曲古菌素A抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移的研究

目的观察曲古菌素A（trichostatin A,TSA）体外抑制血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖、迁移和诱导凋亡的作用。方法采用MTT比色法和BrdU掺入法,观察TSA对胎牛血清诱导的VSMCs增殖的抑制作用。采用流式细胞术和Western blot检测细胞周期蛋白的表达,观察TSA对VSMC细胞周期的影响。采用ELISA法测定DNA片段和Western blot检测活化caspase3的表达,观察TSA诱导VSMC发生凋亡的作用。结果100μg/L TSA可抑制胎牛血清诱导的VSMC增殖而无明显的细胞毒作用,1000μg/L TSA可激活caspase3并诱导VSMC发生凋亡。TSA干预可延缓胎牛血清诱导的VSMC进入S期,此效应与抑制周期蛋白cyclin D1和周期蛋白cyclin A的表达有关。TSA能抑制胎牛血清诱导的张力纤维F-actin解聚和重组,抑制VSMC迁移。结论TSA能抑制胎牛血清诱导的VSMC增殖,使之停滞于静止期,大剂量TSA可诱导VSMC凋亡,并能抑制VSMC迁移。因此,TSA有望成为治疗血管增殖性疾病的一种新策略。     

同型半胱氨酸促进血管平滑肌细胞增殖的机制及辛伐他汀的干预作用

目的:探讨同型半胱氨酸促进大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的机制及辛伐他汀的干预作用。方法:贴壁培养的大鼠原代VSMC随机分为3组。(1)对照组:用含10%胎牛血清的DMEM培养基(完全培养基);(2)同型半胱氨酸组:在完全培养基中加入同型半胱氨酸(0.05 mmol/L);(3)辛伐他汀组:在完全培养基中加入同型半胱氨酸(0.05 mmol/L)和辛伐他汀(10μmol/L)。培养24 h后,光学显微镜下观察各组细胞的形态;采用半定量PCR法检测c-myc、P27kip1的mRNA水平;用Western blot检测细胞周期蛋白(cyclin)D1、cyclin E、cyclin A和核增殖抗原(PCNA)的蛋白表达水平。结果:与对照组相比,同型半胱氨酸组c-myc mRNA水平上调,P27kip1 mRNA水平下调,下游cyclin D1、cyclin E、cyclin A和PCNA蛋白表达增加。与同型半胱氨酸组相比,辛伐他汀组上述检测指标均得到逆转。结论:同型半胱氨酸可促进大鼠VSMC c-myc、cyclin D1、cyclin E、cyclin A等增殖相关基因的表达,抑制P27kip1表达。辛伐他汀可逆转上述效应。     

同型半胱氨酸对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖及增殖细胞核抗原基因表达的影响

目的研究同型半胱氨酸（Hcy）对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖及增殖细胞核抗原基因（cyclin D1）mRNA表达的影响。方法采用同位素技术测定3^H-TdR参入法和核酸分子杂交技术检测大鼠主动脉平滑肌细胞增殖及增殖细胞核抗原基因（cyclin D1）mRNA表达的水平。结果Hcy能促进VSMC增殖，并且具有剂量效应关系，同时可增加cyclinD，mRNA表达水平3.2倍。结论Hcy促进VSMC增殖可能是通过增加cyclin D1 mRNA表达水平的途径实现的，使静止期细胞进入细胞分裂周期，从而促进VSMC迅速增殖。     

可罗卡林对血管平滑肌细胞增殖及c-myc基因表达的影响

目的：观察对大鼠主动脉平滑肌细胞起负调节作用的可罗卡林(cromakalim对同型半胱氨酸(hcy)刺激的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)增殖及c—myc基因表达的影响。方法：在建立hcy诱导的平滑肌细胞增殖模型后，应用流式细胞术观察VSMC增殖周期的变化；并用免疫细胞化学方法观察可罗卡林对VSMC增殖及c—myc基因蛋白表达的影响。结果：可罗卡林使VSMC处于G0／G1期的细胞数显著增多(P＜0．01)，S期G2 M期的细胞数显著减少(P＜0．01．)，能够抑制hcy诱导的VSMC增殖和c—myc基因蛋白表达的增加。结论：可罗卡林对hcy诱导的VSMC增殖有显著的抑制作用，其作用机制与抑制c—myc基因表达有关。     

