半枝莲氯仿极性部位提取物促进人结肠癌细胞凋亡及其逆转耐药的机制研究

目的研究半枝莲氯仿极性部位提取物(ECSB)促进人结肠癌细胞的凋亡及其逆转HCT-8/5-FU细胞对5-FU耐药的机制。方法用ECSB干预结肠癌细胞株HCT-8,用Gexp技术检测其细胞凋亡相关基因的表达;用5-FU、ECSB联合5-FU干预耐药细胞株HCT-8/5-FU,检测其耐药相关基因的表达。结果在ECSB干预48 h后,能显著下调HCT-8的Bcl-2表达,并且升高Caspase 8的表达,但不影响Bax的表达;ECSB联合5-FU给药后,HCT-8/5-FU的LRP表达比5-FU给药显著下降。结论 ECSB通过上调Bax/Bcl-2和Caspase 8的表达促进HCT-8细胞的凋亡,下调LRP的表达增强HCT-8/5-FU对5-FU的敏感性。     

败酱草抑制大肠癌HCT-8/5-FU细胞耐药的作用研究

目的研究败酱草对大肠癌5-FU耐药细胞株(HCT-8/5-FU)耐药的影响。方法 HCT-8、HCT-8/5-FU细胞经不同浓度5-FU或败酱草干预后,采用倒置显微镜观察细胞密度,MTT法检测细胞活力,阿霉素染色检测和荧光倒置显微镜观察细胞外排功能情况。结果不同浓度的5-FU干预可显著抑制HCT-8生长,对HCT-8/5-FU细胞生长影响较小;败酱草干预显著抑制HCT-8/5-FU细胞的生长和活力,同时具有增加阿霉素在HCT-8/5-FU细胞中蓄积的作用。结论败酱草具有抑制大肠癌5-FU耐药的作用。     

白花蛇舌草对大肠癌耐药细胞microRNAs表达的影响

目的:探讨白花蛇舌草(Hedyotic Diffusa Wilid,HDW)对大肠癌5-FU耐药细胞miRNAs表达的调控作用,进一步揭示其逆转大肠癌多药耐药(Multidrug Resistance,MDR)作用机制。方法:通过体外培养HCT-8/5-FU细胞,经HDW处理,采用MTT检测细胞活力、倒置显微镜观察细胞形态、microRNA(miRNA)表达谱芯片分析、QPCR验证差异miRNA表达、GO及Pathway分析预测差异miRNA调控的信号通路。结果:HDW可显著抑制大肠癌HCT-8/5-FU耐药细胞的活力,降低细胞密度;HDW调控57个miRNA差异表达,其中上调23个,下调34个;QPCR验证HDW上调miR-92b-5p、miR-1247-3p、miR-4800-5p的表达,下调miR-4454、miR-4443、miR-483-5p的表达;信号通路预测显示HDW可调控PI3K/Akt、TGF-β/Smad、MAPK、P53、Wnt、JAK-STAT等多条与细胞耐药、迁移、侵袭、增殖、凋亡有关的信号通路。结论:HDW对大肠癌5-FU耐药细胞HCT-8/5-FU具有显著的抑制作用,通过调控miRNAs表达是其逆转大肠癌耐药的作用机制之一。     

