17β-雌二醇对氧化型低密度脂蛋白由钙介导细胞骨架损伤的抑制作用

目的　通过观察 1 7β 雌二醇 (1 7β E2 )与氧化低密度脂蛋白 (OX LDL)作用于血管内皮细胞后细胞内微丝肌动蛋白的变化以及同细胞内钙离子变化间的关系 ,以探讨雌激素的血管保护作用机制。方法　采用ECV 30 4脐静脉内皮细胞株体外培养 ,分为空白对照组 ,OX LDL(2 0 0 μg/ml)组 ,4× 1 0 - 7mol/LE2 作用组 ,E2 保护组 ,采用激光扫描共聚焦显微镜分别观察OX LDL作用后 1 2h时的胞内钙离子的变化及OX LDL作用 2 4h时的细胞骨架微丝的改变。结果　OX LDL作用 1 2h后细胞内钙离子浓度明显升高 ,而细胞骨架微丝也在 2 4h后发生明显的破坏。雌激素预处理后可明显抑制OX LDL作用导致后细胞内钙离子浓度的升高 ,并且明显地防止细胞骨架微丝损伤的发生。结论　 1 7β E2 可能通过抑制OX LDL导致的细胞内钙离子升高从而防止细胞骨架微丝损伤的发生 ,这可能是雌激素产生血管保护作用的机制之一。     

同型半胱氨酸对血管内皮细胞骨架与内皮细胞功能的影响

目的:通过动态观察同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)作用后的血管内皮细胞功能的变化,以及对内皮细胞骨架肌动蛋白G-actin和F-actin的定量分析,探讨骨架肌动蛋白在Hcy损伤内皮中的作用及机制。方法:将体外培养的人脐静脉内皮细胞株(ECV-304)分为正常对照组、低剂量Hcy组(0.1mmol/L)、中剂量Hcy组(0.5mmol/L)和高剂量Hcy组(1.0mmol/L),观察各组细胞培养24h时其细胞骨架和相关功能的变化;中剂量Hcy组及高剂量Hcy组还观察了6h、12h时的相应变化。分别采用硝酸还原酶法、硫代巴比妥酸法检测各组条件培养基中一氧化氮(NO)、脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)的含量。用Rhodamine-Phalloidin标记纤维状肌动蛋白(F-actin),Alexa Flour488-DnaseⅠ标记球状肌动蛋白单体(G-actin),激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测内皮细胞骨架G-actin、F-actin含量,并计算G/F比值。结果:随着Hcy作用时间的延长或剂量的增大,NO含量总体呈下降趋势,而MDA含量增高;G-actin、F-actin总体含量及G/F比值上升,并呈一定的时间、剂量相关性。结论:Hcy可通过改变骨架蛋白G-actin和F-actin含量,以及G/F比值引致内皮细胞功能的损伤,这也可能是其诱导动脉粥样硬化早期变化的重要机制之一。     

血府逐瘀汤对高血压血瘀证患者血清致内皮功能障碍的影响

目的 观察血府逐瘀汤复方对高血压血瘀证患者血清致血管内皮功能障碍的影响及机制.方法 人脐静脉内皮细胞株ECV-304分组后以MTT法选取该复方药物血清的最佳作用浓度,检测ET和NO、内皮细胞蛋白C受体(EPCR)、血管内假性血友病因子(vWF)和血栓调节蛋白(sTM)的含量.在激光扫描共聚焦显微镜下观察其对细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)和细胞骨架微丝结构的影响.结果 与模型组相比,血府逐瘀汤组([Ca2+]i)浓度升高,NO、EPCR和vWF降低,骨架微丝少但排列有序.结论 该复方可以有效对抗高血压血瘀证患者血清干预ECV-304造成的内皮功能障碍,从药物的角度反证了细胞损伤模型的建立.     