缬沙坦对血管平滑肌细胞迁移及丝裂原活化蛋白激酶的影响

目的观察缬沙坦（Val）对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激下大鼠血管平滑肌细胞（VsMC）迁移及磷酸化42／44丝裂原活化蛋白激酶（p42／44MAPK）表达的影响。方法组织贴块法培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,tran-sweⅡ小室检测细胞的迁移能力,免疫印迹法检测p42／44MAPK蛋白表达的水平。结果（1）AngⅡ能明显促进VSMC迁移,该作用可被Val和MAPK激酶的特异性抑制剂PD98059所抑制。（2）AngⅡ刺激VSMC5min时,p42／44MAPK的表达量最大,该作用可被Val和PD98059所抑制。（3）Val单独作用于VSMC时,对细胞的迁移及p42／44MAPK的表达均无明显影响。结论Val抑制AngⅡ诱导的VSMC迁移与其抑制AngⅡ诱导的p42／44MAPK的表达相关。     

泽泻汤对氧化型低密度脂蛋白诱导血管平滑肌细胞增殖的影响

目的观察泽泻汤对血管平滑肌细胞(VSMC)周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E、增殖细胞核抗原(PCNA)和p27表达的影响,探讨泽泻汤在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的VSMC增殖中的作用和机制。方法通过体外50 mg/L ox-LDL诱导VSMC,建立VSMC增殖的动脉粥样硬化细胞模型;应用空白血清及20%泽泻汤含药血清干预。MTS法检测泽泻汤含药血清对VSMC增殖的影响;Western blot检测增殖相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E、PCNA和p27表达水平。结果 50 mg/L ox-LDL可明显诱导VSMC增殖。与ox-LDL组比较,泽泻汤含药血清可显著抑制ox-LDL诱导的VSMC增殖,下调细胞Cyclin D1、Cyclin E和PCNA的表达,同时促进p27蛋白表达。结论泽泻汤具有抗VSMC增殖的作用,机制可能与上调p27蛋白和抑制Cyclin D1、Cyclin E、PCNA表达有关。     

丹参酮ⅡA对兔动脉粥样硬化病灶凋亡相关基因表达的影响

目的差异筛选丹参酮ⅡA诱导血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡相关基因葡萄糖调节蛋白78(GRP78),观察其在动脉粥样硬化(AS)病灶中的表达情况,探讨丹参酮ⅡA抗AS的可能机制。方法建立同型半胱氨酸(HCY)诱导的兔VSMC增殖模型,与不同浓度丹参酮ⅡA共同培养48 h后,MTT法检测细胞增殖能力;RT-PCR筛选差异基因片段,克隆、鉴定、测序,组织原位杂交观察该基因在正常及AS病变组织中的表达水平。结果不同浓度的丹参酮ⅡA都可抑制HCY所诱导的VSMC增殖;筛选出全长648 bp的基因片段与兔GRP78基因高度同源,组织原位杂交显示该基因在AS病灶VSMC胞质中高表达。结论 GRP78基因参与AS病变形成,上调其表达可能是丹参酮ⅡA诱导VSMC凋亡作用机制之一。     

MiR-92a-3p_R+1和miR-92a-1-5p在ox-LDL诱导大鼠VSMC表型转化和增殖中的作用

目的探讨miR-92a-3p_R+1和miR-92a-1-5p在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化和增殖中的作用及其与ERK1/2信号通路的相关性。方法分离、培养大鼠VSMC,以ox-LDL(50 mg/L)诱导VSMC,采用ERK1/2特异性抑制剂U0126(10μmol/L)阻断ox-LDL(50 mg/L)诱导VSMC的ERK1/2信号激活,MicroRNA微阵列分析VSMC的miR-92a-3p_R+1和miR-92a-1-5p表达,CCK-8法和Brdu流式细胞术检测细胞增殖;免疫荧光法检测VSMC收缩表型标志蛋白SM22α的变化;Western blot检测VSMC的ERK1/2通路信号激活情况(ERK、p-ERK)、表型标志蛋白SM22α、细胞周期相关蛋白(PCNA、cyclin D1、p21、p27)的表达情况。结果 ox-LDL诱导下,VSMC的miR-92a-3p_R+1和miR-92a-1-5p表达明显上调,VSMC的ERK1/2磷酸化水平明显增加,SM22α的表达降低,同时细胞周期相关蛋白PCNA、cyclin D1高表达,p21、p27低表达;ERK1/2通路特异性抑制剂U0126干预后,ERK1/2磷酸化水平受抑制,相应的VSMC miR-92a-3p_R+1和miR-92a-1-5p表达明显下调(P0.05),VSMC增殖显著下降,SM22α的表达上调(P0.05),提示VSMC由合成表型转化为收缩表型,并下调PCNA、cyclin D1的表达,上调p21、p27蛋白的表达(P0.05),说明其表型转化和增殖明显受抑制。结论 miR-92a-3p_R+1和miR-92a-1-5p在ox-LDL诱导VSMC表型转化和增殖中起重要作用,并与ERK1/2信号通路密切相关。     

