酚氧化酶基因在3种淡色库蚊体内表达量比较

目的分析淡色库蚊抗性品系、敏感品系、微山湖现场品系蚊体内酚氧化酶基因表达量。方法根据酚氧化酶基因序列设计引物扩增基因片段,荧光定量PCR检测不同品系淡色库蚊体内的酚氧化酶基因表达水平差异。结果酚氧化酶在昆虫的正常发育过程中具有重要的生理作用,酚氧化酶基因在抗性品系蚊体内的表达量是敏感品系的6.74倍,微山湖现场品系是敏感品系的4.19倍。结论淡色库蚊酚氧化酶基因可做为新的抗性检测及治理基因靶标。     

淡色库蚊自然种群沃尔巴克氏体感染致细胞质不亲和相关基因初探

［摘要］　目的　探讨我国东部地区3个地理种群淡色库蚊由沃尔巴克氏体导致细胞质不亲和的相关基因,为制定基于沃尔巴克氏体的蚊媒病防制措施提供参考。方法　采用正反交实验确定江苏南京、江苏无锡和山东唐口3个淡色库蚊自然种群间细胞质不亲和,应用PCR技术检测淡色库蚊沃尔巴克氏体感染情况,采用荧光定量PCR法检测沃尔巴克氏体wsp基因和沃尔巴克氏体基因组中Octomom增殖区域WD0513基因表达水平。结果　江苏南京与无锡淡色库蚊自然种群双向亲和（t = 0.57、0.15,P均 > 0.05）,山东唐口和江苏无锡淡色库蚊自然种群双向不亲和（t = 63.81、43.51,P均 < 0.01）,江苏南京和山东唐口淡色库蚊自然种群双向不亲和（t = 39.62、43.12,P均 < 0.01）。3个地理种群淡色库蚊基因组均扩增出wsp基因条带。荧光定量PCR检测发现,3个自然种群淡色库蚊感染的沃尔巴克氏体wsp基因表达水平不同,但差异无统计学意义（F = 2.15,P > 0.05）。山东唐口与江苏南京、山东唐口与江苏无锡淡色库蚊自然种群WD0513基因表达水平间差异均有统计学意义（q = 8.42、7.84,P 均< 0.05）,但江苏南京与江苏无锡淡色库蚊自然种群WD0513基因表达水平间差异无统计学意义（q = 0.40,P > 0.05）。结论　江苏南京、江苏无锡和山东唐口3个地理种群淡色库蚊所感染沃尔巴克氏体数量不同,淡色库蚊自然种群感染沃尔巴克氏体导致的细胞质不亲和可能与WD0513基因表达量相关。     

淡色库蚊细胞色素P450基因的克隆、序列分析及表达差异的鉴定

目的克隆淡色库蚊细胞色素P450（CYP6F1）基因并进行表达差异的鉴定。方法采用RT—PCR技术和RACE策略，从淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系4龄幼虫中克隆细胞色素P450基因（CYP6F1），用相应的软件进行生物信息学分析，并用实时定量PCR和RT—PCR分析敏感、抗性品系蚊的CYP6F1表达水平及对蚊各期CYP6F1进行表达鉴定。结果成功克隆出CYP6F1基因，基因全长1639bp，开放阅读框为1527bp，编码508个氨基酸（GenBank登录号：AY662654）。序列分析显示该基因与已克隆的日本致倦库蚊细胞色素P450基因（AB001324）有99％的同源性，并具有所有的细胞色素P450基因的保守性特征，1个膜锚定信号、2个还原酶结合位点、1个典型的血红素蛋白结合位点和ETLR基序等。实时定量PCR和半定量RT—PCR结果表明，CYP6F1在淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系中表达水平高于敏感品系，且CYP6F1基因在淡色库蚊各个发育阶段有不同的表达。结论CYP6F1基因可能与杀虫剂抗药性相关，并且在淡色库蚊各个发育阶段有不同的表达。     