登革病毒感染后ECV304单层细胞通透性与微丝关系的研究

目的研究登革病毒感染后,ECV304单层细胞通透性与病毒滴度及细胞微丝骨架形态变化的关系。方法以人血管内皮细胞株ECV304和HUVEC为研究对象,用免疫荧光法观察登革病毒感染对微丝排列的影响;用transwell模型研究登革病毒感染后单层ECV304细胞通透性的变化;用噬斑法检测培养上清的病毒滴度。结果登革病毒感染后1 h内,ECV304细胞和HUVEC微丝骨架均发生了重新排布;感染后第3天,上清登革病毒滴度在达到峰值,同时ECV304细胞的微丝排列及通透性也有显著改变。结论登革病毒感染后所引起的微丝重排可能与ECV304单层细胞通透性的改变有着密切联系。     

2型糖尿病患者血清对人脐静脉内皮细胞骨架及胞浆内游离钙的影响

目的 探讨2型糖尿病患者血清干预人脐静脉内皮细胞(ECV-304)对细胞骨架微丝及胞浆内游离钙浓度的影响.方法 ECV-304传代后取对数生长期细胞分为正常对照组(N组)、健康人血清干预组(H组)和糖尿病患者血清干预组(MD组).按照1×105/ml将细胞种植在Petri 皿中进行分组干预,其中健康人血清、糖尿病患者血清浓度分别占总体积的10%.采用Fluo-3/AM作为荧光指示剂在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞内游离钙浓度的变化,采用荧光探针标记的鬼笔环肽染色法观察细胞骨架微丝分布的差异.结果 与N组比较MD组胞浆内荧光分布不均匀,胞浆内游离钙浓度显著升高,骨架微丝断裂,排列紊乱,少部分区域缺失.结论 糖尿病患者血清干预正常的ECV-304可以造成内皮细胞的骨架结构改变,主要与细胞内游离钙浓度升高有关.     

血管内皮细胞钙离子浓度与缺氧及血管紧张素Ⅱ的相关性

目的 观察缺氧及血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对血管内皮细胞(VEC)内钙离子浓度的影响.方法 建立VEC缺氧损伤模型;实验设为对照组、缺氧组、AngⅡ作用组、缺氧+AngⅡ作用组共4组.各组细胞经过F1uo-3/AM负载后,用激光共聚焦显微镜测定VEC内Fluo-3的荧光强度代表钙离子浓度.结果 VEC分别经过缺氧及AngⅡ损伤后,细胞内钙离子浓度明显升高(P＜0.01);缺氧条件下AngⅡ可引起VEC钙离子浓度进一步升高(P＜0.05).结论 缺氧及AngⅡ可引起VEC内钙离子浓度明显升高,造成VEC损伤.     

扇贝裙边糖胺聚糖拮抗高糖对血管内皮细胞损伤机理的研究

目的 探讨扇贝裙边糖胺聚糖(SS-GAG)拮抗血管内皮细胞损伤性疾病的价值.方法 取体外培养生长良好的血管内皮细胞(ECV304),建立高糖诱导的细胞损伤模型.在高浓度葡萄糖(55.5 mmol/L)状态下加入不同浓度SS-GAG,继续培养至12、24、36、48 h,倒置显微镜下观察细胞形态,用3H-TdR掺入法检测细胞增殖活性.结果 ①高浓度葡萄糖使ECV304细胞形态发生改变,细胞增殖活性受到明显抑制,且呈浓度和时间依赖性;②SS-GAG与高浓度葡萄糖共同作用下,内皮细胞形态及增殖活性基本正常,此效果与SS-GAG浓度呈正比.结论 高浓度葡萄糖对血管内皮细胞具有明显损伤作用;SS-GAG可减轻高浓度葡萄糖对血管内皮细胞的损伤,保护血管内皮细胞;SS-GAG对防治心脑血管疾病和糖尿病血管病变及动脉粥样硬化的发生、发展有积极意义.     

