利用全外显子组测序技术发现Noonan综合征BRAF基因新生突变

目的:利用全外显子测序技术,对Noonan综合征(NS)患儿及父母进行测序,筛选致病基因突变,探讨基因型与临床表型的关系。方法:提取NS患儿及其父母外周血基因组DNA,使用Agilent Sure Select Human All Exome V6试剂盒进行全基因组外显子捕获,利用Illumina Hiseq X Ten测序仪进行双端高通量测序。通过生物信息学分析,利用db SNP数据库、千人基因组、Ex AC数据库分析变异频率,确定突变位点,用Sanger测序法进行验证。结果:患儿,女性,4岁1个月,生长发育落后、特殊面容。超声心动图示肺动脉瓣狭窄、卵圆孔未闭,临床未给予明确诊断。通过全外显子测序,在患儿BRAF基因中找到一个杂合错义突变c.770AG(p.Q257R),其父母此位点为正常基因型,该突变为患儿新发突变。结合临床表型和基因检测结果,该患儿最终被诊断为NS。结论:本研究明确了NS和突变位点的关系,强调了全外显子测序用于非典型病例明确诊断和准确遗传咨询的实用性。     

新生儿颅骨锁骨发育不全一例的RUNX2基因突变检测并文献复习

目的报告颅骨锁骨发育不全(CCD)患儿1例的RUNX2基因突变检测情况。方法患儿临床查体后进行临床及影像学检查,明确诊断为CCD。提取患者全血基因组DNA送第三方检测机构(金域医学检验中心),通过高通量基因测序检测患儿RUNX2基因型。结果患者RUNX2基因型为c.201dupG p.(Gln68fs)。结论成功发现了RUNX2基因的致病突变,补充了国内外CCD致病基因的突变位点数据库。     

基因芯片法对苏州市结核临床分离株RFP耐药性快速检测价值的研究

目的 通过基因芯片法检测结核分离株RFP的耐药性,为在临床诊断中利用该法快速鉴别苏州市结核RFP耐药菌株的可靠性奠定基础.方法 收集痰液标本45例,利用罗氏固体培养法（金标准）对结核分枝杆菌进行传统药敏试验;利用晶芯结核分枝杆菌耐药检测试剂盒及相关仪器通过核酸提取、PCR扩增、芯片杂交和芯片扫描,对结核分枝杆菌RFP耐药相关基因rpoB的rpoB-RRDR 511,513,516,526,531和533位点进行检测,将基因芯片检测获得的RFP药敏判读结果与金标准法获得的结果进行比较分析;将17例经基因芯片检测过的菌株用PCR法扩增包含rpoB-RRDR的基因片段,经纯化后进行DNA直接测序,将基因芯片对rpoB-RRDR 526,531位点的检测结果与DNA测序获得的结果进行比较分析.结果 与金标准法相比,基因芯片法对菌株RFP药敏检测的准确率为93.3%（42/45）;与DNA测序法相比,基因芯片法对rpoB-RRDR 526,531位点突变型检测的准确率为82.4%（14/17）.结论 rpoB-RRDR 526,531位点突变是导致苏州市结核病RFP耐药的主要因素,通过基因芯片法对rpoB基因相关位点的检测可为临床对RFP耐药结核鉴定提供一种快速、准确和批量性的检测手段,具有极大的应用价值.     

IL-10基因-592C/A多态性与儿童过敏性紫癜的关系

目的探讨白细胞介素10(IL-10)启动子区-592位点的单核苷酸多态性(SNP)与儿童过敏性紫癜(HSP)易感性之间的关系。方法收集100例HSP患儿和153名健康体检儿童全血标本,提取DNA,采用限制片断长度多态分析-聚合酶链反应方法(RFLP/PCR)对IL-10的基因启动子区592位点基因型进行分析,比较病例组与正常对照组的基因分布。结果 HSP患儿IL-10基因-592C/A位点等位基因频率和基因型频率与正常对照组差异无统计学意义(P0.05)。结论 IL-10基因-592C/A多态性与儿童HSP易感性无关。     