同型半胱氨酸促血管平滑肌细胞增殖的机制

目的　研究同型半胱氨酸 (HCY)对血管平滑肌细胞 (VSMC)细胞周期、细胞周期素和 P2 7蛋白表达的影响。方法　用流式细胞技术测定细胞周期、细胞周期素和 P2 7蛋白表达量。结果　 HCY促进 VSMC增殖和细胞 S期合成 ,同时使细胞周期素 D、E、A表达明显增加 ,P2 7蛋白表达下降。结论　 HCY促进 VSMC增殖和细胞 S期合成可能是通过增加细胞周期素 D、E、A的表达 ,抑制 VSMC中 P2 7蛋白的表达来实现的。     

粉防已碱对AngⅡ诱导血管平滑肌细胞增殖及NF-κB通路的影响

采用血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导培养Wistar大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞（VSMC），MTT比色法测定粉防已碱（Tet）对血管平滑肌细胞抑制增殖率；考马斯亮蓝法测定蛋白含量；免疫印记法测定NF-κB（p65）及其抑制物（I-κBα）表达；凝胶电泳迁移率分析测定核转录因子-κB（NF-κB）体外活性。发现Tet能显著抑制血管平滑肌细胞增殖；抑制VSMC胞核NF-κB表达，同时抑制胞浆I-κBα磷酸化；同时显著抑制NF-κB体外活性。提示Tet明显抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖，机制与调控NF-κB通路有关。     

丹参酮ⅡA对大鼠血管平滑肌细胞BIP和CHOP表达的影响

目的研究丹参酮ⅡA对同型半胱氨酸(HCY)诱导增殖血管平滑肌细胞(VSMC)内质网应激(ERS)相关基因免疫球蛋白重链结合蛋白(BIP)和C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(CHOP)表达的影响,探讨丹参酮ⅡA促进HCY诱导增殖VSMC凋亡的相关机制。方法大鼠VSMC原代培养、鉴定,建立HCY诱导的细胞增殖模型,用不同浓度的丹参酮ⅡA干预,Annexin/PI双染法检测细胞凋亡率;实时荧光定量PCR检测BIP和CHOP表达量。结果丹参酮ⅡA可促进VSMC凋亡,与HCY组比较差异显著(P<0.05,P<0.01);实时荧光定量PCR检测结果显示,与对照组比较,HCY刺激使BIP和CHOP表达上调(P<0.05,P<0.01);丹参酮ⅡA组剂量依赖性上调VSMC BIP表达,与HCY组比较差异显著(P<0.05,P<0.01);与HCY组比较,0.5 mg/L丹参酮ⅡA处理对大鼠VSMC CHOP表达无明显影响,而1 mg/L丹参酮ⅡA使CHOP表达上调(P<0.05,P<0.01)。结论丹参酮ⅡA可促进HCY诱导增殖的VSMC凋亡,凋亡过程由核转录因子CHOP介导,BIP基因可能是其作用靶点之一。     

p38MAPK介导PDGF-BB诱导的大鼠血管平滑肌细胞MMP-2基因表达

目的　观察血小板源性生长因子BB（PDGF-BB）是否可以诱导大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）基质金属蛋白酶2（MMP-2）基因表达及VSMC的迁移,探讨p38信号通路在这一过程中的作用,为血管重建性疾病的研究提供实验依据。方法　PDGF-BB不同浓度和不同时间刺激体外培养的大鼠VSMC,用放线菌素D、SB202190（MAPK/p38特异性抑制剂）处理PDGF-BB诱导的VSMC。细胞划痕实验检测细胞迁移,运用Real-time　RT-PCR检测MMP-2基因表达水平,Western　blot　检测p38的活性变化。结果　PDGF-BB可促进VSMC迁移,SB202190可抑制PDGF-BB诱导的VSMC迁移。不同浓度PDGF-BB（10　μg/L～50　μg/L）作用VSMC　0.5　h,MMP-2基因表达明显增加,其中以20　μg/L较显著;用20　μg/L　PDGF-BB作用VSMC　0.5　h～4　h,可显著上调MMP-2基因表达,以0.5　h较显著。用放线菌素D和SB202190预处理后MMP-2基因表达降低。PDGF-BB可激活VSMC中磷酸化p38水平,SB202190可抑制　p38的磷酸化以及相应的MMP-2基因表达。结论　p38参与了PDGF-BB诱导的VSMC迁移及MMP-2基因表达。     