同型半胱氨酸对血管内皮细胞骨架的影响

目的:研究同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)对内皮细胞形态及细胞骨架肌动蛋白的影响,并探讨骨架变化与内皮损伤的关系.方法:将体外培养的ECV-304内皮细胞株随机分为正常对照组、低剂量Hcy组、中剂量Hcy组和高剂量Hcy组.倒置相差显微镜观察各组培养24 h的内皮细胞的形态变化;并用Rhodamine-Phalloidin标记纤维状肌动蛋白(F-actin),Alexa flour 488-DnaseⅠ标记球状肌动蛋白单体(G-actin),激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察各组内皮细胞骨架肌动蛋白的不同变化.结果:正常对照组内皮细胞基本为梭形,呈典型的鹅卵石样外观;各Hcy组内皮细胞形态则明显不同,随着Hcy浓度的增加,胞体出现收缩,细胞变圆、渐至不规则,且轮廓增强,细胞间隙增大,甚至坏死脱落.LSCM下发现,正常对照组内皮细胞F-actin在周边形成致密周围带,胞质内有部分应力纤维;随着Hcy浓度的递增,外周致密带逐渐出现断裂、甚至消散;胞质内应力纤维变短、增粗,最终消失.而G-actin正常时仅局限在核周,在受到不同浓度Hcy作用后,明显向外周扩散,且荧光强度增大.结论:内皮细胞骨架肌动蛋白的形态变化与重排,可能是Hcy损伤内皮细胞的重要机制之一.     

晚期糖基化终产物刺激下人脐静脉内皮细胞中 F-actin的形态和分布变化

目的观察晚期糖基化终产物(AGE)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖活力和细胞内纤维状肌动蛋白(F-actin)形态学的影响,探讨AGE导致毛细血管通透性升高的病理生理学基础.方法采用四唑盐(MTT)比色法,分别检测并绘制正常组和AGE处理组的HUVEC活力曲线;并分别于培龄第1～12天进行F-actin的荧光染色.结果AGE组HUVEC的活力曲线与正常组相比显著下移.荧光染色发现:正常组HUVEC的F-actin纤维主要富集于毗邻细胞膜的周边,形成典型的鹅卵石样形态,细胞质中未见密集的F-actin纤维;AGE组细胞内的F-actin纤维形态和分布发生明显的改变,出现应力纤维、丝状伪足和板状伪足三种异常形态,至刺激后期,大部分细胞周边的F-actin纤维消失,胞质中出现密集的应力纤维.结论AGE对内皮细胞的活力有明显的抑制作用.同时,AGE促使内皮细胞F-actin从位于细胞膜周边的状态转为弥散于整个细胞质的状态,内皮细胞收缩,胞间裂隙形成,可能引起毛细血管通透性升高.     

降钙素基因相关肽对内皮细胞增殖及内皮功能的影响

目的　观察降钙素基因相关肽（ＣＧＲＰ）对内皮细胞增殖及内皮功能的影响。方法　检测了培养内皮细胞周期时相的分布以及细胞内游离钙离子的水平，同时对培养液中一氧化氮（ＮＯ） 和内皮素（ＥＴ） 的含量进行了测定。结果　加用ＣＧＲＰ组，Ｓ期细胞明显最多，细胞内游离钙离子水平增高，培养液中ＮＯ含量升高，ＥＴ含量降低（ Ｐ均＜ ０－０１）。结论　ＣＧＲＰ促进血管内皮细胞增殖，其作用可能与增加细胞内钙离子水平有关，此外，它还能促进ＮＯ 的合成，降低ＥＴ的水平，因此对改善内皮细胞的功能，防治动脉粥样硬化起着积极的作用。     