基因芯片技术检测HBV DNA及拉米夫定耐药株的应用研究

目的 :研究基因芯片技术检测 HBV DNA及拉米夫定耐药株在临床应用中的特异性、实用性。方法 :利用基因芯片法、双脱氧测序法分别对 4 3例服用拉米夫定且 HBV DNA仍为阳性的乙型肝炎 (乙肝 )患者及 10例非乙肝患者的血清进行 HBV DNA和 P区 5 2 8、5 5 2、5 5 5突变位点检测、对比。结果 :两种方法检测 HBV DNA10 0 %相符 ;检测拉米夫定耐药突变株 12 4个位点结果相符 ,5个位点结果不相符 (P >0 .0 5 ) ,提示两种方法检测HBV DNA及 P区 5 2 8、5 5 2、5 5 5突变位点阳性率相等。结论 :利用基因芯片技术检测 HBV DNA及拉米夫定耐药株 ,其特异性可与 DNA测序媲美 ,在混合株检测方面比 DNA测序有更大的优势。其方法简便 ,能大量地对临床标本进行检测 ,可作为临床常规检测手段。     

发根DNA检测Alport综合征COL4A5基因突变

目的：通过发根DNA提取分析Alport综合征（Alport syndrome，AS）一家系中COL4A5基因突变，试图通过该方法简化AS家系的收集工作和推广COL4A5基因检测。方法：通过PCR和直接测序的方法，对先证者外周血DNA COL4A5基因所有51个外显子及其相邻内含子的DNA序列进行检测。发现突变位点后，提取6份该家系成员发根部DNA进行该突变位点检测。结果：①成功地从发根部提取DNA，进行了PCR和直接测序。②在COL4A5基因第50号外显子4944位点发现一错义突变，碱基G被T取代，导致其编码1648位氨基酸由色氨酸变为半胱氨酸（4944G＞TW1648C），男性患者为纯合突变，女性患者为杂合突变，正常家系成员和92例对照中均未发现此位点异常，说明W1648C为引起该家系临床病变的突变位点，并非多态性位点。在性连锁Alport综合征中，COL4A5基因此突变位点为首次报道。结论：通过毛发收集、DNA提取，可使家系收集工作更为简便易行，可帮助未开展基因检测的地Ⅸ进行基因诊断。本研究通过发根DNA提取检测Alport综合征一家系中新的COL4A5基因突变，遗传方式符合性连锁显性遗传。     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎中变异病毒株的动态变化

目的:建立定量检测及监测乙肝病毒DNA的rtM204I/V(YMDD)及rtL180M变异的方法.方法:以克隆、测序鉴定及构建乙肝病毒DNA YMDD及变异(YIDD和YVDD)质粒作为标准,4例接受拉米夫定治疗(100 mg/d,疗程48 wk以上)的慢性乙型肝炎患者血清标本为对象,用焦磷酸测序的方法检测变异位点核苷酸的频率,并计算变异株的含量比例,通过检测不同变异株类型的标准质粒,确定测序峰图的背景信号.结果:通过检测标准质粒后,确定背景信号为5%,变异位点调整后的核苷酸频率转化为变异病毒株的比例后,4例患者治疗前均检测出变异的病毒株(4.5%-33%),并且随治疗时间延长呈增多的趋势.病毒载量及ALT分析提示基因型耐药发生后,将发生病毒学反跳及临床耐药.结论:焦磷酸测序可以定量检测及动态监测变异病毒株的含量.拉米夫定耐药突变株在拉米夫定治疗前已存在,并随治疗时间的增加而增长,出现病毒学反弹及临床耐药.     