片仔癀调控ABCC1抑制大肠癌HCT-8/5-FU细胞药物外排功能的作用机制研究

目的探讨片仔癀对大肠癌HCT-8/5-FU细胞对药物外排功能的影响,并探讨其机制。方法MTT法检测5-FU对HCT-8/5-FU细胞和HCT-8细胞活力的影响和片仔癀对HCT-8/5-FU细胞活力的影响;倒置显微镜观察片仔癀对HCT-8/5-FU细胞形态的影响;采用罗丹明染色通过流式细胞仪检测片仔癀对其在耐药细胞内蓄积的影响;RT-PCR检测ABC转运蛋白家族重要成员ABCC1的表达。结果 MTT检测结果显示不同浓度的5-FU干预可显著降低HCT-8细胞活力,呈现一定的剂量依赖和时间依赖,而对HCT-8/5-FU细胞活力未见影响。经片仔癀干预后,HCT-8/5-FU细胞活力也受到显著的抑制;形态学观察表明:随着药物浓度的升高,细胞数目逐渐减少,体积缩小,出现悬浮、脱落而死亡;罗丹明蓄积实验显示:片仔癀干预可显著增加其在细胞内的蓄积;RT-PCR实验表明:经片仔癀干预可显著下调HCT-8/5-FU细胞ABCC1在m RNA水平的表达。结论片仔癀可抑制HCT-8/5-FU细胞生长和药物外排功能,通过下调转运蛋白ABCC1的表达是其重要机制之一。     

肠胃清药物血清对人结肠癌细胞株HCT-8/V多药耐药的逆转作用及机制研究

目的:研究肠胃清方对大肠癌耐药细胞株HCT-8/V的逆转作用及其抑制P-gp表达的影响。方法:MTT法测定肠胃清对HCT-8/V细胞株的逆转作用,流式细胞术测定P糖蛋白(P-gp)的表达。结果:HCT-8/V细胞株对VCR、DDP、5-FU、MMC的耐药指数分别为18.6、22.3、4.3、3.7。经肠胃清方药物血清作用48h后,其对化疗的耐药性显著下降,对VCR、DDP的逆转指数分别为3.3和7.5,静息状态下HCT-8/V细胞的P-gp表达显著高于HCT-8(P<0.01),而经肠胃清药物血清作用后P-gp表达显著降低(P<0.01)。结论:肠胃清方可以逆转人大肠癌耐药细胞株HCT-8/V的多药耐药性,其机制可能与其下调P-gp的表达有关。     

白花蛇舌草提取物逆转结肠癌细胞5-Fu耐药的作用

目的 探讨白花蛇舌草提取物逆转结肠癌细胞5-Fu耐药的作用及其可能作用机制. 方法 白花蛇舌草提取物对结肠癌5-Fu耐药细胞HCT-8/5-Fu进行药物干预,用MTT法检测结肠癌5-Fu耐药细胞的活力;采用Transwell细胞迁移和细胞黏附实验,在倒置显微镜下观察药物对细胞迁移和黏附的影响;RT-PCR法检测耐药相关基因ABCG2的mRNA表达. 结果 白花蛇舌草提取物能显著抑制HCT-8/5-Fu细胞的活力及细胞迁移、黏附的作用,呈现明显的剂量和时间依赖;同时白花蛇舌草提取物能明显抑制ABCG2的mRNA表达. 结论 白花蛇舌草具有抗大肠癌5-Fu耐药的作用,下调耐药基因ABCG2的mRNA表达是白花蛇舌草逆转耐药的重要作用机制之一.     

白花蛇舌草对大肠癌耐药移植瘤细胞凋亡的影响

目的探讨白花蛇舌草(HDW)在体内诱导大肠癌HCT-8/5-Fu耐药细胞凋亡情况及其作用机制。方法构建大肠癌HCT-8/5-Fu耐药细胞皮下移植瘤动物模型,按照瘤体积大小随机将30只移植瘤小鼠分为对照组、5-Fu组、HDW组各10只,分别给予生理盐水0.1 mL/10 g、5-Fu 20 mg/kg、HDW 1 g/kg灌胃,其中对照组、HDW组每周灌胃6 d,5-Fu组连续灌胃3 d后停药1 d,均连续6周。测量并记录各组瘤体体积;采用TUNEL染色法观察大肠癌HCT-8/5-Fu耐药移植瘤细胞凋亡情况;采用RT-PCR和免疫组化法检测移植瘤组织中Bcl-2、Bax的mRNA和蛋白表达情况。结果与对照组比较,5-Fu对移植瘤的生长无明显影响(P>0.05),HDW治疗可显著抑制移植瘤的生长(P<0.05);5-Fu对HCT-8/5-Fu耐药细胞移植瘤的细胞凋亡及Bcl-2、Bax表达无明显影响(P均>0.05);HDW能诱导移植瘤组织中HCT-8/5-Fu细胞凋亡,显著下调Bcl-2的mRNA和蛋白表达和上调Bax的mRNA和蛋白表达(P均<0.05)。结论HDW可诱导大肠癌HCT-8/5-Fu耐药移植瘤细胞凋亡,抑制Bcl-2表达和促进Bax表达是其重要作用机制。     

