聚合酶链式反应(PCR)体系,从而建立了一种高效准确、操作简便、专属性强、重复性好的中药材地龙及其常见混伪品的多重位点PCR鉴别方法。结果:在该方法下广地龙基原参环毛蚓可得到366 bp片段,沪地龙基原通俗环毛蚓和威廉环毛蚓可得到487 bp片段,栉盲环毛蚓可得到475 bp片段,其他混伪品均无条带。将之组合形成的多重PCR可在一次鉴定操作中根据条带位置同时鉴别沪地龙和广地龙。结论:该文所建立的多重位点特异性PCR鉴别方法可准确鉴别中药材地龙真伪。     

参环毛蚓体内核苷磷酸化酶的活性测定及动力学分析

目的 建立参环毛蚓体内嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）的检测方法,以肌苷为底物,评价该酶的活性。方法 采用HPLC法,色谱条件：Ecosil C18-AQ柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）,流动相为10 mmol·L-1磷酸二氢铵缓冲液（pH4.5）和甲醇,梯度洗脱,流速为0.8 mL·min-1,柱温为室温,检测波长254 nm,用底物肌苷与组织粗蛋白提取液在室温孵育30 min,沸水煮5 min终止反应,12000 r·min-1离心10 min,取上清过滤后进行HPLC分析,以OriginPro 8.5软件作图,计算酶动力学参数。结果 酶反应中产物次黄嘌呤在0.5～40 μmol·L-1范围内呈良好的线性关系（r=0.9996）;精密度小于3.5 %,回收率大于80 %。PNP酶动力学参数：Vmax为0.015 nmol·min-1·mg-1,Km为19.8 μmol·L-1。结论 成功构建了参环毛蚓体内次黄嘌呤代谢酶活性测定相关的实验体系,该法所得数据稳定可靠,可准确反映关键酶活性的动态变化。     

地龙（参环毛蚓）配方颗粒的位点特异性PCR鉴别

目的 为保障临床用药的安全性和有效性，建立地龙（参环毛蚓）药材及其加工制品混伪、掺假特异性聚合酶链式反应（PCR）鉴定方法。方法 根据地龙氧化酶亚基1（COⅠ）基因序列筛选出地龙配方颗粒的稳定引物区间，并根据区间内筛选获得地龙的特异性单核苷酸多态性（SNP）位点，根据SNP位点设计地龙特异性鉴别引物dlshmy-F及dlshmy-R，分别采集地龙及其混伪品，建立地龙配方颗粒特异性PCR鉴别方法并优化PCR反应体系，对该方法进行耐受性和适用性考察。结果 退火温度为62 ℃，循环次数为36次，地龙及其配方颗粒经PCR反应及凝胶电泳后，可在约170 bp处观察到单一明亮的特异性鉴别条带，其他近源伪品如通俗环毛蚓、保宁腔蚓、栉盲环毛蚓等20种伪品及阴性对照均无条带。结论 该研究建立的特异性PCR鉴别方法可快速准确的鉴别出地龙药材、配方颗粒、冻干粉中的参环毛蚓源性成分，准确鉴定出全国广地龙中药材及饮片以及地龙的基原，也可为其他的中药配方颗粒质量标准研究提供了参考。     

一种新型蚯蚓纤溶酶的研究

采用加提取剂的匀浆、盐析、超滤及层析方法从一种环毛蚓中获得一种新型纤溶酶。此酶分子量为22000,为单链蛋白。它不仅有强烈的直接溶解血栓及人纤维蛋白活性,而且还有纤溶酶原激活作用;动物试验表明此酶的毒副作用很小。本方法获得的酶的活性、纯度及得率都很高。     

人工养殖参环毛蚓的试验研究

本试验按条重大小把参环毛蚓随机分组,在相同的生活条件下,进行了不同饲料配方、不同水质、不同饲养方式、不同季节、不同饲养密度的对比试验。     

通俗环毛蚓抗血栓活性蛋白成分的快速富集及活性考察

目的 以地龙品种中的通俗环毛蚓为研究对象,对其蛋白总提物进行纯化富集以获得抗血栓活性蛋白成分（PvQ）,对PvQ进行抗血栓活性研究,以期为地龙的抗血栓物质基础研究提供参考。方法 采用AKTA-Pure型蛋白纯化系统,以体外活性为导向,富集通俗环毛蚓PvQ;采用纤维蛋白平板法、纤维蛋白原-凝血酶时间法（Fibg-TT法）对PvQ的纤溶及抗凝活性进行测定;利用体外血栓溶解试验评价PvQ对体外血栓的溶解能力,同时,考察了不同温度及pH对PvQ活性的影响。结果 成功富集得到通俗环毛蚓PvQ,活性测定表明其具有显著的纤溶及抗凝活性。体外血栓试验结果显示,37 ℃孵育5 h后PvQ可水解超过80%的血栓块。此外,温度和pH对于PvQ活性影响显著,在≥60 ℃或酸性条件（pH<7）下PvQ活性显著降低或失活,而在≤50 ℃和碱性条件下PvQ活性则不受影响或受较少影响。结论 建立了可行的通俗环毛蚓PvQ制备方法,PvQ可同时作用于纤维蛋白和纤维蛋白原,从而发挥双重纤溶作用,表现出良好的纤溶及抗凝活性,为其用于治疗血栓性疾病提供了科学阐释,并可为地龙抗血栓蛋白类产品的开发提供参考。     