N-甲基-D-天门冬氨酸受体和活性氧对血管平滑肌细胞活性的影响

目的研究N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methy-D-aspartate,NMDA)受体和活性氧(reactive oxygen species,ROS)是否参与同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)诱导血管平滑肌细胞活性的增强。方法采用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)合成实验观察细胞的增殖活性,Trans well方法观察细胞的迁移活性,二乙酰二氯氢化荧光素检测平滑肌细胞中ROS水平。结果随Hcy浓度增加,Hcy诱导血管平滑肌细胞增殖、迁移活性增强,呈剂量依赖性,NMDA受体拮抗剂MK801、NAD(P)H氧化酶抑制剂二苯基碘(DPI)、自由基清除剂N-2酰半胱氨酸(NAC)能抑制Hcy诱导的增殖、迁移活性的增强。Hcy刺激后平滑肌细胞ROS水平升高作用能够被MK801、DPI、NAC抑制。结论ROS参与了Hcy诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移活性的增强,并且该途径是通过NMDA受体介导的。     

苯磺酸氨氯地平抑制损伤诱导的血管新生内膜形成

目的 研究苯磺酸氨氯地平(AM)、阿托伐他汀(AT)单独及联合用药对球囊损伤诱导的血管新生内膜形成影响及机制.方法 复制颈总动脉球囊损伤模型,分离颈总动脉制备病理切片,HE染色观察内膜增生情况.免疫组化观察增殖、迁移相关蛋白表达情况.贴块法培养血管平滑肌细胞(VSMC),待生长至70％～ 80％融合时,分别加入不同浓度苯磺酸氨氯地平,继续孵育24 h,细胞计数及Western印迹法用于分析VSMC增殖活性;伤口愈合实验及明胶酶图实验用于分析VSMC迁移活性.结果 AM抑制球囊损伤诱导的血管新生内膜形成和管腔狭窄,与AT联用增强其抑制效果;AM单独及与AT联合用药抑制球囊损伤诱导的PCNA、KLF5、MMP-9 的表达;AM抑制体外培养的VSMC中PCNA、KLF5和c-Jun的表达;降低MMP-2和MMP-9的活性.结论 AM抑制球囊损伤诱导的血管新生内膜形成与其抑制VSMC增殖及迁移活性有关.     

芒柄花素对PDGF-BB所致血管平滑肌细胞迁移和增殖的影响

目的研究芒柄花素（Formononetin,Formo）对血小板源性生长因子BB型（PDGF-BB）所致血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和迁移的影响并探讨其可能的机制。方法组织块贴壁法培养SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞,结晶紫染色法观察芒柄花素（0.3、1、3、10μM）对PDGF—BB（40ng/ml）所致的VSMC增殖的影响;BrdU摄取法考察芒柄花素对PDGF—BB所致DNA合成率的影响;划痕实验研究芒柄花素对PDGF—BB所致细胞迁移活力的影响;免疫沉淀法检测芒柄花素对PDGFR磷酸化水平的影响。结果芒柄花素在1-10μM浓度范围内呈剂量依赖性抑制PDGF-BB诱导的VSMC增殖和DNA合成（p〈0.05）,芒柄花素在3、10μM浓度下抑制PDGF-BB诱导的VSMC迁移（p〈0.05）。芒柄花素抑制PDGF-BB对PDGFR受体磷酸化的激活作用。结论芒柄花素抑制PDGF-BB诱导的VSMC迁移和增殖,其作用机制可能与其抑制平滑肌细胞上PDGFR受体磷酸化有关。     

川芎嗪对凝血酶诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响

目的观察川芎嗪（Tetramethylpyrazine,TMP）对凝血酶诱导的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）增殖的影响及可能机制。方法酶消化法培养兔胸主动脉VSMC。WST-8比色法、流式细胞仪及免疫细胞化学测定TMP对凝血酶诱导的VSMC增殖、细胞周期及c-fos表达的影响。结果TMP浓度依赖性地抑制凝血酶诱导的VSMC增殖,20mg/L TMP能够抑制凝血酶诱导的VSMC G0/G1期向S期的转变及c-fos表达。结论TMP浓度依赖性地抑制凝血酶诱导的VSMC增殖、机制与其抑制c-fos表达和抑制VSMC细胞周期G0/G1期向S期的转变有关。     