半枝莲阻滞人结肠癌细胞周期的机制

目的研究半枝莲氯仿极性部位提取物(ECSB)阻滞人结肠癌细胞周期的机制。方法用ECSB干预结肠癌细胞株HCT-8、SW620,检测其细胞周期相关基因的表达。结果 ECSB干预SW620细胞后,其p16表达上升,PCNA表达下降;ECSB干预HCT-8细胞后,Cyclin D1、CDK2、CDK4表达下降。结论ECSB通过调控细胞周期相关基因的表达,抑制人结肠癌细胞的增殖。     

半枝莲对人结肠癌细胞SW620增殖和凋亡的影响

目的探索半枝莲对人结肠癌细胞株SW620增殖和凋亡的影响。方法用不同浓度(0、12.5、25、50、75μg/mL)的半枝莲氯仿极性部位提取物(ECSB)干预SW620细胞后,MTT法检测细胞活力,DAPI染色观察SW620细胞的凋亡,流式细胞术检测SW620细胞的周期,蛋白质印迹法(Western blot)检测SW620细胞中PCNA、Survivin的表达。结果ECSB显著抑制了SW620细胞的活力(P<0.01),并呈剂量性依赖;DAPI染色显示ECSB处理SW620细胞24 h后出现明显的细胞核固缩,核碎裂形成,提示ECSB促进SW620细胞的凋亡;流式细胞术检测结果显示在50μg/mL ECSB干预SW620细胞48 h后,S期明显增高,提示ECSB抑制SW620细胞的增殖;Western blot检测结果显示各浓度的ECSB均能显著抑制SW620细胞的PCNA表达,75μg/mL ECSB能显著抑制SW620细胞的Survivin表达。结论ECSB促进人结肠癌细胞株SW620的凋亡,抑制其增殖,其可能机制是通过下调PCNA、Survivin的表达。     

西黄丸逆转大肠癌细胞株多药耐药的体外研究

目的:研究西黄丸对结肠癌耐药细胞株HCT-116/L及HCT-8/V的体外逆转作用。方法:血清药理方法制备西黄丸含药血清。用细胞毒性试验CCK8法、Western Blotting,RT-PCR方法研究西黄丸含药血清对大肠癌耐药细胞株的逆转作用及可能的分子机制。结果:西黄丸含药血清联合不同浓度长春新碱(VCR)与奥沙利铂(L-OHP)处理48 h后,对HCT-8/V细胞和HCT-116/L细胞的逆转倍数分别为2.58和2.36;西黄丸含药血清处理HCT-8/V细胞和HCT-116/L细胞48 h后,PKCα、Nrf2、MRP1、MRP2、GSTp1基因及蛋白,除HCT8/V细胞株中MRP2基因(6倍7 d组)上调外,表达均下调,差异有统计学意义(P0.05)。结论:西黄丸含药血清可体外逆转结肠癌耐药细胞株HCT-8/V和HCT-116/L的耐药性,可能与下调耐药基因mRNA和蛋白的表达水平有关。     