不同品系淡色库蚊各发育阶段的非特异性酯酶和乙酰胆碱酯酶活力变化

研究并探讨非特异性酯酶（NSE）和乙酰胆碱酯酶（AChE）活力在不同品系淡色库蚊（Cules pipiens pallens）各发育阶段的变化，为应用生物化学方法检测蚊虫抗药性及科学合理地进行蚊虫化学防治提供依据。用微量滴定板法测定单个蚊虫NSE和AChE活力，结果显示，敏感品系、DDVP抗性品系和残杀威抗性品系淡色库蚊NSE活力水平在不同发育阶段有变化，I－Ⅲ龄幼虫较低，Ⅳ龄幼虫、蛹和3日龄雌成蚊较高，在各发育阶段均是DDVP抗性品系NSE活力最高，残杀威抗性品系次之，敏感品系最低，其中Ⅳ龄幼虫、蛹和3日龄雌成蚊阶段三个品系间NSE活力差别更明显；三个品系淡色库蚊AChE活力在I－Ⅳ龄幼虫和蛹期较低，3日龄雌成蚊较高，三个品系间AChE活力稍有差异，从高到低依次为残杀威抗性品系、DDVP抗性品系和敏感品系。测定蚊虫NSE活力判断抗药性可选择Ⅳ龄幼虫、蛹和3日龄未吸血雌成蚊；测定蚊虫AChE不敏感性判断抗药性可选择3日龄未吸血雌成蚊；蚊虫化学防治中应选择低龄幼虫阶段施药。     

用核酸探针检测淡色库蚊溴氰菊酯抗性

目的　用淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关胰蛋白酶核酸探针检测淡色库蚊溴氰菊酯抗性。方法　用逆Northern鉴定抗药性品系和敏感品系中胰蛋白酶的表达差异 ,用随机引物法标记鉴定后的胰蛋白酶cDNA片段为探针Northernblot检测淡色库蚊的抗药性。结果　逆Northern显示胰蛋白酶在抗药性品系中的表达量是敏感品系的 4 33倍。以其为探针Northernblot检测显示 ,胰蛋白酶基因在抗药性品系中高表达 ,抗药性品系中胰蛋白酶的表达量是敏感品系的 3 90倍。结论　作为一种新的抗药性检测的分子生物学方法 ,胰蛋白酶核酸探针可用于区分抗药性品系和敏感品系     

中肠共生菌嗜水气单胞菌对淡色库蚊溴氰菊酯抗性的影响

目的探究中肠共生菌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)与淡色库蚊对溴氰菊酯抗性之间的关系。方法测定淡色库蚊敏感品系与抗性品系中肠中嗜水气单胞菌相对丰度;分离培养抗性蚊中肠内嗜水气单胞菌,对敏感品系蚊虫进行嗜水气单胞菌口饲添加,抗性品系口饲抗生素消除及消除后回饲,然后进行CDC Bottle抗性测定和细胞色素酶P450(P450s)活性测定。结果嗜水气单胞菌在抗性蚊中肠中的丰度显著高于敏感蚊(P0.05)。CDC Bottle试验显示,接触溴氰菊酯120 min时敏感品系增菌组的抗药性是对照组的2.41倍,抗性显著提升;口饲抗生素的抗性品系消除组的抗药性降低至对照组的66%,抗药性有所下降;嗜水气单胞菌回饲后抗性回升至消除组的1.71倍。敏感品系添加嗜水气单胞菌后P450s活性水平提高到对照组的2.05倍;消除抗性品系蚊肠道内嗜水气单胞菌后P450s活性水平降低至对照组的58%;回饲组P450s活性提高至消除组的2.13倍。结论蚊中肠共生菌嗜水气单胞菌可通过提高蚊体内外源物质代谢酶的活性介导蚊对溴氰菊酯的抗性,这为针对蚊杀虫剂抗性产生机制的研究及蚊害的综合性治理提供了一个新的思路。     

