心肌样细胞和聚乳酸-聚乙醇酸共聚物在体内构建工程化心肌组织

目的 探索以骨髓间充质干细胞（BMMSCs）诱导分化的心肌样细胞为种子细胞、以聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA）作为支架材料,在大鼠体内构建工程化心肌组织的可实施性。 方法 分离培养大鼠BMMSCs,取第3代细胞用5-氮胞苷和血管紧张素Ⅱ联合诱导24 h继续培养3周,将诱导分化的心肌样细胞种植到PLGA支架上形成移植物,在孵箱里孵育3 d,然后将其移植到预先制备好的大鼠腹膜腔囊袋之中。4周以后,取出移植物并采用HE染色观察心肌样细胞的形态特征、用免疫组织化学染色法检测工程化心肌细胞肌钙蛋白（cTn） I的表达、透射电镜下观察心肌样细胞的形态和结构。 结果 HE染色结果显示,在PLGA支架上可见到梭形的细胞核,且心肌样细胞分布均一;免疫组织化学染色结果显示PLGA-心肌样细胞组绝大多数移植细胞表达心肌特异性蛋白cTnI;透射电镜观察显示,在体内构建的工程化心肌组织中,可以看到肌丝沿细胞的长轴平行排列,胞浆中富含大量的线粒体和内质网,以及桥粒结构、缝隙连接和Z线样物质。 结论 成功的建立了在大鼠体内构建工程化心肌组织的方法。这种体内微环境有助于移植组织或细胞的存活,在大鼠体内构建的工程化心肌组织具有与天然心肌组织相似的结构。     

催产素诱导去分化脂肪细胞向心肌细胞方向分化

目的:检验催产素能否将去分化脂肪(DFAT)细胞诱导分化成为心肌样细胞。方法: 从脂肪中分离成熟的脂肪细胞,通过天花板培养使成熟脂肪细胞去分化为DFAT细胞。按照不同诱导的时间(1周、2周、3周)及低中高3个不同浓度的(1×10-8 mol/L、1×10-7 mol/L、1×10-6 mol/L)分组对DFAT进行诱导培养。通过免疫荧光检测法、RT-PCR及Western blot分别在基因水平和蛋白水平上检测心肌特异性标记的表达,以人类心肌组织作为阳性对照,未加诱导的DFAT细胞作为阴性对照。结果: 高浓度的催产素(1×10-6 mol/L)造成实验细胞大量死亡,无法进行后续试验。以1×10-8 mol/L及1×10-7 mol/L浓度的催产素诱导3周后,DFAT细胞在基因及蛋白水平上检测到心脏特异性标记GATA4、Nkx2.5及cTnT的表达,但未发现自主搏动现象。结论: 生理浓度和中等浓度的催产素,可以将 DFAT细胞诱导成为心肌样细胞。     

双丹口服液对体外培养心肌干细胞作用的研究

目的 观察双丹口服液（SOL）对体外分离培养的SD仔鼠心肌干细胞（CSCs）的作用。方法 分离培养CSCs,将培养的第2代CSCs分为对照组及不同浓度1×10-1 mol/L、1×10-2 mol/L、1×10-3 mol/L、1×10-4 mol/L、1×10-5 mol/L和1×10-6 mol/L的SOL组。培养24 h、48 h后用MTT比色法检测SOL对CSCs的影响。将10-2 mol/L SOL组的细胞培养24 h后,用流式细胞仪测定c-kit+/CD45-细胞的比率。结果 消化后的心肌组织3 d后,可见成纤维样细胞从组织块儿周围爬出,1周后可见小、圆、亮的细胞出现在组织块周围爬出的成纤维细胞层上。传代培养后,倒置显微镜下观察细胞形态呈较均一的梭型,可见CSCs形成的"太阳状"集落。MTT法检测表明,与对照组相比,SOL作用后的CSCs生长增殖迅速,当SOL的浓度超过1×10-3 mol/L时,CSCs增殖更为显著(P<0.05)。流式细胞术检测显示,1×10-2 mol/L SOL的细胞培养24 h后,c-kit+/CD45-细胞的比率达到0.976%,与对照组相比（0.301%）,差异具有统计学意义（P<0.01）。结论 利用酶消化可以成功从SD仔鼠心脏组织中分离培养得到c-kit+的CSCs,SOL对CSCs的体外生长和增殖有一定的促进作用。     