半枝莲抑制大肠癌干细胞自我更新及成瘤能力

目的探讨半枝莲对大肠癌干细胞自我更新和成瘤能力的影响及其可能的调控机制。方法采用侧群细胞分选法从SW480人结肠癌细胞中分离大肠癌干细胞。利用克隆球实验检测不同浓度半枝莲(0、0.25、0.5、0.75 mg/mL)干预24 h对大肠癌干细胞体外自我更新能力的影响;加入不同浓度半枝莲(0、0.5 mg/mL)干预大肠癌干细胞24 h后,采用BALB/c裸鼠皮下移植瘤实验检测半枝莲对大肠癌干细胞体内成瘤能力的影响;采用Western blot实验检测不同浓度半枝莲(0、0.25、0.5、0.75 mg/mL)干预24 h对大肠癌干细胞自我更新和成瘤能力标志物Nanog、SOX2、OCT4及Akt信号通路中p-Akt、Akt蛋白表达的影响。结果半枝莲可显著抑制大肠癌干细胞的体外自我更新能力,可见克隆球数量明显减少(P<0.05);半枝莲可明显抑制大肠癌干细胞的体内成瘤能力,可见半枝莲组裸鼠的移植瘤质量明显减轻(P<0.05);半枝莲可显著下调大肠癌干细胞Nanog、SOX2、OCT4及p-Akt的蛋白表达(P<0.05)。结论半枝莲可抑制大肠癌干细胞的自我更新和成瘤能力,其作用机制可能是通过抑制Akt信号通路的活化。     

氨磺灵离体诱导半枝莲多倍体的研究

目的:获得半枝莲多倍体植株。方法:离体条件下应用氨磺灵对半枝莲茎段外植体进行了不同浓度和时间的处理。结果:获得了半枝莲变异株,与二倍体植株相比,变异植株形态特征变化明显,植株株型紧凑,叶片颜色深绿,叶型指数变小,茎段变粗,气孔、保卫细胞明显增大,保卫细胞叶绿体数明显增多,气孔密度明显减小。经染色体计数和流式细胞仪检测,获得的变异株为二倍体和四倍体的嵌合体。结论:该方法可以作为半枝莲多倍体的诱导方法。     

槲皮素对5-FU诱导的结直肠癌SW480细胞耐药及自噬调控机制研究

目的:探讨槲皮素(Que)调控5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导的结直肠癌SW480细胞耐药及自噬的作用及机制。方法:采用浓度递增诱导法建立5-FU耐药细胞株SW480/5-FU,MTT法设置Que高、中、低剂量组(10、20、40 μmol/L)和对照组。MTT法检测各组细胞的5-FU耐药性,TUNEL染色法检测细胞凋亡,免疫荧光检测细胞自噬活性,Western blot检测细胞p糖蛋白(Pgp)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)、三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2抗体(ABCG2)、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62、丝/苏氨酸激酶(AKT)、p-AKT、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和p-mTOR蛋白表达。结果:5-FU抑制SW480/5-FU细胞的半抑制浓度(IC₅₀)明显高于SW480细胞(P<0.05),耐药指数(RI)=13.74。与对照组相比,Que中、高剂量组5-FU抑制SW480/5-FU细胞的IC₅₀明显下降(P<0.05),耐药逆转倍数分别为2.27和4.03。与对照组相比,Que中、高剂量组细胞抑制率、凋亡率和自噬活性明显升高(均P<0.05),蛋白的表达均明显升高(均P<0.05),P-gp、MRP1、ABCG2、p62、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR蛋白表达明显下降(均P<0.05)。结论:Que可以以剂量依赖性的方式逆转SW480/5-FU细胞的5-FU耐药性,诱导细胞自噬,其作用机制可能与抑制AKT/mTOR的磷酸化有关。     