ADAM17调控CGRP对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖的抑制效应

目的阐明肿瘤坏死因子α转化酶(ADAM17)调控降钙素基因相关肽(CGRP)的抗血管平滑肌细胞(VSMC)增殖效应。方法以大鼠源性胸主动脉平滑肌细胞株(A10VSMC)为研究对象,采用RNA干扰抑制ADAM17表达;采用蛋白质免疫印迹和实时定量PCR检测蛋白和mRNA表达水平;采用噻唑蓝比色法评估细胞活性。结果 CGRP显著抑制血管紧张素Ⅱ介导的VSMC增殖。血管紧张素Ⅱ刺激24 h后,VSMC中ADAM17表达显著增加。CGRP预处理30 min能显著降低VSMC中ADAM17表达,而CGRP受体拮抗剂CGRP8-37可抑制或逆转上述效应。ADAM17 RNA干扰可显著抑制血管紧张素Ⅱ介导的VSMC增殖。结论降低ADAM17表达可能是CGRP抑制血管紧张素Ⅱ介导的VSMC增殖效应的机制。     

丝裂素活化蛋白激酶的激活和转核与大鼠 血管平滑肌细胞增殖关系的研究

目的 探讨丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）激活、转核与血管紧张素Ⅱ（AngⅡ)刺激血管平滑肌细胞（VSMC）增殖间的关系。方法 本实验采用培养大鼠胸主动脉VSMC。用^3H-胸腺嘧啶核苷（^3H-TdR)掺入法测定DNA合成,用p43/p44磷酸化抗MAPK抗体的蛋白免疫印迹法测定MAPK蛋白量,用免疫细胞化学技术观察MAPK活化并转位入细胞核的过程。结果 （1）AngⅡt和PD98059的上述作用都呈剂量依赖性。（2）AngⅡ对MAPK蛋白表达有显著增强作用。此作用同样被PD98059以剂量依赖方式抑制。（3）AngⅡ刺激5min后,MAPK出现在VSMC的细胞浆中,30min时MAPK进入细胞核,3h后MAPK染色从核内消失,上述MAPK转核过程被PD98059抑制。结论 本实验证实人细胞核,3h后MAPK染色从核人消失,上述MAPK转核过程被PD98059抑制。结论 本实验证实AngⅡ能激活培养大鼠主动脉VSMC的MAPK,活化的MAPK从细胞浆转位进入细胞核导致VSMC增殖。     

心肌素抑制血管平滑肌细胞表型转换改善动脉粥样硬化

动脉粥样硬化(As)是一种涉及多种细胞并由多种因素诱导的慢性疾病,血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖、迁移对As的发生和发展有着不可忽视的影响,包括促进斑块的生成及诱发斑块的不稳定等。VSMC由收缩表型向合成表型转换是其增殖和迁移的基础,维持VSMC的收缩表型,抑制其合成表型的形成有助于抑制其异常增殖和As斑块的形成。心肌素作为VSMC收缩标志基因的关键转录因子,能与血清反应因子结合来激活VSMC收缩标志基因的表达。多种功能因子,如雌激素受体α、组蛋白修饰、DNA甲基化和microRNA等,都可以与心肌素联合作用调节血管的功能并抑制VSMC的表型转换;多种作用途径,例如转化生长因子β1、血小板衍生生长因子BB等信号通路,可增加心肌素表达,抑制VSMC的增殖和迁移。因此,心肌素在As发展过程中有着至关重要的保护作用。调控心肌素影响VSMC的表型转换可能成为未来治疗As乃至心血管疾病的新策略。     

同型半胱氨酸经由N-甲基-D-天冬氨酸受体-Cyclin D通路诱导血管平滑肌细胞增殖

目的探讨同型半胱氨酸可否经由N-甲基-D-天冬氨酸受体通路诱导血管平滑肌细胞增殖及其可能的终末靶分子。方法以同型半胱氨酸诱导血管平滑肌细胞增殖,并合用N-甲基-D-天门冬氨酸受体拮抗剂MK801以观察其对血管平滑肌细胞增殖的影响。应用MTT法检测血管平滑肌细胞增殖;流式细胞术测定细胞周期;逆转录聚合酶链反应检测Cyclin D1 mRNA的表达。结果同型半胱氨酸显著刺激血管平滑肌细胞增殖、促进血管平滑肌细胞从G0/G1向S期转换,并上调Cyclin D1 mRNA的表达。而N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂MK801同步抑制血管平滑肌细胞增殖及血管平滑肌细胞从G0/G1向S期转换,同时降低Cyclin D1 mRNA的表达,上述效应皆具明显的剂量-效应关系。结论同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞的促增殖效应可能部分是通过N-甲基-D-天冬氨酸受体介导,并最终经由Cyclin D通路实现。