沪地龙的原动物鉴定

对“沪地龙”原动物的分类学鉴定结果表明,其来源于钜蚓科动物通俗环毛蚓Pheretimavulgaris、威廉环毛蚓P.guillelmi或栉盲环毛蚓P.pectinifera的干燥体。此项结果已被中国药典(1995年版)一部收载。     

中药材地龙

 《中药大辞典》将蚯蚓分为广地龙与土地龙两大类，其基原为巨蚓科参环毛蚓或正蚓科背暗异唇蚓等全体。但在医疗实践中，医家应用的种类很多，历代医著记载的“白颈蚯蚓”非指一种而是指 一类蚯蚓，现今药用的地龙种类更加广泛，本文对此略加概述。蚯蚓能传播寄生虫病，切勿生用蚯蚓。     

参环毛蚓脂类挥发性成分分析

为了分析参环毛蚓（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｍ）的脂类成分,我们采用不同溶剂索氏提取法,从该药材得到三种组分,用ＧＣ－ＭＳ法进行测定,确定了３６种化合物的结构。在这三种组分中,乙醚组分中的１１种成分均为脂为,不饱和脂肪酸的含量最高,占２７．７０％,如油酸、亚油酸、花生四烯酸和花生三烯酸。丙酮组分的脂类成分８种,占３５．７５％,不饱和脂肪酸只有亚油酸一种;乙醇组分的脂类成分１３种,占７     

斑点免疫印迹法快速测定地龙炮制品中蚓激酶及其水解产物

目的测定参环毛蚓、秉氏环毛蚓、日本杜拉蚓和天锡杜拉蚓炮制品中蚓激酶及其水解产物,建立斑点免疫印迹法评价相应生药材药效成分明确的中药炮制品质量新方法。方法以兔抗蚓激酶单抗为一抗,应用斑点免疫印迹法对地龙炮制品中蚓激酶及其水解产物作定性检测,杂交信号应用Quantity One软件作定量分析。结果现行中药材参环毛蚓与山东产地方品种:秉氏环毛蚓、日本杜拉蚓、天锡杜拉蚓炮制品中蚓激酶及其水解产物的质量分数分别为125.23、118.34、81.05、72.13μg/g。结论秉氏环毛蚓炮制品中蚓激酶及其水解产物与现行地龙炮制品参环毛蚓无显著差异,理论上可作为广地龙的替代品。斑点免疫印迹法简便快捷,结果准确,无需大型设备,可用于地龙与类似中药材炮制品的品质评价。     

通俗环毛蚓的化学成分研究

从通俗环毛蚓[Pheretimavulgaris（chen）]（沪地龙），中提取分离得到一白色结晶，经红外光谱鉴定为玻珀酸（Amberacid）；用气相色谱一质谱联用方法，分析鉴定了其中18种脂肪酸，且油酸，花生烯酸和花生四烯酸的含量较高；用氨基酸分析仪鉴定了其中的20种游离氨基酸，总游离氨基酸含量为8．629％。     

基于DNA测序技术的市售地龙类药材基原调查与考证研究

目的:进行地龙商品基原调查和本草考证,澄清商品地龙品种情况,提高中药质量。方法:通过随机采集安国、亳州等7大主流药材市场的地龙商品药材,进行DNA提取和COI片段PCR扩增与核酸测序,与建立的地龙参考核酸数据库进行比对;对主流本草进行调查和梳理。结果:我国商品地龙主要来源于34个物种,22%的基原物种为参环毛蚓(参状远盲蚓Amynthas aspergillum),22%为通俗环毛蚓(通俗腔蚓Metaphire vulgaris),稀见栉盲环毛蚓和威廉环毛蚓(1%),55%的市售地龙均非2015年版《中华人民共和国药典》规定基原,而以保宁腔蚓M.magna为主;各市场主流商品地龙品种具有很大区别,具有显著的地域性特征;本草考证结果表明,历代本草中地龙基原并非一种,而是以具有"白颈"特征的环毛类蚯蚓入药,且历代本草、标准中多有变迁。结论:应建立合理、有效的地龙基原与质量控制方法。     

正交试验法优选蚓激酶提取工艺研究

目的:优选蚓激酶提取工艺参数。方法:以赤子爱胜蚓为原料,通过正交试验法,以酶的活性为指标,考察缓冲液p H值、第一次盐析和第二次盐析的饱和度对提取效果的影响,得到蚓激酶粗品经凝胶层析、离子交换层析、透析、超滤等工序制备高活性蚓激酶。结果:在缓冲液p H7.5,第一次盐析硫酸胺饱和度为40%,二次饱和度为80%时,蚓激酶比活达3327 u/mg。结论:该提取工艺稳定性好,酶活性高。