利用目标基因捕获结合第二代测序技术发现腹主动脉瘤致病基因突变

目的建立目标基因捕获结合第二代测序技术对腹主动脉瘤患者原纤维蛋白1(FBN1)基因进行突变筛查,探讨腹主动脉瘤与FBN1基因突变的关系。方法提取4例腹主动脉瘤患者外周血全基因组DNA,利用Gen Cap目标基因捕获技术,设计FBN1的65个外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,将目标基因组区域的DNA片段进行富集后,再利用Illumina Hi Seq2000第二代测序仪进行测序,通过数据分析,确定突变位点,用Sanger测序法对突变位点进行验证。结果设计合成的目标基因特异性捕获探针可有效地捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段。4例患者目标区域平均测序深度为448.15~536.61,99.5%~99.7%目标区域覆盖度。经过数据分析及Sanger测序验证发现1个新的错义突变c.2753 CG(p.Pro918Arg),db SNP137数据库、千人基因组及内部800名正常汉族人数据库均无此突变。经SIFT预测为有害突变。结论本研究所建立的Gen Cap目标基因捕获技术结合Illumina Hi Seq2000第二代测序技术成功地发现了FBN1的新突变。该方法快速而有效,对腹主动脉瘤分子病因学有更好的认识。     

先天性心脏病相关PITX2c基因新突变研究

目的:研究先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)相关PITX2c基因的新突变。方法:收集150例CHD患者和200名正常对照者的外周静脉血标本,使用DNA纯化试剂盒分离基因组DNA。使用DNA聚合酶扩增PITX2c基因的编码区和剪接位点,应用DNA测序试剂盒在DNA分析仪上对扩增片段进行测序。将所测序列与GenBank数据库中的PITX2c基因序列进行比对以发现PITX2c基因突变。使用在线程序MUSCLE分析突变氨基酸的保守性,分别应用MutationTaster和PolyPhen-2分析突变氨基酸的致病性。结果:在1例散发性CHD患者发现了1个新的PITX2c基因杂合错义突变,即p.S101G突变,突变率约为0.67%。该错义突变不存在于200名正常对照者。跨物种PITX2c蛋白之氨基酸序列对比显示第101位的丝氨酸在进化上完全保守,致病性预测显示所发现的PITX2c基因变异是致病性突变。结论:本研究揭示了CHD相关PITX2c基因新突变,对于制定新的CHD防治策略具有潜在的意义。     

家族性血脂异常LPL基因新突变位点分析

目的:对收集的1例血脂异常家系的致病基因进行全外显子测序,确定其突变基因位点。方法:收集在我院就诊的1例血脂异常患者及其家系成员的临床资料,采集患者及相关家系成员外周血样本并提取基因组DNA,利用目标外显子捕获技术和二代测序技术对先证者的与血脂异常有关的基因进行基因突变筛查,并使用Sanger测序法验证可疑突变位点并筛查患者家系成员和100例健康人,确定该家系患者的致病突变基因,使用Polyphen2、MutationTaster、SIFT和Provean这4种软件进行突变基因功能检测,并利用Swiss-Model软件分析突变前后的蛋白质三维结构模型。结果:在受检人样品中检测到LPL基因的纯合变异c.1322+1GA(编码区第1322+1位核苷酸由G变为A),在其子女样品中检测到LPL基因同位点的杂合变异。4种预测软件均预测该突变为有害突变,Swiss-Model软件结果显示该突变位点导致442位的缬氨酸突变为终止密码子,可能影响蛋白质的剪切和活化功能。结论:本研究应用全外显子测序技术在一血脂异常家系中发现LPL基因新的突变位点:LPL c.1322+1GA。该突变可能是患者家系发生高三酰甘油血症的致病因素,且可能导致更严重的冠心病。此位点目前在我国人群中少见文献报道。     