半枝莲抑制结肠癌细胞迁移和侵袭实验研究

目的:探讨半枝莲对结肠癌细胞迁移和侵袭的抑制作用及相关机制。方法:体外培养结肠癌SW620、CCL-228细胞系,用浓度为10 μmol/L半枝莲进行干预。将SW620、CCL-228细胞分为对照组(不做任何处理)、10 μmol/L半枝莲组、Rac1L61组(Rac1L61过表达质粒转染细胞)、联合组(Rac1L61过表达质粒转染细胞后加入10 μmol/L半枝莲)。实时细胞分析(RTCA)系统评估半枝莲对细胞的抑制作用,MTT法检测细胞活力,划痕实验检测细胞迁移,Transwell实验检测细胞侵袭,Western blotting法检测Rac1、p-PAK1、MMP2、MMP9蛋白表达水平。结果:10 μmol/L半枝莲组SW620、CCL-228细胞中Rac1、p-PAK1蛋白表达均低于对照组,差异有统计学意义(均P<0.05)。转染过表达Rac1质粒后,SW620、CCL-228细胞Rac1、p-PAK1蛋白表达均升高,而用10 μmol/L半枝莲干预可逆转这种效应。10 μmol/L半枝莲组SW620、CCL-228细胞侵袭和迁移能力均低于对照组,差异有统计学意义(均P<0.05)。转染过表达Rac1质粒后,SW620、CCL-228细胞侵袭和迁移明显增强,而用10 μmol/L半枝莲干预可逆转这种效应。10 μmol/L半枝莲组MMP2、MMP9蛋白表达低于对照组(均P<0.05)。转染过表达Rac1质粒后,SW620、CCL-228细胞MMP2、MMP9蛋白表达均升高,而用10 μmol/L半枝莲干预可逆转这种效应。结论:半枝莲通过调节Rac1/PAK1信号通路活性,减少MMP9、MMP2表达而降低结肠癌细胞迁移和侵袭能力。     

半枝莲醇提物抗肿瘤活性的研究

目的　研究中药半枝莲醇提物的抗肿瘤活性。方法　采用小鼠腋下接种肿瘤细胞法测定了半枝莲醇提物的抗肿瘤活性 ;采用MTT法测定了半枝莲醇提物对小鼠脾细胞的增殖活性。结果　半枝莲醇提物对移植性肿瘤 (肉瘤S180 和肝癌H2 2 )具有显著的抑制作用 ,而对小鼠脾细胞的增殖具有促进作用 ,并有较好的剂量依赖关系。结论　中药半枝莲有可能通过增强机体的免疫力来实现其抗肿瘤活性     

青蒿琥酯对人结肠癌细胞HCT-8细胞凋亡和细胞周期的影响

目的:研究青蒿琥酯对人结肠癌HCT-8细胞凋亡和细胞周期的影响.方法:实验分为10,20,30 μmol·L-1青蒿琥酯处理组,阴性对照组和空白对照组.采用透射电镜和流式细胞仪检测青蒿琥酯对HCT-8细胞的凋亡诱导效果;采用流式细胞仪分析青蒿琥酯对HCT-8细胞周期的影响;采用Western blot印迹法检测青蒿琥酯对细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达的影响.结果:经青蒿琥酯处理后,电镜下可见HCT-8细胞膜皱缩、染色质凝聚、核碎裂、凋亡小体形成.10,20,30 μmol·L-1青蒿琥酯处理组凋亡率分别为17.1％±3.8％,29.5％±5.1％,41.4％±5.8％,显著高于空白对照组5.1％±1.4％.P＜0.05.在20 μmol· L-1青蒿琥酯处理组,HCT-8细胞G0/G1期所占比例随着药物作用时间延长而增加,S期与G2/M期细胞所占比例则下降.10,20,30 μmol·L -1青蒿琥酯处理组Bax蛋白表达水平分别为0.20±0.03,0.40±0.05和0.50±0.08显著高于空白对照组(0.06 ±0.02),P＜0.05;Bcl-2蛋白表达水平未见明显变化,Bcl-2/Bax呈下降趋势.结论:青蒿琥酯可以抑制人结肠癌细胞HCT-8增殖,诱导细胞凋亡,其诱导凋亡作用机制可能与其阻滞结肠癌细胞周期和上调促癌基因Bax表达有关.     

