补阳还五汤对LPS诱导巨噬细胞活化与自噬的影响

目的:探讨磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/m TOR)信号通路在补阳还五汤抗脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞活化与自噬中的作用。方法:细胞增殖毒性检测(CCK-8)法筛选诱导RAW264.7巨噬细胞活力值的最适LPS浓度。在最适LPS浓度下,利用PI3K阻断剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)(5 mmol·L~(-1)),Akt阻断剂MK2206(5μmol·L~(-1)),m TOR阻断剂Rapamycin(10μmol·L~(-1)),Beclin-1阻断剂Spautin-1(5μmol·L~(-1))及不同剂量的补阳还五汤含药血清(5%,10%,20%)处理RAW264.7巨噬细胞24 h后,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测RAW264.7巨噬细胞炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β),白细胞介素-6(IL-6),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度,蛋白免疫印迹法(Western blot)测定磷酸化(p-)PI3K,p-Akt,p-mTOR通路蛋白的表达及微管轻链蛋白3(LC3),泛素结合蛋白1(p62),Beclin-1的水平。自噬双标腺病毒转染检测RAW264.7细胞自噬流的变化。结果:CCK-8结果显示10 mg·L~(-1)LPS作用时,细胞活性显著增强。模型组IL-1β,IL-6,TNF-α浓度显著高于空白组(P0.01),与模型组比较,Rapamycin显著升高IL-6浓度,其他给药组均可降低IL-1β,IL-6,TNF-α的水平(P0.05,P0.01)。模型组p-Akt,p-PI3K,p-mTOR蛋白表达量明显低于空白组(P0.05),LC3,p62蛋白表达量显著高于空白组(P0.01),与模型组比较,Rapamycin显著降低p-Akt蛋白表达量,不影响p-mTOR表达,补阳还五汤各剂量组与其他各阻断剂组均可明显升高p-Akt,p-PI3K,p-mTOR蛋白表达量(P0.05,P0.01),降低LC3,p62蛋白表达量(P0.05,P0.01),各组Beclin-1蛋白表达量均无显著性差异。与空白组比较,模型组中有明显的自噬体斑点形成,自噬流顺畅;与模型组比较,补阳还五汤含药血清组,3-MA,Spautin-1组自噬斑点的形成明显减少或消失,MK2202,Rapamycin组自噬体斑点大小明显减小,但自噬活力仍较强。结论:补阳还五汤抗LPS诱导巨噬细胞活化与自噬与抑制巨噬细胞炎症反应,调控PI3K/Akt/m TOR信号通路,抑制自噬的过度发生有关。     

补肾抗衰片对动脉粥样硬化模型辅助性T淋巴细胞亚群的干预研究

目的研究补肾抗衰片对动脉粥样硬化模型兔辅助性T淋巴细胞亚群Th1、Th2、Th17的干预作用。方法雄性新西兰兔,适应性喂养1周后,随机分为空白对照组、模型组、补肾抗衰组、阿托伐他汀组,除正常对照组给予普通饲料外,其余各组采用高脂饲料喂养法复制动脉粥样硬化模型。于高脂喂养4周末,补肾抗衰组给予补肾抗衰片1g/kg,2次/日,阿托伐他汀组给予阿托伐他汀钙片5mg/kg,1次/日,正常对照组和模型组给予等量溶媒1次/日,连续干预8周后取材。采用全自动生化分析仪检测外周血TC、TG、LDL-C、HDL-C水平,HE染色观察主动脉病理形态学变化,Q-PCR法检测脾脏组织T-bet、GATA3、RORγt mRNA的表达;ELISA法检测血浆IFN-γ、IL-4、IL-17的水平。结果补肾抗衰片可以减轻动脉粥样硬化模型动物粥样硬化病变的程度,可以降低Th1、Th17转录因子T-bet、ROR-γt及下游效应因子IFN-γ、IL-17的表达,而对Th2表达无明显的调节作用。结论补肾抗衰片具有抗动脉粥样硬化的作用,其机制可能与其调节Th1、Th17的表达有关。     