DSP复合杂合基因突变与扩张型心肌病的发生有关

目的:通过全外显子测序寻找扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)家系的致病基因,分析临床特点及基因突变位点。方法:收集在本院就诊的1例DCM患儿的临床资料,采集患儿及其父母的外周血,抽提血液DNA,进行全外显子测序,寻找致病基因,Sanger测序验证可能的致病基因突变,对其临床特点、实验室检查、基因突变进行综合分析。结果:将测序结果比对分析,多个生物数据库筛选、过滤,发现桥粒斑蛋白(desmoplakin,DSP)基因c.939+1GA和c.4198CT位点发生突变。DSP可能是该家系DCM的致病基因,并且DSP基因第1 400位精氨酸残基在不同物种之间具有高度保守性。患儿左心房、左心室显著增大,左心室收缩功能减低(左心室射血分数为15%,左心室缩短分数为7%)。心电图提示窦性心动过速、心房肥大、T波改变(Ⅰ、V6导联T波倒置)。结论:DSP基因复合杂合突变(c.939+1GA和c.4198CT)与DCM紧密相关。分析临床特点与基因突变,对临床诊断心肌病提供依据。     

WASP基因突变所致Wiskott-Aldrich综合征1例并文献复习

目的:分析1例Wiskott-Aldrich综合征患儿的临床特征、基因突变及蛋白表达。方法:总结患儿的临床特征,提取患儿外周血基因组DNA,针对WASP基因所有编码外显子及外显子和内含子交界处进行PCR扩增测序,并采用流式细胞术(FCW)检测WASP表达。结果:本例患儿具有典型的WAS表型,并伴有自身抗体ANA阳性,临床评分为3分。患儿为WASP基因第8外显子剪接位点突变:c.777+1GA,编码蛋白质终止于aa246;FCW检测WASP表达阴性。结论:本例男性Wiskott-Aldrich综合征患儿具有典型的WAS表型与自身抗体阳性的临床特点,其发病是由少见的WASP基因剪接位点突变所致。     

Nexilin基因多态性与冠状动脉病变程度的关系及机制

目的研究Nexilin基因多态性与冠状动脉病变程度的相关性及可能机制。方法胸痛患者573例,依据冠脉造影结果分为冠心病组344例,正常对照组229例。采用DNA序列测定技术,检测两组研究对象Nexilin基因外显子及外显子/内含子连接区的核苷酸序列。使用测序软件与Gen Bank数据库相关基因序列比对,对SNP位点进行序列分析。根据Gensini评分对冠脉病变程度进行评分,分析Nexilin位点多态性与冠脉病变程度的关系。结果通过Nexilin基因外显子SNP位点的序列分析,共发现2个SNP位点,其中1个为基因库中收录的rs1167781位点,另一个是新发现位点。对rs1167781位点G/A错义突变进行分析,发现冠心病组患者携带A等位基因的频率明显低于正常对照组(P<0.01)。A等位基因频率数量随着Gensini评分增加呈明显下降趋势(P<0.05)。以Gensini评分为终点事件,Logistic回归分析显示rs1167781位点突变型和冠脉病变严重程度独立相关。结论 Nexilin基因rs1167781位点多态性与冠心病患者冠状动脉病变程度存在明显相关性,为冠心病的保护因素。     

生菜污染隐孢子虫卵囊洗脱与巢式PCR检测方法的研究

目的 比较生菜表面污染隐孢子虫卵囊的洗脱与检测方法。方法 对生菜表面人工“种植”的隐孢子虫卵囊的洗脱次数、振荡方式、振荡频率、振荡时间、洗脱液种类等进行比较,以及3种商业化DNA提取试剂盒提取水溶液中隐孢子虫卵囊DNA的效果进行比较。结果 采取往返振荡,振荡频率为100次/min,振荡时间为1 h,洗脱液采用1% Alconox^○R时,其总体回收率最高,达71.40%。不同DNA试剂盒比较显示,土壤DNA提取试剂盒与粪便DNA提取试剂盒较组织DNA提取试剂盒提取水溶液中隐孢子虫卵囊DNA的质与量均高。结论 本研究建立了巢式PCR检测生菜表面微小隐孢子虫卵囊的检测方法,为蔬菜的食品安全提供新的技术方法。     