具生物活性组织工程血管支架的制备及支架与血管平滑肌细胞的相容性研究

目的 探索缓释血管内皮生长因子(VEGF)的可降解聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)支架的制备及其与血管平滑肌细胞(SMC)的相容性.方法 使用明胶微球做为缓释载体,加载 VEGF 和PLGA 构建组织工程血管支架(VEGF-PLGA)并观察体外 VEGE 释放效果.体外培养大鼠肺主动脉SMC 细胞,随机将培养至第 5 代或第 6 代细胞分为三组:VEGF-PLGA 组、PLGA 组与对照组.并将SMC 种植在 VEGF-PLGA 膜、PLGA 膜片上,对照组不放置膜片.用相差显微镜观察细胞生长情况,采用 MTT 绘制细胞生长曲线,检测细胞增殖和细胞黏附率.结果 (1)VEGF 在体外释放达 14d 以上;(2)SMC 在 VEGF-PLGA 膜片上生长良好;(3)MTT 法检测细胞增殖情况显示,VEGF-PLGA 明显好于其它组(P<0.05),细胞增殖符合细胞生长曲线;(4)细胞黏附率检测显示,三组无明显差异(P>0.05),VEGF-PLGA 对血管平滑肌细胞有良好的相容性.结论 明胶微球载体制备工艺简便,性能优良,VEGF-PLGA 制备方法简便,可在较长时间内持续释放活性 VEGF,对血管 SMC 具有良好的相容性,可用于组织工程血管的进一步构建.     

鼠骨髓间充质干细胞诱导的成骨细胞与3-羟基丁酸/3-羟基己酸共聚物的体外相容性

目的探讨SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)诱导的成骨细胞与3-羟基丁酸/3-羟基己酸共聚物(PHBHHx)支架材料的体外相容性,进一步验证PHBHHx材料作为骨组织工程支架材料的可行性。方法将SD大鼠BMSCs诱导的成骨细胞与PHBHHx支架材料体外复合培养,通过扫描电镜观察细胞与材料的复合情况,用MTT法检测材料对细胞增殖的影响。结果成骨细胞在PHBHHx支架材料表面及孔隙中能较好地黏附和增殖。结论 PHBHHx与成骨细胞有良好的体外相容性,是一种性能优良的骨组织工程支架材料。     

3株肝细胞在硝酸纤维素膜界面上生长的初步研究

目的在体外培养的条件下,观察3株肝细胞在硝酸纤维素膜材料上的生长情况,研究膜的细胞相容性及理化性能的改变,初步探讨硝酸纤维素膜作为一种新的组织工程膜材料用于构建生物人工肝生物反应器中细胞的载体材料的可行性。方法将生物人工肝常用的细胞：肝肿瘤细胞HepG2、C3A、永生化HL7702细胞株分别接种在浸泡处理后的硝酸纤维素膜片上常规培养,在普通光学显微镜以及扫描电镜观察肿瘤细胞在此种膜上的贴壁情况和细胞形态。同时行免疫细胞化学染色和细胞功能检测。结果细胞经常规染色、透明处理后,在光镜下观察到膜上生长的细胞保持了较好的增殖状态及细胞形态;免疫细胞化学染色结果表明,膜上细胞特异性标志物表达良好。培养液上清的生化检测表明培养细胞的主要分泌、代谢功能与常规培养无明显差异;扫描电镜下膜表面细胞呈集落式三维生长,增殖明显。结论硝酸纤维素膜能促进细胞黏附,并且与细胞有良好的相容性。硝酸纤维素膜作为一种良好的细胞黏附生长介质的同时,还具有可以在其上面直接进行相关培养物观察和检测的优点,有望作为一种新的细胞培养介质和生物人工肝反应器中新的膜材料     

二种不同的诱导方法诱导人骨髓间充质干细胞分化的心肌样细胞L型钙电流的变化

目的利用膜片钳技术检测体外两种不同诱导方法诱导人骨髓间充质干细胞(hMSCs)分化为心肌样细胞的L型钙电流(ICa-L)。方法体外培养扩增hMSCs,采用①5-氮胞苷(5-Aza,10μmol/L)化学诱导4周;②原代分离培养SD乳鼠搏动心肌细胞(CMs)制备的心肌微环境诱导10天直至CMs停止搏动。利用膜片钳技术检测两种不同方法诱导分化的心肌样细胞、hMSCs及原代CMs的ICa-L。结果 5-Aza与心肌微环境诱导分化的心肌样细胞较hMSCs的ICa-L增强(112.60±8.26,120.50±9.35pAvs96.67±13.50pA,P均<0.05);低于CMs组(263.86±39.01pA,P<0.01)。结论两种诱导方法诱导的心肌样细胞ICa-L均增强。     