基于血管平滑肌自噬探讨瓜蒌-薤白对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成的影响

目的:探究瓜蒌-薤白药对ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化(AS)主动脉斑块血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖及自噬水平的影响。方法:高脂饲料饲养ApoE^-/-小鼠40只复制AS动物模型,随机分为模型组、瓜蒌-薤白组、雷帕霉素组、阿伐托他汀组,以普通饮食C57BL/6J小鼠10只为正常组。正常组及模型组给予生理盐水灌胃,瓜蒌-薤白组、雷帕霉素组及阿伐托他汀组每日给予相应药物灌胃,共8周。实验结束后处死小鼠,酶标仪检测小鼠血清,总胆固醇(TC),甘油三酯(TG),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平;主动脉油红O染色观察并测量主动脉斑块面积占总面积之比。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测主动脉中膜VSMCs增殖相关蛋白增殖细胞核抗原(PCNA),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)水平。透射电镜观察VSMCs自噬小体并检测VSMCs自噬相关蛋白酵母ATG6同源物(Beclin-1),酶联相关轻链蛋白Ⅱ(LC3Ⅱ),p62蛋白表达。结果:与模型组比较,瓜蒌-薤白组可显著减少AS小鼠主动脉脂质积累及斑块面积,降低TC,TG,LDL-C水平(P<0.01),升高HDL-C(P<0.05)。瓜蒌-薤白显著降低主动脉VSMCs内增殖相关抗原PCNA及α-SMA水平(P<0.01),抑制VSMCs过度增殖;瓜蒌-薤白显著上调主动脉VSMCs内Beclin-1及LC3Ⅱ蛋白表达,降低p62积累(P<0.01),增加VSMCs自噬小体的表达,上调VSMCs自噬水平。结论:瓜蒌-薤白调节AS小鼠体内血脂水平,抑制主动脉VSMCs过度增殖抑制AS小鼠主动脉的斑块形成,其机制可能与其上调VSMCs自噬活性有关。     

肝豆扶木汤对CuCl2诱导的HepG2细胞氧化损伤的保护作用和机制

目的 基于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路探讨肝豆扶木汤（GDFMD）对氯化铜（CuCl₂）诱导的人肝癌细胞（HepG2）氧化损伤的保护作用。方法 HepG2细胞分为空白组，模型组，GDFMD组，PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235（10 nmol·L^-1）组，GDFMD+NVP-BEZ235（10 nmol·L^-1）组。采用200 μmol·L^-1 CuCl₂构建模型组铜负荷HepG2细胞，酶联免疫吸附测定法（ELISA）观察细胞超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量；免疫荧光观察细胞微管相关蛋白1轻链3（LC3）蛋白表达水平；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测细胞磷酸化PI3K（p-PI3K）/PI3K，磷酸化Akt（p-Akt）/Akt，磷酸化mTOR（p-mTOR）/mTOR，Beclin-1，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，p62表达；实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测细胞PI3K，Akt，mTOR，Beclin-1，LC3Ⅰ，LC3Ⅱ，p62 mRNA表达。结果 与空白组比较，模型组细胞SOD，GSH-Px活性下降，MDA含量显著升高（P<0.01）；与模型组比较，10% GDFMD含药血清组SOD，GSH-Px活性升高，MDA含量下降（P<0.05，P<0.01）；NVP-BEZ235组GSH-Px活性下降，MDA含量升高（P<0.05）。与空白组比较，模型组p-PI3K/PI3K，p-Akt/Akt，p-mTOR/mTOR，p62表达水平显著降低，Beclin-1，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，10% GDFMD组p-PI3K/PI3K，p-Akt/Akt，p-mTOR/mTOR，p62表达水平升高，Beclin-1，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平下降（P<0.05，P<0.01）；NVP-BEZ235组p-PI3K/PI3K，p-mTOR/mTOR表达水平下调，Beclin-1，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平升高（P<0.05，P<0.01）。与10% GDFMD组比较，10% GDFMD+NVP-BEZ235组p-Akt/Akt，p-mTOR/mTOR表达水平下降，Beclin-1，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平升高（P<0.05，P<0.01）。与空白组比较，模型组LC3Ⅱ蛋白表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，10% GDFMD组LC3Ⅱ蛋白表达降低，与10% GDFMD组比较，10% GDFMD+NVP-BEZ235组LC3Ⅱ蛋白表达升高。各组PI3K，Akt，mTOR mRNA相对表达量差异无统计学意义，与空白组比较，模型组p62 mRNA相对表达量显著降低，Beclin-1，LC3Ⅰ，LC3Ⅱ mRNA相对表达量显著升高（P<0.01）；与模型组比较，10% GDFMD组p62 mRNA相对表达量升高，Beclin-1，LC3Ⅰ，LC3Ⅱ mRNA表达水平下调（P<0.01）；NVP-BEZ235组Beclin-1 mRNA相对表达量升高（P<0.05）。与10% GDFMD组比较，10%GDFMD+NVP-BEZ235组Beclin-1，LC3Ⅱ mRNA相对表达量升高（P<0.01）。结论 GDFMD能抑制CuCl₂诱导的HepG2细胞过度自噬，减轻细胞氧化损伤，其机制可能与激活PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。     

