提取陈旧阳性血膜疟原虫DNA方法的研究

目的建立一种能够提取陈旧阳性血膜疟原虫DNA的方法,为疟原虫基因溯源研究奠定基础。方法应用DNA抽提试剂盒(QIAampDNA Mini Kit)改良后提取41份吉氏染色镜检阳性血膜的疟原虫DNA,并与Chelex-100和Na2HPO4法进行比较。巢式PCR扩增疟原虫SSU r RNA基因片段,鉴定疟原虫虫种。PCR结果进行测序和序列比对,统计分析20世纪80年代与近10年血膜、不同血膜处理方法以及不同质量血膜的PCR阳性检出率差异。结果改良试剂盒法PCR结果总阳性检出率为70.7%(29/41)。80年代和近10年血膜PCR阳性检出率分别为78.6%(11/14)和66.7%(18/27),两组间差异无统计学意义(χ2=0.63,P0.05)。经去油、脱色处理和未经处理组血膜的PCR阳性检出率分别为62.5%(15/24)和82.4%(14/17),两组间差异无统计学意义(χ2=1.89,P0.05)。质量较好和较差血膜的PCR阳性检出率分别为93.3%(28/30)和9.1%(1/11),两组间差异有统计学意义(χ2=27.59,P0.01)。测序结果表明扩增目的片段与预期结果一致。Chelex-100和Na2HPO4法PCR未能扩增出特异性目的条带。结论试剂盒(QIAampDNA Mini Kit)改良法提取80年代血膜疟原虫DNA可获得较高PCR阳性检出率,且染色剂和镜检油渍对血膜疟原虫DNA提取效果无明显影响。     

从Giemsa染色的血膜中扩增间日疟原虫DNA方法探讨

目的 建立从Giemsa染色的血膜中提取疟原虫DNA的方法。 方法 分别采用Na₂HPO₄法和Chelex-100离子交换法，经过反复优化，提取血膜中的DNA，进行套式PCR扩增鉴定PvMSP-1等位基因型。 结果 用Na₂HPO₄法和Chelex-100离子交换法分别提取40张不同类型的间日疟原虫阳性血膜DNA，未染色的厚血膜全部扩增出目的基因条带，而染色的薄血膜未能扩增出目的基因条带。两种方法均可检测红细胞间日疟原虫感染率≥0.01％的血涂片。 结论 从多年保存的标准血膜中提取疟原虫DNA进行基因型鉴别是可行的。     

Chelex法从恶性疟原虫薄血涂片提取DNA的基因诊断

目的 建立从恶性疟原虫薄血涂片中提取DNA进行恶性疟原虫18S RNA基因套式PCR检测方法 ,并探讨其可行性.方法 利用螯合型的离子交换树脂Chelex-100作为介质,一步法分别提取患者染色和未染色薄血涂片恶性疟原虫DNA,行套式PCR扩增.以培养的不同浓度恶性疟原虫制备的染色和未染色薄血涂片提取恶性疟原虫DNA为模板进行PCR扩增,检测该方法的灵敏度.结果 用Chelex-100法提取恶性疟原虫患者染色与未染色薄血膜DNA,PCR扩增均出现205 bp特异扩增片段.染色及未染色薄血膜恶性疟原虫PCR扩增的最低虫体浓度分别为1.5×101/μL血和1.5×10-1/μL血.结论 Chelex-100法薄血涂片中提取微量DNA的套式PCR检测方法,可在基因水平检测存档的薄血涂片标本.为恶性疟疾的临床实验室诊断和分子流行病学研究提供了新方法.     

微小隐孢子虫卵囊DNA提取及用于PCR检测

目的采用3种方法提取微小隐孢子虫卵囊DNA,并用于PCR检测以进行比较。方法 微小隐孢子虫卵囊经多次冻融加热破壁后,采用螯合树脂(Chelex-100)、酚/氯仿和基因组DNA纯化系统试剂盒3种方法提取微小隐孢子虫卵囊DNA,并根据微小隐孢子虫基因序列(L16996)设计一对寡核苷酸引物,分别对3种方法制备模板进行PCR扩增分析。Chelex-100提取的DNA也用于观察PCR检测的敏感性。结果3种方法制备的微小隐孢子虫卵囊模板用于PCR检测均获得1条446 bp条带,Chelex-100提取的DNA用于PCR检测的敏感性至少达0.5个卵囊。结论3种方法提取的微小隐孢子虫卵囊DNA均可用于PCR检测,Chelex-100法是一种高效而快速的微量提取DNA方法,适用于对隐孢子虫DNA的检测。     