丝裂原活化蛋白激酶在醛固酮诱导心室成纤维细胞增殖中的作用

目的:探讨醛固酮诱导心肌成纤维细胞(CFs)增殖的信号转导机制.方法:用胰酶消化法分离、培养新生大鼠CFs,采用3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法、western-blotting技术从DNA合成、蛋白表达等方面观察MAPK活化与醛固酮促CFs增殖的关系.结果:①醛固酮剂量依赖性促CFs DNA合成,10-5mol/L PD98059 [(782±152)个·min-1] 可逆转 10-7mol/L醛固酮 [(1879±169)个·min-1]的作用;②10-7mol/L醛固酮对活化MAPK蛋白表达有显著增强作用,在4 h达峰作用(8.11±0.46),10-7mol/L 醛固酮的作用(8.11±0.46)被10-5mol/L PD98059 (1.21±0.10, P<0.01)阻断.结论:醛固酮能激活CFs的MAPK,MAPK表达及活化参与醛固酮诱导的CFs增殖.     

体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究

目的观察人骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）体外扩增和定向诱导分化为神经元样细胞的变化,为其临床应用奠定基础。方法采用密度梯度离心法分离BM-MSCs细胞,用MesencultTM培养基和贴壁培养法培养、纯化和扩增细胞,流式细胞术检测细胞表面CD29和CD90分子表达率。采用20 ng/ml重组碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、20 ng/ml新型人表皮生长因子（hEGF）和20 g/L二甲基亚砜（DMSO）、5 mmol/Lβ-巯基乙醇（BME）分别诱导BM-MSCs;采用免疫组化法检测细胞的神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶原纤维酸性蛋白（GFAP）、波形蛋白（VIM）表达情况。结果BM-MSCs细胞增殖迅速,3周可传代培养;BM-MSCs传十代扩增1－2×10^3倍。分离和扩增BM-MSCs CD29、CD90强表达率分别为95.02%、93.81%。药物诱导后的BM-MSCs发生轴突等神经元样细胞变化,阳性表达NSE、GFAP、VIM分子。结论人BM-MSCs能体外培养和扩增,并能定向诱导分化为神经元样细胞。     

螺内酯抑制心肌成纤维细胞增殖的实验研究

目的:研究螺内酯对培养的心肌成纤维细胞增殖的作用,揭示螺内酯抑制心肌纤维化的可能机制。方法:进行新西兰白兔心脏心肌成纤维细胞的培养;测定细胞计数,细胞活性(WST-1分解)和DNA合成(BrdU掺入),并以流式细胞仪测定细胞周期等以表示细胞增殖。结果:不同浓度的螺内酯(2.5×10-7~5×10-5mol/L)分别作用1、3、7 d后,心肌成纤维细胞的数量明显减少,并呈剂量-时间-效应(P<0.01)。细胞经不同浓度螺内酯(2.5×10-7~5×10-5mol/L)作用1 d后,DNA合成、活细胞代谢活性和细胞周期的DNA合成期(S) DNA合成后期(G2) 分裂期(M)的百分比明显减少(P<0.01)。结论:螺内酯可能通过抑制心肌成纤维细胞的增殖而抑制心肌纤维化。     

骨髓间充质干细胞向心肌分化的实验研究

目的:研究骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)分化为心肌样细胞的能力,用于心肌补片治疗心肌梗死的研究。方法:分离C57/BSL小鼠BMSCs,全培养差速贴壁法,经过贴壁培养至第3代,流式细胞仪鉴定细胞表面标志(CD34、CD45、CD73、CD90),经10μmol/L的5-氮杂胞苷诱导细胞,24 h后更换完全培养基培养,2 w后进行免疫荧光染色,荧光显微镜观察心肌钙蛋白T(cTnT)和连接素蛋白43(CX43)的表达。结果:流式鉴定结果显示CD34、CD45阴性,CD73强阳性,CD90弱阳性。免疫荧光染色显示,诱导后细胞高表达心肌细胞特异性蛋白cTnT,连接素蛋白CX43表达水平明显增加。结论:5-aza可以诱导BMSCs大量表达心肌特异性蛋白cTnT和细胞连接素蛋白(CX43),干细胞分化为心肌样细胞,为干细胞移植治疗小鼠心梗提供种子细胞。     