中肠共生菌嗜水气单胞菌对淡色库蚊溴氰菊酯抗性的影响北大核心CSCD

目的探究中肠共生菌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)与淡色库蚊对溴氰菊酯抗性之间的关系。方法测定淡色库蚊敏感品系与抗性品系中肠中嗜水气单胞菌相对丰度;分离培养抗性蚊中肠内嗜水气单胞菌,对敏感品系蚊虫进行嗜水气单胞菌口饲添加,抗性品系口饲抗生素消除及消除后回饲,然后进行CDC Bottle抗性测定和细胞色素酶P450(P450s)活性测定。结果嗜水气单胞菌在抗性蚊中肠中的丰度显著高于敏感蚊(P<0.05)。CDC Bottle试验显示,接触溴氰菊酯120 min时敏感品系增菌组的抗药性是对照组的2.41倍,抗性显著提升;口饲抗生素的抗性品系消除组的抗药性降低至对照组的66%,抗药性有所下降;嗜水气单胞菌回饲后抗性回升至消除组的1.71倍。敏感品系添加嗜水气单胞菌后P450s活性水平提高到对照组的2.05倍;消除抗性品系蚊肠道内嗜水气单胞菌后P450s活性水平降低至对照组的58%;回饲组P450s活性提高至消除组的2.13倍。结论蚊中肠共生菌嗜水气单胞菌可通过提高蚊体内外源物质代谢酶的活性介导蚊对溴氰菊酯的抗性,这为针对蚊杀虫剂抗性产生机制的研究及蚊害的综合性治理提供了一个新的思路。     

安徽省中北部淡色库蚊对多种杀虫剂抗性及其kdr基因突变研究

目的 目的 了解安徽省中北部地区淡色库蚊对多种杀虫剂的抗药性现状及其kdr基因突变情况。方法 方法 2014年 6-9月在淮北市、 蚌埠市和滁州市3地采集淡色库蚊幼虫, 带回实验室饲养至成虫, 采用WHO成蚊接触筒药膜滤纸接触 法对其进行0.05%溴氰菊酯、 5%马拉硫磷、 0.1%噁虫威、 4%DDT抗性生物测定。以PCR扩增经溴氰菊酯抗性测定的库蚊 抗性相关kdr基因并进行测序, 统计L1014位点突变情况。结果 结果 上述3个地区淡色库蚊对溴氰菊酯、 马拉硫磷、 噁虫 威、 DDT 4种杀虫剂都产生了不同程度的抗药性, 对DDT产生的抗性较高; 虽然3地淡色库蚊接触DDT后的死亡率差异 无统计学意义 （F = 1.027,P > 0.05）; 但接触溴氰菊酯、 马拉硫磷、 噁虫威后的死亡率差异均有统计学意义 （F = 23.823、 33.955、 128.841, P均< 0.01）。3地淡色库蚊种群的kdr基因1014位点均存在L1014F、 L1014S 这2种非同义突变; L1014F 突变频率与溴氰菊酯抗性水平呈正相关 （r 2 = 0.718, P < 0.01）。结论 结论 安徽省中北部地区淡色库蚊对溴氰菊酯、 马拉硫 磷、 噁虫威、 DDT均产生了较强的抗性, kdr基因L1014F突变频率与溴氰菊酯抗性水平呈正相关; 各地区卫生部门需加强 对媒介蚊虫抗性的动态监测。     

对溴氰菊酯抗性和敏感淡色库蚊不同发育阶段的抗性水平

对室内选育的淡色库蚊（对溴氰菊酯抗性品系和敏感品系）用浸渍法测定了Ⅱ龄、Ⅲ龄和Ⅳ龄幼虫，用接触筒法测定了早期、中期和晚期成虫；并观察了增效醚（ＰＢ）、磷酸三苯酯（ＴＰＰ）和杀虫脒与溴氰菊酯混用后的增效效果。结果表明：（１）淡色库蚊各发育阶段对溴氰菊酯的抗性水平，在敏感品系由高至低依次为中期、晚期、早期成虫、Ⅳ龄、Ⅲ龄和Ⅱ龄幼虫；在抗性品系则为早期、中期、晚期成虫、Ⅳ龄、Ⅲ龄和Ⅱ龄幼虫。（２）ＰＢ和杀虫脒均有明显增效作用，提示抗性可能与氧化代谢增强和靶标部位不敏感有关。其中似乎幼虫阶段以氧化代谢增强为主要抗性机制；在成虫阶段，氧化代谢增强和靶标部位不敏感性均在抗性中起重要作用     