荷丹片对动脉粥样硬化ApoE(-/-)小鼠血清IL-1β和TNF-α表达的影响

目的观察荷丹片对载脂蛋白E基因敲除[ApoE(-/-)]小鼠血清中白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响,探讨荷丹片防治动脉粥样硬化(AS)的可能机制。方法 48只8周龄ApoE(-/-)小鼠分为正常对照组(12只,给予普通饲料室温饲养),高脂饲料复合气候箱干预组(36只)。喂养12周后,成功复制ApoE(-/-)小鼠动脉粥样硬化秽浊痰阻证模型后,分为3组:模型组、荷丹片组、阿托伐他汀组。12周后处死各组小鼠,采集标本,HE染色光镜下观察主动脉病理学变化,并测定斑块面积(PA)与管腔面积(LA)之比;酶联免疫双抗夹心(ELISA)法检测血清中IL-1β和TNF-α含量。结果模型组主动脉PA/LA比值大于正常对照组(P0.01),荷丹片组、阿托伐他汀组PA/LA比值则小于模型组(均P0.01),荷丹片与阿托伐他汀组比较,差异无统计学意义(P0.05)。模型组血清中IL-1β和TNF-α表达水平均高于正常对照组(均P0.01),荷丹片组、阿托伐他汀组血清中IL-1β和TNF-α表达水平均低于模型组(均P0.01),荷丹片组与阿托伐他汀组比较,差异均无统计学意义(均P0.05)。结论荷丹片具有防治AS的作用,其机制可能与其降低炎症因子IL-1β和TNF-α的表达,抑制炎症反应有关。     

加味四妙勇安汤颗粒剂含药血清对兔肺泡巨噬细胞PI3K/Akt信号通路的影响

目的观察加味四妙勇安汤颗粒剂含药血清对CP-Rb001兔肺泡巨噬细胞PI3K/Akt信号通路的影响,探讨其治疗动脉粥样硬化的作用机制。方法采用高、中、低剂量加味四妙勇安汤颗粒剂溶于水灌胃干预日本大耳白兔,制备含药血清;经MTT法观察各浓度含药血清对细胞增殖的影响后,选择各剂量浓度为20%的含药血清干预体外培养的兔肺泡巨噬细胞,采用荧光定量PCR方法检测自噬相关基因Beclin-1、LC3 mRNA表达水平;Westernblot检测Beclin-1、LC3、Akt、p-Akt和mTOR、p-mTOR蛋白的表达变化。结果与正常对照组血清相比,在10%~40%的浓度范围内加味四妙佤勇安汤颗粒剂含药血清的OD值与正常对照组的OD值比较无明显差异(P>0.05);加味四妙勇安汤颗粒剂各剂量组含药血清Beclin-1、LC3mRNA及蛋白的表达均显著高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05),而p-Akt和p-mTOR蛋白的表达显著低于正常对照组(P<0.05),Akt及mTOR蛋白表达与正常对照组比较无明显差异(P>0.05)。结论加味四妙勇安汤颗粒剂含药血清具有抗动脉粥样硬化的作用,可能通过抑制PI3K/Akt信号通路的激活,诱导巨噬细胞的自噬活动,减少斑块内巨噬细胞的浸润,进而达到稳定动脉粥样硬化易损斑块的目的。     

基于miRNA126调控PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨肾衰泄浊汤干预慢性肾脏病合并动脉粥样硬化作用机制

目的 探讨微小核糖核酸126（miRNA126）调控磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在慢性肾脏病合并动脉粥样硬化（CKD AS）中的作用,以及肾衰泄浊汤干预5/6肾切除术联合高脂饲养的CKD AS大鼠的作用机制。方法 将60只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、氯沙坦组、肾衰泄浊汤低、中、高剂量组。通过5/6肾切除术联合高脂饲养10周建立大鼠CKD AS模型,肾衰泄浊汤低、中、高剂量组（6.0、12.0、24.0 g·kg^-1·d^-1）,氯沙坦组（20 mg·kg^-1·d^-1）剂量灌胃,进行相应的干预8周,然后处死大鼠,取材进行相应检测。全自动生化分析仪器检测大鼠肾功能和血脂：血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平;苏木素-伊红（HE）、马松（Masson）染色主动脉组织并在光学显微镜下进行病理学观察;通过透射电子显微镜观察自噬体和自噬溶酶体;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测大鼠miRNA126、PI3K、Akt、mTOR mRNA水平;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测大鼠磷酸化（p）-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、苄氯素-1（Beclin-1）、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ/Ⅰ（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）蛋白表达。结果 与假手术组比较,模型组大鼠血清SCr、BUN、TC、TG、LDL-C均显著升高（P<0.01）;与模型组比较,氯沙坦组与肾衰泄浊汤低、中、高剂量组大鼠SCr、BUN、TC、TG、LDL-C明显降低（P<0.05）;与假手术组比较,模型组大鼠内膜可见增厚斑块形成,单核巨噬细胞浸润,少量泡沫细胞,中膜平滑肌纤维排列紊乱,胶原纤维增多,氯沙坦组与肾衰泄浊汤各组较模型组病变减轻;与模型组比较,肾衰泄浊汤中、高剂量组中电镜的自噬小体及自噬溶酶体的数量增多;与假手术组比较,模型组大鼠主动脉组织miRNA126表达显著下降（P<0.01）,PI3K、Akt、mTOR mRNA表达显著升高（P<0.01）。与模型组比较,肾衰泄浊汤高、中、低剂量组及氯沙坦组大鼠主动脉组织miRNA126表达显著升高（P<0.01）,PI3K、Akt、mTOR mRNA表达显著降低（P<0.01）。与假手术组比较,模型组p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR蛋白表达显著升高（P<0.01）,Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白水平显著降低（P<0.01）。与模型组比较,氯沙坦组和肾衰泄浊汤低、中、高剂量组的p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR蛋白表达降低（P<0.05）,Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平升高（P<0.05）。结论 CKD AS大鼠主动脉组织miRNA126表达降低,激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制自噬通量;肾衰泄浊汤通过miRNA126调控PI3K/Akt/mTOR信号通路,恢复主动脉内皮细胞的自噬,保护CKD血管损伤,减少As斑块的形成,减缓心血管并发症的发展。     