理冲汤加减联合5-氟尿嘧啶对人肝癌细胞HepG2上皮间质转化的影响

目的:探讨理冲汤加减联合5-氟尿嘧啶(5-FU)对人肝癌细胞HepG2上皮间质转化(EMT)的影响。方法:采用噻唑蓝(MTT)比色法检测理冲汤加减及5-FU单独和联合使用对HepG2细胞生长影响;应用中效原理进行统计分析,确定联合用药时的药物效应-合用指数的关系,判定药物间的相互作用,确定后续实验给药浓度及时间;划痕实验检测理冲汤加减联合5-FU对HepG2细胞迁移能力的影响;细胞侵袭实验(transwell小室)检测理冲汤加减联合5-FU对HepG2细胞侵袭能力的影响;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测理冲汤加减联合5-FU作用HepG2细胞24 h后对EMT相关基因上皮型钙黏蛋白(E-cadherin),神经型钙黏蛋白(N-cadherin),锌指转录因子(Snail,Twist) mRNA表达;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测理冲汤加减联合5-FU作用HepG2细胞24 h后EMT相关蛋白E-cadherin,N-cadherin,Snail,波形蛋白(Vimentin)的表达。结果:MTT比色法结果显示,随着药物浓度增加,理冲汤加减,5-FU单药或联合用药对HepG2细胞生长的抑制效应也增加;应用中效原理进行统计分析显示,两药在低剂量合用24 h后对HepG2细胞可以产生较好的协同效应,故选用理冲汤加减,5-FU作用HepG2细胞24 h的25%抑制浓度(IC25)即800 mg·L-1理冲汤加减,3. 125 mg·L-15-FU;设空白组,5-FU组,理冲汤加减+5-FU组,理冲汤加减组进行后续实验;划痕和侵袭实验显示,理冲汤加减,5-FU单独及联合均能抑制HepG2细胞迁移侵袭能力(P 0. 05,P 0. 01),与5-FU组比较,理冲汤加减+5-FU组抑制能力更强(P 0. 05,P 0. 01)。与空白组比较,5-FU组,5-FU+理冲汤加减组E-cadherin mRNA表达上调,N-cadherin,Snail,Twist mRNA表达下调(P 0. 05,P 0. 01);与5-FU组比较,5-FU+理冲汤加减组E-cadherin mRNA表达上调,N-cadherin,Snail,Twist mRNA表达下调(P 0. 05,P 0. 01)。与空白组比较,5-FU组,5-FU+理冲汤加减组E-cadherin的表达上调,N-cadherin,Snail,Vimentin蛋白表达下调(P 0. 05,P 0. 01);与5-FU组比较,5-FU+理冲汤加减组E-cadherin的表达上调,N-cadherin,Snail,Vimentin蛋白表达下调(P 0. 05,P 0. 01)。结论:理冲汤加减方与5-FU在低剂量合用24 h后对HepG2细胞可以产生较好的协同效应,并且能明显抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力,上调肝癌细胞内EMT相关标志物E-cadherin的表达,下调N-cadherin,Snail,Vimentin,Twist的表达,据此推测,抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力及EMT相关mRNA的表达,从而增强化疗药物的疗效,可能是理冲汤加减方联合5-FU协同作用的机制之一。     

半枝莲化学成分及提取物抗肿瘤作用的研究现状

为了进一步开发半枝莲资源,提高半枝莲的医用价值和经济价值,对半枝莲的化学成分及提取物在抗肿瘤方面的药理作用做一综述。     

半枝莲的化学成分

目的：对黄芩属植物半枝莲Scutellaria barbataD．Don全草的抗肿瘤活性部位（三氯甲烷萃取物）的化学成分进行分离、鉴定。方法：采用反复硅胶、LH-20葡聚糖凝胶等柱色谱方法进行分离纯化，并通过理化常数测定与谱学分析鉴定其化学结构。结果：得到7个化合物，分别鉴定为木犀草素（1），柚皮素（2）、半枝莲酸（3），2，4-二羟基苯甲酸（4），香豆酸乙酯（5），β-谷甾醇（6），胡萝卜苷（7）。结论：化合物4、5为首次从半枝莲中分离得到。