Wnt/β-catenin通路在大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞过程中的作用

目的 探讨Wnt/β-catenin信号通路在大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)分化为心肌细胞过程中的作用。 方法 选BMMSCs为种子细胞培养到第3代,分为血管紧张素(Ang) Ⅱ+ 5-氮杂胞苷(5-aza)组及对照组,共诱导24 h,再用完全培养液共培养4周。用倒置显微镜、MTT法检测、流式细胞、免疫荧光染色、透射电镜依次检测细胞的形态变化、生长能力、诱导分化率、α肌动蛋白（α-actin）的表达以及超微结构,用Western blot法检测诱导后Wnt及其下游分子β-catenin的表达水平。 结果 BMMSCs原代培养时呈现多种形态,经过传代体积增大,诱导后呈长梭形且均匀一致生长。MTT结果表明AngⅡ + 5-aza组细胞的生长速度比对照组快。流式细胞检测示:AngⅡ + 5-aza组的心肌细胞诱导率是（31.2 ± 1.7）%,而对照组是（1.1± 0.2）%。免疫荧光染色结果示AngⅡ + 5-aza组诱导后的BMMSCs阳性表达α-actin。透射电镜观察可见肌丝和缝隙连接。Western blot提示AngⅡ + 5-aza组的Wnt以及β-catenin的表达明显高于对照组（P < 0.05）。 结论 AngⅡ+ 5-aza在诱导BMMSCs向心肌细胞的分化中有促进作用,其可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。     

心肌样细胞与内皮祖细胞联合移植治疗兔心肌梗死心室重构的实验研究

目的:评价心肌样细胞和内皮祖细胞联合移植对心肌梗死心室重构疗效是否优于单一细胞移植。方法:体外骨髓穿刺提取、分离、培养骨髓间充质干细胞(mensenchymal stem cell,MSC),向心肌样细胞和内皮祖细胞定向诱导分化。心肌梗死模型制作成功2周后,随机分为对照组、心肌样细胞组、内皮祖细胞组、联合移植组,沿梗死周边区域注射100μl培养基或心肌样细胞、内皮祖细胞、二者混合悬液各3×1012/L。移植前、后4周心脏超声检查,TTC染色评价梗死面积、氯胺T氧化法测定血浆、心肌组织羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量及基质金属蛋白酶含量。结果:①诱导后MSC呈现心肌样细胞超微结构特征,PCR检查表达β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy main,β-MHC)、受磷蛋白(phospholamban,PLB)、心房钠尿肽(atrial natriuretic polypeptide,ANP);内皮祖细胞呈"铺路石"外观,高表达CD133并随时间推移表达逐步下降。②与对照组相比,细胞移植能改善心功能(P0.05),降低梗死面积(P0.05),血浆羟脯氨酸含量(P0.05),心肌组织羟脯氨酸(P0.05)基质金属蛋白酶(MMP-9)含量(P0.05),联合细胞移植组效果更好。结论:MSC可定向分化心肌样细胞和内皮祖细胞,两者联合移植能够更好降低梗死面积、改善心室重构,效果优于单一细胞移植。     

5-氮胞苷体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

目的: 研究5-氮胞苷（5-Aza）对培养人骨髓间充质干细胞（MSC）的作用,并对分化后的心肌样细胞进行鉴定。方法: 采用密度梯度离心法分离到骨髓单个核细胞（MB-MNC）,用含200 ml/L胎牛血清的低糖型DMEM培养液进行培养。采用差速贴壁法纯化MSC,用流式细胞仪检测细胞表面抗原。以5-Aza诱导第3代MSC 24 h后继续培养。培养4周,用免疫细胞化学染色法检测肌系标记抗原:α-肌动蛋白（α-actin）及心肌细胞特异性标记抗原:肌钙蛋白T（cTnT）;在透射电镜下观察细胞的超微结构。结果: MSC经5-Aza诱导分化后,可表达α-actin和cTnT,未经诱导的同培养天数的MSC中均未见表达。透射电镜可观察到肌丝等心肌细胞的特异性结构。结论: 5-Aza可诱导MSC分化为心肌样细胞。     