丹红注射液对动脉粥样硬化小鼠主动脉自噬基因Atg13启动子区甲基化及PI3K/Akt/mTORC1信号通路的影响

目的观察丹红注射液对动脉粥样硬化(AS)小鼠自噬基因Atg13启动子区甲基化及自噬信号通路PI3K/Akt/mTORC1的影响,探讨其可能的作用机制。方法 40只8周龄雄性ApoE~(-/-)小鼠高脂饲料喂养6周,随机分为模型组、阳性对照组和丹红注射液低、高剂量组,每组10只,各给药组给予相应药物干预。6周后RT-PCR检测AS小鼠主动脉自噬基因Atg13、Atg3和Atg4a的mRNA表达;Westernblot检测AS小鼠主动脉Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、PI3K、Akt、p-Akt、mTORC1和p-mTORC1的蛋白表达;采用亚硫酸氢盐测序法检测AS小鼠主动脉自噬基因Atg13启动子区甲基化水平。结果与模型组比较,丹红注射液高、低剂量组小鼠主动脉Beclin1蛋白表达明显升高,丹红注射液低剂量组小鼠主动脉LC3Ⅱ/Ⅰ表达明显升高(P0.01),丹红注射液高、低剂量组小鼠主动脉Atg13、Atg3和Atg4a mRNA表达显著升高(P0.01),丹红注射液高、低剂量组小鼠主动脉自噬基因Atg13启动子区甲基化水平明显降低(P0.01),丹红注射液高、低剂量组小鼠主动脉p-Akt蛋白表达明显降低(P0.01),丹红注射液高剂量组小鼠主动脉p-mTORC1蛋白表达明显降低(P0.01)。结论丹红注射液防治AS的机制可能与降低模型小鼠主动脉Atg13启动子区甲基化水平、抑制PI3K/Akt/mTORC1信号通路和促进细胞自噬有关。     

阿托伐他汀对血管内皮细胞自噬作用中Beclin-1和Map11c3基因mRNA表达的影响

目的观察不同时相使用阿托伐他汀对血管内皮细胞自噬的影响，探讨其保护血管内皮细胞的可能机制。方法用Hanks’液替代培养基进行饥饿诱导血管内皮细胞发生自噬的方法。分别在诱导自噬前和诱导过程中，使细胞分别与含或不含阿托伐他汀的正常培养基或Hanks’液共孵育，RT—PCR技术检测组间Beclin-1和Map11c3两基因的表达。结果与空白对照组相比，诱导前和诱导中都应用阿托伐他汀组和仅在诱导中应用阿托伐他汀组的Beclin-1和Map11c3两基因mRNA表达均明显降低（P〈0．01）。诱导前应用阿托伐他汀组的表达低于对照组，但无统计学意义（P〉0．05）。诱导前和诱导中都应用阿托伐他汀组的表达低于仅在诱导中应用阿托伐他汀组，但无统计学意义（P〉0．05）。结论阿托伐他汀可以抑制血管内皮细胞自体吞噬，这一作用可能与阿托伐他汀改善血管内皮功能的机制有关。     

扶脾柔肝方含药血清对大鼠原代肝星状细胞上皮间质转化及自噬的影响

目的观察扶脾柔肝方(FRR)含药血清对大鼠原代肝星状细胞(PHSC)上皮间质转化及自噬的影响。方法体外培养大鼠原代肝星状细胞,设立空白对照组,模型组,FRR低、中、高剂量组(20、40、80 g·kg~(-1),10%含药血清),氯喹组(CQ,50μmol·L~(-1)),采用转化生长因子-β1(TGF-β1,10 ng·mL~(-1))刺激PHSC发生上皮间质转化,给予相应药物干预24 h。RFP-GFP-LC3斑点法观察HSC自噬;脂滴染色观察脂质变化情况;实时荧光定量PCR法和Western Blot检测各组细胞中Beclin-1、LC3-Ⅱ、E-cadherin、α-SMA mRNA和蛋白表达。结果与空白对照比较,模型组HSC自噬增强(P0.01),脂质减少(P0.01),Beclin-1、LC3-Ⅱ、α-SMA mRNA及蛋白表达水平明显升高(P0.01),E-cadherin降低(P0.01);与模型组比较,FRR中、高剂量组HSC自噬减弱(P0.01),脂质增加(P0.05,P0.01),Beclin-1、LC3-Ⅱ、α-SMA mRNA及蛋白表达水平明显降低(P0.01),E-cadherin升高(P0.01);与氯喹组比较,FRR大剂量组Beclin-1、LC3-Ⅱ、α-SMA mRNA及蛋白表达水平明显降低(P0.01),E-cadherin升高(P0.01)。结论 FRR药物血清可降低大鼠HSC自噬水平,增加细胞脂质,降低Beclin-1、LC3-Ⅱ、α-SMA mRNA及蛋白表达,升高E-cadherin表达,具有逆转HSC上皮间质转化与抑制细胞自噬的功效。     