环氧合酶-2对香烟提取物诱导的内皮细胞凋亡的作用

目的 探讨环氧合酶-2在香烟提取物(CSE)所诱导的内皮细胞凋亡中的作用.方法 体外培养人血管内皮细胞株ECV304,按3个步骤完成实验:(1)用0.0%、0.5%、1.0%和5.0%CSE分别F预ECV-304细胞12 h;(2)用5.0%CSE分别干预ECV304细胞0、3、6、9、12和24 h;(3)用5.0% CSE 及0.0、2.5、5.0、10.0、20.0、50.0μmol/L选择性环氧合酶-2抑制剂赛来昔布联合干预ECV304细胞9 h.采用Hoechst染色法和流式细胞术检测内皮细胞凋亡,免疫细胞化学和Western blot 法检测环氧合酶-2蛋白的表达.采用Bartlett法进行方差齐性检验,多组间均数比较采用单因素方差分析和LSD-t检验.结果 随着CSE干预浓度的升高,内皮细胞凋亡率和环氧合酶-2蛋白表达水平均逐渐升高,5.0%CSE干预后内皮细胞凋亡率最高[(5.40±0.39)%],环氧合酶-2蛋白表达也最高(206.1±15.5),差异均有统计学意义(F值分别为90.03和159.94,均P<0.05).5.0%CSE干预内皮细胞3 h,环氧合酶-2蛋白的表达开始增加,9 h达峰值,12 h开始减弱,24 h恢复止常.随着干预时间的延长,内皮细胞凋亡率逐渐升高,5.0%CSE干预24 h内皮细胞凋亡率最高[(8.87±0.41)%],差异均有统汁学意义(F=155.65,均P<0.05).5.0%CSE与不同浓度的选择件环氧合酶-2抑制剂赛来昔布共同作用于内皮细胞9 h后,随着赛来昔布干预浓度升高,环氧合酶-2的表达逐渐减弱;内皮细胞凋亡率首先出现小幅的下降,随后明显增加,以5.0%CSE+50μmol/L赛来昔布组的内皮细胞凋亡率最高[(32.60±5.51)%],差异均有统计学意义(F=81.28,均P<0.05).结论 CSE能够诱导内皮细胞凋亡和环氧合酶-2蛋白表达.选择性环氧合酶-2抑制剂赛来昔布能够抑制CSE诱导内皮细胞表达环氧合酶-2蛋白,并促进内皮细胞凋亡,甚至诱发其死亡.环氧合酶-2有助于缓解CSE诱导的内皮细胞凋亡,对内皮细胞有一定程度的保护作用.     

Tumor necrosis factor alpha as an endogenous stimulator for circulating coupling factor 6

OBJECTIVE: We recently showed that mitochondrial coupling factor 6 (CF6) is present as a pressor substance and a prostacyclin inhibitor in systemic circulation. However, the regulation mechanism for circulating CF6 is unknown. We investigated the role of tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) in the generation and release of CF6. METHODS AND RESULTS: We used two kinds of cells, human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and ECV-304. The concentration of CF6 in the medium increased with time in both ECV-304 and HUVEC. Treatment of ECV-304 and HUVEC with TNF-alpha enhanced the release of CF6 in a dose-dependent manner concomitantly with the decrease in CF6 content in the mitochondria at 24 h. The released CF6 was characterized to be an active full-length peptide by Western blot. The ratio of CF6 to GAPDH mRNA, measured by real-time polymerase chain reaction, was 1.7 fold increased at 1 h after exposure to TNF-alpha in ECV-304 and HUVEC. This enhanced gene expression and release was blocked or suppressed by 70% by stable transfection of dominant negative mutant I kappa B kinase alpha whose efficacy was confirmed by blockade of translocation of NF-kappa B p65 protein and of degradation of I kappa B alpha protein. Flow cytometry analysis revealed that the cell surface-associated CF6 was significantly increased at 24 h after TNF-alpha in a dose-dependent manner. CONCLUSIONS: TNF-alpha stimulates the gene expression of CF6 via activation of NF-kappa B signaling pathway, and promotes the release of CF6 from ECV-304 and HUVEC.     

银杏叶提取物降低高糖诱导的血管内皮细胞的凋亡

高浓度葡萄糖可增加内皮细胞内反应性导其凋亡;银杏叶提取物可提高内皮细胞在高糖环境下的活力,降低其凋亡率,可能与其通过抗氧化作用及下调泛素介导的胞浆内蛋白水解系统有关。     

氧化型低密度脂蛋白对胎盘生长因子及抑制剂的影响

目的探讨氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)对胎盘生长因子1(PLGF-1)作用人脐静脉内皮细胞(ECV-304)释放炎性因子和内皮细胞黏附分子的影响,及PLGF-1拮抗剂2’-氨基-3’-甲氧黄酮(PD98059)对其抑制程度。方法应用不同浓度的PLGF-1(20、40、80μg/L)孵育ECV-304,分为对照组和PLGF-1干预组(20、40、80 μg/L)。再应用PD98059(100μmol/L)和PLGF 1(80 μg/L)刺激ECV 304,分为空白对照组、ox-LDL组、PLGF-1+ox-LDL组和PLGF-1+ox-LDL+PD98059(拮抗组)。应用ELISA法检测炎性因子和内皮细胞黏附分子的表达。结果 (1)PLGF-1诱导炎性因子和内皮细胞黏附分子的表达呈时间依赖关系,6 h达最理想的分泌量。随着PLGF-1浓度的加大呈上升趋势。(2)与空白对照组比较,ox-LDL组、PLGF-1+ox-LDL组和拮抗组白细胞介素6、基质金属蛋白酶2、可溶性细胞间黏附分子1、可溶性血管细胞黏附分子1的表达显著增加(P<0.01),拮抗组较PLGF-1+ox-LDL组的表达显著减少(P<0.01)。结论 PLGF-1可促使内皮细胞产生大量炎性因子,参与诱导内皮活化;抑制PLGF-1的生物活性可控制炎性的反应。     