巢式PCR技术在输入性卵形疟诊断中的应用研究

目的应用巢式PCR扩增小亚单位核糖体核糖核酸(18S r RNA)基因确诊卵形疟原虫感染。方法采集2012-2013年山东省疟疾患者全血和滤纸血样,吉氏染色镜检观察血膜疟原虫形态并鉴定虫种。提取血样中DNA,根据疟原虫18S r RNA基因以属和种特异性引物进行巢式PCR扩增,筛查卵形疟阳性标本并进行测序验证。结果2012和2013年山东省共筛查到7例输入性卵形疟原虫感染病例。巢式PCR扩增7份血样均在800 bp处出现卵形疟原虫特异性单一条带,Blast比对表明产物序列与Gen Bank卵形疟参考序列一致。结论经巢式PCR方法确诊了2012和2013年山东省7例输入性卵形疟病例。     

聚合酶链反应技术与镜检法诊断间日疟的对比研究

目的　评价聚合酶链反应技术在间日疟诊断中的应用价值。　方法　根据红内期疟原虫 SSUr RNA编码基因序列 ,设计合成 1对引物 ,采用聚合酶链反应技术 ,扩增检测“四热”病人血样中间日疟原虫 DNA;同时作厚血膜镜检疟原虫。　结果　从间日疟患者血样中扩增出 341bp的 DNA片段 ,与预期的扩增片段大小相符 ,而正常人血样及空白对照无特异性条带 ;对于 2 34份“四热”病人血样 ,PCR法检出 16份阳性 ,阳性率为 6 .8% ;厚血膜镜检 13份阳性 ,阳性率为 5 .6 % ;两种方法相比差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ;对于 3份 PCR阳性而镜检法阴性的血样 ,重新作 PCR,结果仍然为阳性。以镜检法为标准 ,PCR法的灵敏度为 10 0 % ,特异度为 98.6 %。　结论　PCR技术灵敏特异 ,可替代镜检法用于间日疟感染的临床及现场检测。     

基于线粒体细胞色素氧化酶亚单位3基因鉴定贵州省首例输入性卵形疟病例

提取贵州省首例镜检诊断为输入性卵形疟病例的血样DNA,以疟原虫的核糖体RNA小亚基(SSU r RNA)和线粒体细胞色素氧化酶亚单位3基因(cox3)为靶标,分别设计属、种特异性引物及种特异性引物, PCR扩增、测序,比较2种引物对疟原虫种类PCR鉴定的特异性。以卵形疟原虫wallikeri亚种参考序列(GenBank登录号:HQ712053.1)和curtisi亚种参考序列(GenBank登录号:HQ712052.1)为模板,应用DNAMAN V6软件对扩增序列进行Blast比对。利用Mega 7.0.26软件,采用邻接法,基于疟原虫线粒体cox3基因DNA序列构建系统进化树。PCR结果显示,基于疟原虫SSU r RNA属、种特异性引物扩增,仅获得1 200 bp的属特异性条带,未出现种特异性条带。基于疟原虫cox3种特异性引物扩增,可获得880 bp的目的条带。Blast比对结果显示,PCR扩增获得的cox3基因序列与卵形疟原虫wallikeri亚种和curtisi亚种的序列一致度为99.4%和97.4%。     

PCR检测蚊体内恶性疟原虫子孢子方法的建立

为建立能检测蚊体内恶性疟原虫的聚合酶链反应技术 ,根据恶性疟原虫 CSP基因序列 ,设计合成 1对引物 ,以 Chelex- 10 0煮沸法制备 DNA模板 ,采用 PCR方法 ,恶性疟原虫子孢子模板预期被扩增出 2 45 bp的 DNA条带 ,并将该法与蚊虫解剖镜检子孢子方法相比较。结果经人工感染恶性疟原虫的 31只大劣按蚊中 14只 PCR阳性 ,被扩增出预期大小的 DNA片段 ,其余 17只 PCR阴性 ;以该技术检测野外捕捉的 98只按蚊 ,结果均为阴性。 PCR法与解剖镜检法相比较 ,检测结果完全符合 ;相当于 1/ 10个阳性蚊子的模板即可满足 PCR检测。该检测体系灵敏、特异 ,对于蚊体内恶性疟原虫的检测具有一定的应用价值     