化瘀通络汤对脑小血管病致认知功能障碍患者执行功能的影响

目的观察扶脾柔肝方(FRR)含药血清对大鼠原代肝星状细胞(PHSC)上皮间质转化及自噬的影响。方法体外培养大鼠原代肝星状细胞,设立空白对照组,模型组,FRR低、中、高剂量组(20、40、80 g·kg~(-1),10%含药血清),氯喹组(CQ,50μmol·L~(-1)),采用转化生长因子-β1(TGF-β1,10 ng·mL~(-1))刺激PHSC发生上皮间质转化,给予相应药物干预24 h。RFP-GFP-LC3斑点法观察HSC自噬;脂滴染色观察脂质变化情况;实时荧光定量PCR法和Western Blot检测各组细胞中Beclin-1、LC3-Ⅱ、E-cadherin、α-SMA mRNA和蛋白表达。结果与空白对照比较,模型组HSC自噬增强(P0.01),脂质减少(P0.01),Beclin-1、LC3-Ⅱ、α-SMA mRNA及蛋白表达水平明显升高(P0.01),E-cadherin降低(P0.01);与模型组比较,FRR中、高剂量组HSC自噬减弱(P0.01),脂质增加(P0.05,P0.01),Beclin-1、LC3-Ⅱ、α-SMA mRNA及蛋白表达水平明显降低(P0.01),E-cadherin升高(P0.01);与氯喹组比较,FRR大剂量组Beclin-1、LC3-Ⅱ、α-SMA mRNA及蛋白表达水平明显降低(P0.01),E-cadherin升高(P0.01)。结论 FRR药物血清可降低大鼠HSC自噬水平,增加细胞脂质,降低Beclin-1、LC3-Ⅱ、α-SMA mRNA及蛋白表达,升高E-cadherin表达,具有逆转HSC上皮间质转化与抑制细胞自噬的功效。     

丹参酮ⅡA注射液对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠皮质神经元自噬及Akt-mTOR通路的影响

目的观察丹参酮ⅡA注射液对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠皮质神经元自噬及Akt-mTOR通路影响并探讨其机制。方法 7日龄SD新生大鼠80只,随机平均分为5组,分别为假手术组、模型组及经丹参酮ⅡA处理的高剂量组(0.1 mg/g)、中剂量组(0.05 mg/g)、低剂量组(0.02 mg/g)。Rice法造模,透射电镜观察新生大鼠大脑皮质神经元变化情况,TTC染色检测脑梗死情况,蛋白免疫印迹检测脑组织LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-Akt、p-mTOR、p-S6蛋白表达情况。结果假手术组神经元结构正常,模型组中观察到皮质神经元中存在大量的自噬体和自噬溶酶体,其中泡状自噬体中包裹有可见的细胞质结构。相较于模型组,高剂量组、中剂量组、低剂量组中自噬体数量明显减少,且呈一定的剂量依赖性(P 0.05)。与假手术组相比,模型组中幼鼠脑梗死面积显著增加(P 0.05)。与模型组相比,高剂量组、中剂量组、低剂量组中脑梗死面积显著减小,且呈一定的剂量依赖性(P 0.05)。与假手术组相比,模型组中LC3-Ⅰ/(LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ)的比值与Beclin-1蛋白表达水平显著增高(P 0.05)。与模型组相比,高剂量组、中剂量组、低剂量组中LC3-Ⅰ/(LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ)的比值与Beclin-1蛋白表达水平显著降低,且呈剂量依赖性(P 0.05)。与假手术组相比,模型组中pAkt、p-mTOR、p-S6蛋白表达水平均显著降低(P 0.05)。与模型组相比,高剂量组、中剂量组、低剂量组中pAkt、p-mTOR、p-S6蛋白表达水平均显著增加,且呈剂量依赖性(P 0.05)。结论丹参酮ⅡA对新生大鼠缺血缺氧性脑损伤大脑皮质神经元自噬具有显著的抑制作用,推测其机制可能为通过激活Akt-mTOR信号转导通路实现的。     