花生四烯酸通过激活钙通道系统阻断饱和脂肪酸对血管内皮细胞的毒性作用

用各种阻断剂分别与饱和脂肪酸、花生四烯酸(AA)脂氧化酶和环氧化酶抑制剂处理血管内皮细胞,发现AA的脂氧化酶代谢物通过激活钙通道系统抑制软脂酸对血管内皮细胞的脂毒性作用。     

氧化型高密度脂蛋白对细胞凋亡及细胞内钙离子浓度的影响

目的通过研究氧化型高密度脂蛋白对培养的内皮细胞致凋亡以及细胞内钙离子浓度的影响,阐述其致动脉粥样硬化机理,并探讨其引起细胞损伤的机制.方法用铜离子引发脂质过氧化过程,制备氧化型高密度脂蛋白,用MTT检测法检测细胞活性,PI染色法检测细胞凋亡.结果氧化型高密度脂蛋白可诱导内皮细胞发生凋亡;细胞内钙离子浓度则随氧化型高密度脂蛋白浓度的升高呈现逐渐下降的趋势.结论氧化型高密度脂蛋白引起细胞损伤的机制可能与钙离子浓度升高有关,体内氧化型高密度脂蛋白通过内皮细胞凋亡的途径损伤血管内皮,引发动脉粥样硬化.     

硒对人脐静脉内皮细胞ECV-304单核细胞趋化蛋白-1表达的影响

目的 观察硒对人脐静脉内皮细胞ECV-304单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达的影响方法分别用高葡萄糖、糖基化终末产物，高胰岛素和过氧化氢孵育人脐静脉内皮细胞ECV-304；在先加入100nmol／L硒后，再给予以上4种因素．分别检测人脐静脉内皮细胞ECV0304MCP-1mRNA的表达并比较。结果 4种因素均可作为独立因素，导致人脐静脉内皮细胞ECV304MCP-1mRNA表达量增加：硒能抑制4种因素所致的MCP-1mRNA表达。结论 硒抑制MCP-1 mRNA在人脐静脉内皮细胞ECV-304中的表达。     

去天冬氨酸血管紧张素-1对人脐静脉内皮细胞的保护作用

目的观察天冬氨酸血管紧张素-1(des-aspartate-angiotensin1,DAA-1)对过氧化氢致人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用。方法实验分为正常对照组,过氧化氢模型组,过氧化氢加DAA-1组(低剂量、中剂量、高剂量组)。倒置显微镜下观察细胞形态、密度。噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力,比色法测定细胞培养液中超氧化物歧化酶,活性、丙二醛及乳酸脱氢酶浓度。免疫细胞化学方法测定组织纤维蛋白溶酶原激活物,Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制因子表达量。逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定细胞内皮素1和血栓调节蛋白mRNA的表达。结果DAA-1能明显抑制过氧化氢所致的细胞活力的降低[0.443±0.024vs.0.317±0.024,P0.01],减少细胞内乳酸脱氢酶释放[(102.35±9.87)U/Lvs.(242.78±16.10)U/L,P0.01],提高超氧化物歧化酶活力[(19.10±2.33)U/mLvs.(8.16±3.48)U/mL,P0.01],并呈剂量依赖性作用;能明显减少内皮细胞在氧化过程中丙二醛的生成[(1.35±0.19)U/mLvs.(2.33±0.48)U/mL,P0.01],增加组织纤维蛋白溶酶原激活物蛋白表达,减少Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制因子蛋白表达;并能明显抑制内皮素mRNA的表达和提高血栓调节蛋白mRNA的表达。结论DAA-1对过氧化氢所致人脐静脉内皮细胞损伤具有明显的保护作用。