用核酸探针检测淡色库蚊溴氰酯抗性

目的：用淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关胰蛋白酶核针检测淡色库蚊溴氰菊抗性。方法：用逆Northern鉴定抗药性品系和敏感品系中中胰蛋白酶的表达差异，用随机引物法标记鉴定后的胰蛋白酶cDNA片段为探针Northern blot检测淡色库蚊的抗药性。结果：逆Northern显示胰蛋白酶在抗药性品系中的表达量是敏感品系的4．33倍。以其为探针Northern blot检测显示，胰蛋白酶基因在抗药性品系中高表达，抗药性品系中胰蛋白酶的表达量是敏感品系的3．90倍。结论：作为一种新的抗药性检测的分子生物学方法，胰蛋白酶核酸探针可用于区分抗药性品系和敏感品系。     

蚊抗药性相关糜蛋白酶基因稳定转染细胞系的建立与表达鉴定

目的建立抗药性相关糜蛋白酶基因稳定转染细胞系。方法采用PCR方法,以淡色库蚊抗药性品系cD NA文库为模板,扩增出抗药性品系高表达的糜蛋白酶基因编码区;经T/A克隆测序鉴定后,亚克隆到真核表达载体pIE13,构建重组昆虫细胞表达载体pIE13/chy,经酶切和PCR鉴定后,与带有筛选标记的pIE1neo质粒共转染蚊细胞C6/36,通过G418选择培养,建立转染细胞系;用RT PCR、Westernblotting鉴定糜蛋白酶基因的转录表达。结果成功构建了真核表达载体pIE13/chy,证明糜蛋白酶基因已转入C6/36细胞,建立了稳定转染细胞系,表达产物分子质量单位约30ku,与理论值相符。结论稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究糜蛋白酶基因与抗药性的关系奠定了基础。     

2018—2019年江苏省库蚊监测结果分析

［摘要］　目的　了解2018—2019年江苏省库蚊种群分布、密度变化及淡色库蚊对杀虫剂的抗性水平。 方法　2018—2019年6—10月,选择江苏省苏南、苏北和苏中6个县（市、区）作为监测点,采用全通宵诱蚊灯法调查库蚊种群密度。采集苏中地区南通市海安市和盐城市盐都区淡色库蚊,采用WHO推荐的接触筒强迫接触法测定子1代雌性淡色库蚊对二氯二苯三氯乙烷（dichlorodiphenyltrichloroethane, DDT）、马拉硫磷、残杀威、高效氯氰菊酯和溴氰菊酯5种杀虫剂的敏感性。 结果　2018—2019年在江苏省6个监测点累计库蚊104 423只,蚊种以致倦库蚊、淡色库蚊和三带喙库蚊为主,分别占49.11%、28.38%和21.04%;库蚊种群密度从6月初开始升高,7月左右达到峰值,10月下旬趋近于低值。海安市淡色库蚊对马拉硫磷抗性级别为敏感,盐都区淡色库蚊对马拉硫磷抗性级别为初步抗性;盐都区、海安市淡色库蚊对残杀威抗性级别均为初步抗性;盐都区、海安市淡色库蚊对DDT、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯抗性级别均为抗性。结论　江苏省库蚊种群以致倦库蚊、淡色库蚊、三带喙库蚊为主;苏中地区淡色库蚊已对DDT、高效氯氰菊酯和溴氰菊酯产生抗性。     