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路的三七总皂苷调控自噬抗H9c2细胞缺氧/复氧损伤机制研究

目的探讨三七总皂苷(PNS)能否通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控自噬从而减轻H9c2细胞缺氧/复氧损伤机制。方法将H9c2细胞分为正常组、缺氧/复氧(A/R)组、A/R+PNS组、A/R+PNS+雷帕霉素(Rapa)组、A/R+Rapa组、A/R+羟氯喹(HCQ)组、A/R+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组。通过缺氧6 h、复氧2 h建立H9c2细胞A/R模型。CCK-8法检测细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒检测细胞损伤,Western blot检测自噬相关蛋白Atg5、p62、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白PI3K、Akt、m TOR的表达,荧光法观察细胞自噬流。结果与正常组比较,A/R组H9c2细胞存活率明显下降,细胞损伤率明显升高(P0.05),自噬相关蛋白Atg5、Beclin-1表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显升高(P0.05),自噬体和自噬溶酶体数量显著增加,自噬流显著增强(P0.05);与A/R组比较,用PNS预处理后,H9c2细胞存活率明显上升,细胞损伤率明显降低(P0.05),自噬相关蛋白Atg5、Beclin-1表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显降低(P0.05),p62蛋白表达明显升高,与自噬抑制剂HCQ、3-MA作用相似,荧光结果显示,PNS对自噬流有明显抑制作用(P0.05);PNS预处理后p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达明显升高(P0.05)。结论 PNS能有效减轻H9c2细胞A/R损伤,其机制与激活PI3K/Akt/mTOR信号通路从而抑制自噬流相关。     

半枝莲总黄酮通过PI3K/AKT/mTOR通路诱导肿瘤细胞自噬的体内实验研究

该研究拟从体内角度研究半枝莲总黄酮(TF-SB)的抗肿瘤作用,并探讨TF-SB对肿瘤细胞自噬的影响及其对PI3K/AKT/mTOR通路的调控作用,为TF-SB的抗肿瘤作用提供实验依据。实验以黑色素瘤荷瘤小鼠模型为研究对象,分为空白对照组、雷帕霉素组(Rap,1.5 mg·kg~(-1))、TF-SB高、中、低剂量组(200,100,50 mg·kg~(-1)),每天给药1次,连续用药11 d,通过测量肿瘤的体积及抑瘤率,来观察TF-SB对黑色素瘤生长的抑制效果;通过TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况,来进一步验证TF-SB的抗肿瘤活性;通过Western blot法检测LC3-Ⅰ,LC3-Ⅱ的蛋白表达,计算LC3-Ⅱ对LC3-Ⅰ的相对表达量,探讨TF-SB对肿瘤细胞自噬的诱导作用;通过检测PI3K/AKT/mTOR通路标志蛋白的磷酸化水平,研究TF-SB诱导细胞自噬的分子机制。结果表明,TF-SB可有效抑制荷瘤小鼠体内黑色素瘤的生长,减小肿瘤体积、提高抑瘤率,并且可以显著增加肿瘤细胞凋亡指数,增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ,抑制p-PI3K,p-AKT及p-mTOR的蛋白表达水平,与对照组比较有显著性差异(P0.05,P0.01或P0.001)。由此可见,半枝莲总黄酮具有抑制体内黑色素瘤生长的作用,其机制可能与通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路,诱导肿瘤细胞自噬及凋亡有关。     

通心络对高脂血症兔血管内皮功能的保护作用及机制研究

目的探讨通心络对高脂血症兔血管内皮功能的影响。方法将48只新西兰兔随机分为对照组、模型组、通心络低、中、高剂量组和阿托伐他汀组,每组8只。对照组给予普通饲料,模型组及药物干预组给予高脂饮食建立高脂血症模型。造模同时分别给予各药物干预组通心络胶囊0.15、0.3、0.6 g/kg,阿托伐他汀2.5mg/kg灌胃,每日1次,连续4周。生化法检测各组血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C)水平变化,ELISA法和硝酸还原酶法检测血清内皮素-1(ET-1)和一氧化氮(NO)水平,HE染色观察动脉形态学变化,离体血管环检测主动脉内皮舒张功能,采用蛋白免疫印记(Western blot)检测动脉PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达。结果与对照组比较,模型组血清TC、TG、HDL-C、LDL-C和ET-1水平升高(P0.01),NO水平及主动脉舒张率下降(P0.01),颈动脉组织PI3K、p-AKT蛋白表达量下调(P0.01);与模型组比较,通心络高剂量组和阿托伐他汀组血清TC、TG、LDL-C水平降低,通心络中剂量组血清TG、LDL-C水平降低(P0.05,P0.01);通心络高、中剂量组和阿托伐他汀组血清ET-1水平下降,NO水平及主动脉舒张率升高(P0.05,P0.01),颈动脉组织PI3K、p-AKT蛋白表达量上调(P0.05,P0.01)。结论通心络能够改善高脂血症兔的血管内皮依赖性舒张功能,具体机制与其激活PI3 K/AKT信号转导通路相关。     