乐山市1例输入性三日疟的实验室检测与诊断

目的对2016年乐山市1例输入性疑似三日疟疟疾病例进行实验室检测与诊断分析。方法收集该病例的临床资料,并进行流行病学调查。按照《疟疾的诊断》(WS259-2015)的要求,对疑似三日疟患者采集血样后制作血涂片染色镜检、进行疟疾快速诊断检测(RDT)和上送干血斑到四川省疾病预防控制中心进行巢式PCR检测并进行测序比对。结果该患者外周血涂片镜检厚血膜查见疟原虫,薄血膜中查见少量疟原虫,虫体分期主要为小滋养体期、大滋养体期和未成熟裂殖体期,其中大滋养体期、未成熟裂殖体中疟色素呈深褐色、粗大、沿边缘分布,同时被寄生的红细胞不涨大,镜检结果判定为三日疟原虫;RDT检测结果提示为感染除恶性疟以外的其他三种疟疾(三日疟、卵形疟、间日疟)的单项感染,四川省疾病预防控制中心对干血斑中的DNA使用巢式PCR进行检测,扩增出与三日疟原虫阳性对照一致的条带;将基因扩增产物送至成都市擎科生物股份有限公司测序并进行在线Blast序列分析比对,与三日疟原虫阳性对照的基因序列同源性为96%。结论根据实验室联合使用镜检、RDT和巢式PCR3种方法进行检测,结果为三日疟原虫,同时结合患者的流行病学史和临床症状确定该患者为境外输入性三日疟原虫感染病例。     

1例国内罕见的输入性卵形疟的实验室检测

目的对1例输入性疑似疟疾患者的血样进行实验室检测。方法制备疑似疟疾患者血样的血涂片,吉姆萨染色后进行疟原虫的镜检观察。利用实验室自行研制的疟原虫属特异性（通用型）和4种疟原虫种特异性的巢式PCR和实时荧光PCR检测方法,对该血样进行疟疾检测及分型。将PCR扩增片段进行序列测定,并与已知的卵形疟序列进行blast比对分析。结合血样的分子生物学检测结果,重新对镜检结果进行复核。结果血样初次镜检为疟疾阴性。使用疟原虫巢式PCR通用引物对血样的DNA进行PCR检测,扩增出了预期大小约240bp的条带;巢式PCR分型检测表明,血样仅扩增出预期大小约450bp的卵形疟条带,无对应大小的恶性疟、间日疟和三日疟扩增条带产生。疟原虫通用型和卵形疟特异性的荧光PCR检测结果均为典型的S形阳性曲线,卵形疟扩增片段的熔解温度为72.5℃。序列分析表明,扩增片段长度为434bp,blast比对发现去除引物后的393个碱基与GenBank DQ845247等卵形疟的SSU rRNA对应部分的基因序列同源性为100%。重新对血涂片进行镜检复核,结果在薄血膜中发现了卵形疟的环状滋养体,被寄生的红细胞为椭圆形,边缘呈伞矢状。结论使用巢式PCR、实时荧光PCR、序列分析和镜检等方法,证实该例输入性的疑似疟疾患者为卵形疟原虫感染。     

Identification of human malaria parasites and detection of mixed infection in Thai patients by nested PCR

The species-specific nested PCR previously described by Snounou and others, for detecting the four species of human malaria parasites, is evaluated in the current study testing 40 blood samples from malaria patients admitted during July-September, 2003, at the Hospital for Tropical Diseases, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, Thailand. Parasite DNA of each blood sample was extracted and purified by QIAamp. DNA mini kit. Nested PCR was performed using genus-specific primers for the first PCR cycle and species-specific primer for the second cycle. Thin and thick smears were also made, stained with Giemsa, and examined by expert microscopists. Only one of 40 samples (2.5%) was identified as Plasmodium malariae infection by both microscopy and nested PCR. Twenty blood samples (50%) were identified as Plasmodium falciparum infections by both methods. However, 19 blood samples (47.5%) were reported as Plasmodium vivax infections by microscopic methods, whereas nested PCR could detect a mixed infection of Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum in one sample taken from a young girl with 8 ameboid trophozoites of P. vivax per 200 white blood cells. These results demonstrated that the nested PCR assay surpasses microscopy and also offers a clear advantage in the detection of mixed infections, which is important not only for successful medical treatment, but also for the study of malaria epidemiology.     

Recovery and use of Plasmodium DNA from malaria rapid diagnostic tests

The purpose of this study was to show that individual malaria rapid diagnosis tests (MRDTs) could also be used to isolate Plasmodium DNA for genetic studies. We extracted and amplified Plasmodium DNA using two commercial MRDT kits. Phenol/chloroform extraction followed by a nested polymerse chain reaction (PCR) can be used to identify Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax from MRDTs. The PCR on MRDT-isolated DNA was more sensitive than antigen capture by MRDT. Satisfactory results were also obtained if older MRDT tests were used, even after long periods of storage at ambient temperature, with no special preservation.     