PAX6基因多态性与精神分裂症的关系探讨

目的探讨PAX6基因多态性与精神分裂症的关系。方法选取270例首发精神分裂症患者（患者组）与320例健康志愿者（对照组）,采用阳性与阴性症状量表（PANSS）评定精神分裂症临床症状;通过检索数据库HapMap,在PAX6基因3’非翻译区（3’-UTR）选取两个标签单核苷酸多态性（SNP）rs3026401、rsl506位点,采用DNA基因组提取试剂盒提取DNA及进行连接酶检测反应（LDR）以测定SNP。采取病例对照研究方法比较两组间SNPrs3026401、rsl506位点基因型和等位基因分布频率。结果患者组（n=262）与对照组（n=318）的SNPrsl506基因型、等位基因分布频率差异无统计学意义;SNPrs3026401基因型、等位基因分布频率组间差异有统计学意义（P均〈0．05）。患者组SNPrs3026401不同基因型的阴性症状评分差异有统计学意义,即GG〉AA、GG〉AG（P均〈0．05）;阳性症状评分、一般精神病理因子评分差异无统计学意义。结论PAX6基因rs3026401多态性可能是精神分裂症的危险因素之一。     

家族性脂蛋白脂酶缺乏症脂蛋白脂酶基因未报道变异及功能学分析

目的:探讨功能学研究在明确高脂血症致病基因未报道变异致病性判读中的有效性。方法:收集患儿及其父母的外周血DNA,利用全外显子组测序(WES)发现致病基因并进行一代测序验证,通过美国医学遗传学会的变异位点解读指南对检测到的变异位点进行分析;针对未报道的变异,分别构建野生型和携带有未报道变异位点的突变型基因的真核表达载体,转染COS-7细胞后,检测两组细胞中脂蛋白脂酶(LPL)的表达、分泌及酶活性。结果:该患者核心家系的WES结果提示,患者LPL基因存在复合杂合变异c.590GA(p.R197H)和c.940GA(p.G314S)。通过变异位点解读指南评估LPL c.590GA(p.R197H)为可能致病变异。未报道变异LPL c.940GA(p.G314S)的功能学实验表明,体外过表达LPL-G314S突变体蛋白,其胞浆内LPL蛋白表达量与野生型相比差异无统计学意义,但分泌量显著减少;LPL酶活性检测显示,LPL-G314S突变体的细胞裂解液和细胞培养液中LPL酶活性均比野生型显著降低。综合证据提示该未报道变异为致病性变异。结合患儿临床表现和遗传诊断结果最终诊断为家族性脂蛋白脂酶缺乏症。结论:功能学实验增强了未报道变异位点致病性判读的证据级别,为遗传诊断和临床确诊提供重要依据。     

腐食酪螨转录组测序及生物信息学分析

目的　获得腐食酪螨转录组数据,为后续基因功能研究奠定基础。方法　基于Illumina HiSeqTM 2000高通量测序平台,对腐食酪螨雌雄混合螨体进行测序,采用Trinity软件组装转录本获得单基因簇（Unigenes）。将单基因簇与非冗余蛋白质序列（RefSeq non?redundant protein sequence,NR）数据库、核苷酸序列（nucleotide sequence database,NT）数据库、Swiss?Prot数据库、京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）数据库、直系同源簇（clusters of orthologous groups,COG）数据库中的蛋白质序列进行比对,对其进行功能注释。将单基因簇按照NR、Swiss?Prot 蛋白库优先级顺序进行编码序列（coding sequence,CDS）比对、预测。利用MISA软件对腐食酪螨Unigenes进行简单重复序列（simple sequence repeats,SSR）位点分析。使用SOAPsnp技术检测螨虫单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）。结果　转录组测序数据质控后获得4.67 Gb高质量数据,组装后获得51 271个单基因簇,总长度为41 848 995 个核苷酸（nucleotide,nt）、平均长度为816 nt。将单基因簇与公共数据库进行比对和功能注释后,得到29 053个有功能注释的Unigenes。预测发现27 443条CDS,检测到23 092个SSR位点信息和148 027个SNP位点信息。结论　通过测序技术建立了腐食酪螨转录组数据库,获得了大量腐食酪螨转录本信息,为后续过敏相关基因功能学研究奠定了基础。     