桂枝茯苓丸调节PI3K/Akt/mTOR通路对PCOS-IR大鼠排卵障碍的影响

目的:探讨桂枝茯苓丸对来曲唑联合高脂乳剂导致的多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗(PCOS-IR)大鼠排卵障碍的影响。方法:将72只雌性SD大鼠随机分为空白组、模型组、二甲双胍组和桂枝茯苓丸低、中、高剂量组,每组12只。除空白组外,其余大鼠每日予来曲唑0.001 g·kg^-1结合高脂乳剂15 mL·kg^-1连续灌胃30 d建立PCOS-IR大鼠模型。桂枝茯苓丸低、中、高剂量组每日分别灌服桂枝茯苓丸混悬液0.31,0.62,1.24 g·kg^-1,二甲双胍组每日灌服二甲双胍混悬液0.27 g·kg^-1,空白组和模型组每日灌服12 mL·kg^-1生理盐水,共干预30 d。苏木素-伊红(HE)染色观察卵巢组织病理形态学变化;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清促卵泡生成素(FSH),促黄体生成素(LH),睾酮(T),空腹胰岛素(FINS)水平,计算LH/FSH,胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)值;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠卵巢组织中磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路相关分子及自噬关键分子酵母Atg6同系物(Beclin-1),自噬相关基因5(Atg5),微管相关蛋白轻链3(LC3)Ⅱ蛋白表达水平;免疫组化(IHC)检测Beclin-1,LC3Ⅱ蛋白表达。结果:与空白组比较,模型组大鼠卵巢中各级卵泡、卵泡颗粒细胞层厚度也减少,黄体数量明显减少,而卵巢白膜厚度增加,闭锁卵泡及囊状扩张卵泡数量明显增多;血清T,LH,LH/FSH,FINS,HOMA-IR显著升高(P<0.01);卵巢组织中磷酸化(p)-PI3K,p-Akt,p-mTOR蛋白表达均明显降低(P<0.05,P<0.01);自噬相关蛋白LC3Ⅱ与Beclin-1的相对表达量明显升高(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,桂枝茯苓丸低、中、高剂量组及二甲双胍组囊状扩张卵泡数、闭锁卵泡数减少,卵泡颗粒细胞层厚度增加,可见到各级卵泡分布及较多黄体;桂枝茯苓丸低、中、高剂量组血清T,LH,LH/FSH,FINS,HOMA-IR明显降低(P<0.05,P<0.01),二甲双胍组血清FINS,HOMA-IR显著降低(P<0.01);各给药组p-PI3K,p-Akt,p-mTOR蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01);桂枝茯苓丸中、高剂量组LC3Ⅱ,Atg5与Beclin-1蛋白表达量显著降低(P<0.01)。结论:桂枝茯苓丸可激活颗粒细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路,抑制颗粒细胞过度自噬,改善卵巢功能及胰岛素抵抗,恢复排卵,并且以高剂量效果更佳。     

基于PI3K/AKT/mTOR通路研究杜仲总黄酮对多囊卵巢综合征大鼠性激素水平及卵巢组织自噬的影响

目的:探讨杜仲总黄酮基于磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠性激素水平及卵巢组织自噬的影响。方法:55只SD大鼠随机取10只作为正常对照组,其余建立PCOS大鼠模型,40只大鼠建模成功,随机分为模型对照组、PI3K抑制剂BKM120 40 mg/kg组、BKM120 40 mg/kg+杜仲总黄酮200 mg/kg组、杜仲总黄酮200 mg/kg组,各组灌胃生理盐水或相应药物,连续干预3 w。Elisa法检测血清促黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、抗苗勒氏管激素(AMH)水平;HE染色观察卵巢病理学变化;流式细胞术检测卵巢组织颗粒细胞自噬率;Western blot检测卵巢组织中PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白及微管相关蛋白1轻链3 II(LC3 II)表达。结果:与正常对照组比较,模型对照组大鼠AMH、LH、T含量显著升高,FSH含量显著降低P<0.01);大鼠卵巢组织颗粒细胞自噬率显著升高(P<0.01),p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值显著降低,LC3 II/LC3 I比值显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,抑制剂组大鼠AMH、LH、T含量显著升高,FSH含量显著降低(P<0.01),卵巢组织颗粒细胞自噬率显著升高,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值显著降低,LC3 II/LC3 I比值显著升高(P<0.01);杜仲总黄酮+抑制剂组、杜仲总黄酮组大鼠AMH、LH、T含量明显降低,FSH含量明显升高(P<0.05或P<0.01),卵巢组织颗粒细胞自噬率显著降低(P<0.01),p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值显著升高,LC3 II/LC3 I比值显著降低(P<0.01)。模型对照组卵巢表面苍白,黄体减少,出现多个囊状扩张卵泡;杜仲总黄酮+抑制剂组、杜仲总黄酮组卵巢体积减小,表面色泽较红,黄体有所增加,囊状扩张卵泡减少;抑制剂组卵巢体积更大、黄体更少,囊状扩张卵泡更多。结论:杜仲总黄酮可能通过激活PI3K/AKT/mTOR通路降低PCOS大鼠卵巢组织自噬水平,改善其性激素水平。     