套式PCR扩增特定SSU rRNA基因片段检测四川疟原虫感染的研究

目的用套式PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。方法以疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸（SSUrRNA）基因为靶基因,选用1对疟原虫属特异性引物和4对种特异性引物,建立套式PCR扩增系统并用于四川省疟疾病人血样的检测。结果从间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出104bp、102bp和115bp预期大小的特定扩增带。61份血样检测结果与镜检的间日疟阳性符合率为100％。并查出镜检漏诊的2例P.v.和P.m.的混合感染及1例P.v.、P.f.和P.m.的混合感染病例。结论本系统特异、灵敏、稳定、简便,可在诊断疟疾的同时判定混合感染,故对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控有实际应用价值。     

间日疟原虫环子孢子蛋白基因型的鉴别研究

[目的 ]建立间日疟原虫环子孢子蛋白 (CSP)基因分型法用于地理株的鉴定。[方法 ]Chelex 10 0离子交换法提取滤纸血样中的微量DNA ;套式PCR和等位特异PCR技术、琼脂糖电泳分析法、斑点印迹和Southern印迹 探针杂交技术分别用于判别性片段的扩增、分析和鉴定。[结果 ]用本文描述的套式 等位 特异PCR分型法 ,从一小片滤纸血样提取的微量DNA中 ,扩增出不同长度范围的 3种判别性片段 :6 5 0～ 770bp(间日疟种特异 ) ,15 0～2 30bp(温带族特异 ) ,5 88～ 6 15bp(PV 2型特异 )。用本法检测参考虫株出现的带型和长度与设计的靶序列完全吻合。检测 5 9份国内感染血样 ,42份鉴定为温带族虫株 ,15份为热带族虫株 ,2份为PV 2型虫株。 4份境外感染血样中 ,2个巴基斯坦分离株均为温带族 ,缅甸和老挝各 1株均为热带族虫株。 [结论 ]①本法能同时区分PV 1型 ,PV 2型以及温带族与热带族虫株 ,且较现有 (PCR 探针杂交 )法更为简便、快捷 ;②现场血样初步检测结果显示 :我国存在PV 1型 (温带族与热带族 )虫株和PV 2型虫株 ,也可能存在温带族东南亚组虫株。     

套式PCR扩增SSU rDNA特定片段检测云南金平县疟原虫感染的研究

目的　采用套式 PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。　方法　采用已建立的套式 PCR系统扩增 SSU r DNA特定片段检测云南金平县恶性疟镜检阳性患者的 6份血样 ,并设阳性与阴性对照。　结果　间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出 10 4 bp、10 2 bp和 115 bp预期大小的特定扩增带。正常人血、人源弓形虫、杜氏利什曼原虫 DNA及灭菌双蒸水均未产生特异扩增带。 6份血样中检出 4份 P.v.、P.f.和 P.m.的混合感染 ,1份 P.v.和 P.f .及 1份 P.f .和 P.m.的混合感染。　结论　该系统特异、灵敏、稳定 ,在诊断疟疾的同时可准确地判定混合感染 ,对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控等具有实际应用价值。     

A single-step,PCR-based method for the detection and differentiation of Plasmodium vivax and P. falciparum

The ability to detect and differentiate between Plasmodium falciparum and P. vivax is of great importance for the routine laboratory diagnosis of malaria, donor-blood screening and epidemiological studies. Most PCR-based methods for the discrimination of these two species require nested protocols or an additional hybridization reaction, leading to high labour costs and long turn-around times. A simple, time-effective and yet sensitive and specific technique, based on a multiplex PCR, has now been developed for the simultaneous detection and differentiation of P. falciparum and P. vivax in blood samples. Compared with the 'gold standard' of microscopy, this method had a sensitivity and specificity of 100%, with a detection limit of just one P. falciparum or three P. vivax parasites/microl blood.     

Two cases of mixed infection of malaria diagnosed by PCR method

We here reported two Japanese cases of mixed infections of plasmodium species, whose DNAs were detected using the PCR test. One case was a 31 year-old male, who presented fever and fatigue, and had a travel history to Kenya, Cameroon and Indonesia. Smear test of his peripheral blood found the presence of Plasmodium vivax, while nested-PCR diagnosis detected the DNAs both P. vivax and Plasmodium malariae. The other was a 54 year-old female suffering from general fatigue. She had been treated with chloroquine for falciparum malaria in Indonesia two weeks before. Malaria antigen test showed positive although no Plasmodium organisms were found in the smear test. The nested PCR detected the DNA of Plasmodium ovale in addition to that of Plasmodium falciparum. In conclusion, the PCR test is helpful and useful for detection of mixed infections of Plasmodium species.