家族性高胆固醇血症患者低密度脂蛋白受体基因新的突变类型一例

目的：分析一例家庭性高胆固醇血症患的低密度脂蛋白受体基因突变位点。方法：以患儿的基因组DNA为模板，用聚合酶链反应（PCR）扩增该基因的18个外显子。用单链构象多态性（SSCP）方法分析检测PCR产物，对电泳结果异常进行DNA测序。结果：单链构象多态性分析发现患儿第10外显子存在一异常条带。DNA测序证实患儿第10外显子发生N515S纯合错义突变。结论：该病例为一个新的LDLR突变位点；聚合酶链反应－单链构象多态性分析（PCR－SSCP）可用于该突变位点的诊断。     

CD86基因启动子－3479 A／C 位点单核苷酸多态性与 ITP 遗传易感性的关系

目的：探讨CD86基因启动子－3479 A／C位点（ rs2715267）单核苷酸多态性与原发免疫性血小板减少症（ ITP）遗传易感性的关系。方法收集93例成人慢性ITP患者（ ITP组）及119例健康对照者（对照组）,提取两组外周血DNA,采用位点特异性PCR进行DNA分型检测。分型结果通过DNA测序方法进行验证。结果 CD86基因启动子－3479 A／C位点基因型AA、AC和CC在ITP组的分布频率分别为40．9％、52．6％及6．5％,在对照组的分布频率分别为49．6％、37．8％及12．6％,两组比较P 均＞0．05;等位基因A和C在ITP组的分布频率分别为67．2％、32．8％,在对照组的分布频率分别为68．5％、31．5％,两组比较P均＞0．05。两组同性别CD86基因启动子－3479 A／C位点等位基因及基因型的分布频率比较P均＞0．05。根据糖皮质激素治疗效果将ITP患者进行分组,结果显示,激素有效组、激素无效组CD86基因启动子－3479 A／C位点等位基因及基因型的分布频率比较P均﹥0．05。结论 CD86基因启动子－3479 A／C位点的单核苷酸多态性可能与ITP的遗传易感性无关。     

干扰素-γ基因+874位点及肿瘤坏死因子-α基因-238位点单核苷酸多态性与HBV宫内感染相关性研究

目的:研究IFN-γ+874位点T/A以及TNF-α-238位点G/A的单核苷酸多态性与HBV宫内感染的相关性。方法:采集HBV标记物单项或多项阳性孕妇的外周血,提取基因组DNA,根据新生儿是否感染HBV将孕妇分为宫内感染组和对照组。利用等位基因特异性PCR检测IFN-γ+874位点等位基因型,利用PCR-RFLP方法检测TNF-α-238位点等位基因型。结果:等位基因特异性PCR可以准确判断IFN-γ+874位点等位基因型,对照组IFN-γ+874位点等位基因频率A为0.562,T为0.438,而宫内感染组A为0.738,T为0.262,两组之间的差异具有统计学意义(χ2=4.38,P=0.036)。TNF-α-238位点等位基因型的检测可以使用PCR-RFLP方法,对照组TNF-α-238位点等位基因频率A为0.146,G为0.854,宫内感染组A为0.262,G为0.738,两组之间的差异无统计学意义(χ2=3.26,P=0.071)。结论:IFN-γ+874位点T/A等位基因与HBV宫内感染具有一定相关性,T等位基因对胎儿HBV宫内感染具有防护作用。TNF-α-238位点G/A等位基因型与HBV宫内感染的关系尚不明确。