丹蛭降糖胶囊通过mTOR/S6K1信号通路对糖尿病肾病大鼠的干预作用研究

目的研究丹蛭降糖胶囊对糖尿病肾病大鼠的肾脏病理改变和足细胞自噬水平的影响,初步探讨其相应的作用机制。方法选取GK大鼠40只,采用醋酸脱氧皮质酮-盐皮下注射联合高脂饲料喂养诱导糖尿病肾病模型。造模成功后随机分为模型组、丹蛭降糖胶囊低剂量组[0.54 g/(kg·d)]、高剂量组[1.08 g/(kg·d)]、缬沙坦组[10 mg/(kg·d)],每组10只。另选取10只同周龄正常Wistar大鼠作为正常组。模型组和正常组给予等容积生理盐水。连续灌胃10周后检测空腹血糖(FBG)、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)和尿微量蛋白(U-mAlb)。Western Blot检测肾小球p-mTOR、p-S6K1、Beclin-1、LC3和Nephrin蛋白的表达,HE染色和PAS染色后于光镜下观察肾脏病理变化,电镜下观察各组亚细胞形态结构变化。结果与正常组比较,模型组FBG、SCr、BUN、U-mAlb水平升高(P<0.01);与模型组比较,丹蛭降糖胶囊低、高剂量组和缬沙坦组U-mAlb水平降低(P<0.01)。模型组可见肾小球基底膜增厚,系膜基质沉积,足细胞损伤,各用药组均有不同程度改善,丹蛭降糖胶囊高剂量组足细胞内有较多自噬体形成。与正常组比较,模型组p-mTOR、p-S6K1的表达增高,Nephrin、Beclin-1和LC3的表达水平降低(P<0.01);与模型组比较,各用药组p-mTOR、p-S6K1的表达下降,Nephrin、Beclin-1和LC3的表达增高(P<0.01)。丹蛭降糖胶囊高剂量组和缬沙坦组Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平较丹蛭降糖胶囊低剂量组升高(P<0.05)。结论丹蛭降糖胶囊具有减轻糖尿病肾病大鼠U-mAIb、足细胞损伤及相关肾脏病理改变的作用,其机制可能与抑制mTOR/S6K1信号通路进而提高足细胞的自噬活性有关。     

黄芪多糖抑制缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞凋亡与自噬机制研究

目的:探讨黄芪多糖(APS)对缺氧/复氧(H/R)所致乳鼠心肌细胞凋亡与自噬抑制作用的相关机制。方法:分离并体外培养乳鼠心肌细胞3 d后制备H/R损伤细胞模型,设正常对照组、H/R组、APS低、中、高剂量(20、40、80 μmol/ml)组,各组于造模前30 min给药处理。复氧2 h后,CCK-8法检测细胞增殖抑制率,Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡水平,Western blot法检测p-Akt、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax、p-mTOR、Beclin1、LC3、P62蛋白表达。结果:与H/R组比较,APS中、高剂量细胞增殖抑制率和凋亡率显著降低(P<0.01),p-Akt、p-mTOR、Bcl-2表达量显著升高而Cleaved Caspase-3、Bax、Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62表达量显著降低(P<0.05),Bcl-2/Bax比值显著升高、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低(P<0.01)。结论:APS可能通过激活Akt/mTOR通路调控凋亡和自噬相关蛋白表达,对H/R所致乳鼠心肌细胞凋亡与自噬起到抑制作用。     

护心方含药血清对THP-1源性泡沫细胞自噬相关蛋白的影响

目的探讨护心方抗动脉粥样硬化的可能作用机制。方法用160 nmol/L佛波醇酯类多克隆刺激剂孵育THP-1细胞24 h后诱导分化成巨噬细胞,加入50 mg/L氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)培养48 h,使其转化为泡沫细胞。以40%护心方含药血清作用12 h。采用蛋白质印迹检测自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)、微管相关蛋白轻链3I(LC3-Ⅰ)、Beclin-1及p62表达,激光共聚焦显微镜观察自噬蛋白指标LC3B在细胞内分布及含量。结果与空白组比较,模型组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1表达显著增加,p62表达显著降低,LC3B表达平均荧光强度显著升高(P0.05);与模型组比较,护心方组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1表达显著降低,p62表达显著升高,LC3B表达平均荧光强度降低(P0.05)。结论护心方能够逆转ox-LDL诱导的细胞自噬相关蛋白的表达,从而抵抗动脉硬化过程中过度自噬。这可能是其抗动脉粥样硬化的机制之一。