淡色库蚊氯菊酯抗性品系和敏感品系的生物学特性

目的　比较淡色库蚊氯菊酯抗性品系和敏感品系生物学特性的差异。　方法　在实验室观察淡色库蚊氯菊酯抗性品系及敏感品系的吸血、繁殖和发育等生物学特性 ,构建实验种群生命表。　结果　淡色库蚊氯菊酯抗性品系吸血率低于敏感品系 ,卵、幼虫和蛹的发育历期及成虫寿命均长于敏感品系 ,卵期死亡率高于敏感品系。以上各项 ,两种品系间差异均具有显著性意义 (P <0.01)。抗性品系相对于敏感品系的适合度为 0.58。　结论　淡色库蚊氯菊酯抗性品系表现出对生长发育和繁殖的不利性。     

淡色库蚊kdr等位基因突变及抗药性检测方法的研究

目的 了解山东省不同地区的淡色库蚊成蚊对溴氰菊酯的抗药性水平及其kdr等位基因的突变与抗药性水平间的关联情况,并探索建立蚊虫抗药性的现场检测方法。方法 采用RT-PCR和AS-PCR技术,使用特异性引物克隆不同地区野生淡色库蚊成蚊kdr基因序列,并进行基因测序。利用线性回归分析判断其突变情况与抗药性的关联情况。结果 成功克隆出kdr等位基因, 通过基因序列分析发现在淡色库蚊钠通道第II结构域S6节段1014位点上存在2种突变,即L1014F：TTA突变为TTT,相应的亮氨酸(L)被苯丙氨酸(F)取代,L1014S：TTA突变为TCA,相应的亮氨酸(L)被丝氨酸(S)取代。Kdr基因L1014F突变 和L1014S突变与淡色库蚊对溴氰菊酯的抗性表型呈正相关。RT-PCR和AS-PCR技术对蚊虫抗药性现场检测的结果一致。结论 淡色库蚊kdr基因突变与溴氰菊酯抗药性表型呈正相关,RT-PCR和AS-PCR技术都可以应用于蚊虫抗药性的现场检测。     

山东省淡色库蚊对杀虫剂的抗药性

目的 检测山东省各地淡色库蚊对常用化学杀虫剂的抗性状况,探讨抗性治理对策。方法 采用世界卫生组织生物测定方法,测定蚊幼虫的LC_(50)确定抗性水平,计算抗性系数。结果 对山东省10个地区近10年的淡色库蚊抗性测定表明,各地淡色库蚊对常用杀虫剂均产生了一定的抗性,对DDVP的抗性最高达21.18倍,对马拉硫磷的抗性高达5.39倍,对溴氰菊酯的抗性高达42倍。各地抗性水平有逐年增高的趋势。结论 山东各地淡色库蚊对常用杀虫剂均产生了一定的抗性,急需研究实施抗性治理对策。     

溴氰菊酯和倍硫磷混用、轮用对淡色库蚊抗性发展的影响

目的　观察杀虫剂不同用药方式对淡色库蚊抗性发展的影响。方法　以淡色库蚊（Culex pipiens pallens）为试虫,用溴氰菊酯和倍硫磷混剂和单剂隔代轮用进行抗性选育,以溴氰菊酯和倍硫磷单剂作为对照。结果　淡色库蚊经16代处理,其抗性系数在溴氰菊酯和倍硫磷混用为14.65;两者轮用为17.74（溴氰菊酯）和2.77（倍硫磷）;单剂连用则分别为729.08和24.73。结论　两种作用机制不同的杀虫剂混用或轮用均能延缓害虫对杀虫剂抗性的发展。     

淡色库蚊对常用杀虫剂长期选育的抗性水平及交互抗性

目的了解淡色库蚊对3种常用化学杀虫剂长期选育的抗性状况及5种杀虫剂的交互抗性,为合理有效地进行蚊虫化学防治提供依据。方法采用WHO生物测定方法,测定淡色库蚊对3种杀虫剂长期选育的抗性水平。结果经过42代选育,淡色库蚊对敌敌畏（DDVP）、残杀威和氯氰菊酯的抗性指数分别最高达12．17、11．78和534．31倍。结论经过长期选育,发现淡色库蚊对3种常用化学杀虫剂均产生不同程度的抗药性及交互抗性,提示应采取适当措施克服或延缓蚊虫抗药性的产生和发展。