骨髓干细胞诱导转化成心肌细胞的实验研究

目的探讨骨髓基质干细胞(BMCs)在5-氮杂胞苷(5-aza)的作用下是否能向心肌细胞转化。方法用梯度离心法分离大鼠BMCs;用不同浓度的5-氮胞苷对BMCs进行体外诱导转化,并使用心肌特异性抗体(肌钙蛋白I和肌凝蛋白重链)对诱导后的BMCs进行免疫组织化学染色,光镜和电镜观察。结果分离培养后的BMCs生长密集,形态呈纺锤状,在5μmol/L和10μmol/L 5-aza的诱导下分化成类心肌细胞,前者诱导后生长更好。HE染色细胞质嗜酸性,免疫组织化学染色心肌特异性抗体阳性。电镜发现胞核居细胞中央,肌丝和幼稚肌结形成。结论在5-aza的诱导下,BMCs能转化成心肌细胞,5μmol/L 5-aza的诱导效果更好。     

两种类型的干细胞经门静脉注入治疗失代偿期肝硬化患者近期疗效观察

目的 比较自体骨髓干细胞和脐带血干细胞经门静脉注入治疗失代偿期肝硬化患者的安全性及对肝功能和PTA的近期改善作用。方法 选择失代偿期肝硬化患者59例,随机分为骨髓组31例和脐血组28例。骨髓组患者经门静脉注入自体骨髓干细胞治疗,脐血组经同样途径注入脐带血干细胞治疗。治疗8周后检测两组患者血清ALT、AST、TBil、PTA、ALB和AFP水平变化。同时观察对比患者临床症状的改善情况及术后的不良反应。结果 细胞治疗3天,两组患者乏力、纳差症状均有改善,差异均无统计学意义（P均〉0.05）。治疗8周,骨髓组和脐血组ALB水平分别上升至（34.8±6.3）g/L和（36.8±8.1）g/L,差异无统计学意义（P〉0.05）;PTA水平上升至（54.3±13.8）%和（57.0±15.2）%,差异无统计学意义（P〉0.05）;骨髓组血清ALT、AST、TBil和AFP分别为（43.2±13.8）U/L、（50.8±14.2）U/L、（34.5±14.7）μmol/L、（10.0±3.1）μg/L,脐血组分别为（46.3±12.3）U/L、（49.1±15.0）U/L、（31.4±12.5）μmol/L、（8.8±3.2）μg/L,两组差异均无统计学意义（P均〉0.05）。结论 经门静脉注入自体骨髓干细胞和脐带血干细胞治疗失代偿期肝硬化患者有一定的安全性及疗效,脐带血干细胞疗效优于自体骨髓干细胞,但两组疗效差异无统计学意义。     

骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死后心室肌细胞钾离子通道Ito Kv4.2的影响

目的 研究心肌梗死后移植骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)对心室肌细胞钾离子通道Ito亚单位Kv4.2基因表达的影响方法 40只SD(Sprague-Dawley)大鼠随机分成4组(10只/组):假手术组、心肌梗死组、心肌梗死+干细胞组和心肌梗死+细胞培养基组.开胸结扎冠状动脉前降支建立心肌梗死模型,建模成功后,在梗死周围分别注入BMMSCs和细胞培养基,心肌梗死组仅建立心肌梗死模型,假手术组仅开胸子以前降支穿线但不结扎.2周后行心肌组织HE染色和荧光显微镜观察移植细胞,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分别检测钾离子通道Ito亚单位Kv4.2基因mRNA和蛋白水平.结果 (1)心肌组织免疫荧光检测发现,BMMSCs集中分布于梗死区和梗死心肌周围;(2)心肌梗死组和心肌梗死+细胞培养基组Kv4.2 mRNA量(0.39±0.02,0.41±0.04)和蛋白量(0.47±0.02,0.50±0.05)明显下降,与假手术组(0.76±0.05,0.74±0.06)相比差异有统计学意义(P＜0.01);心肌梗死+干细胞组Kv4.2 mRNA量和蛋白表达量(0.57±0.05,0.64±0.03)较心肌梗死组(0.39±0.02,0.47±0.02)明显升高(P＜0.01).结论 骨髓间充质干细胞移植后心肌梗死大鼠钾离子通道Ito亚单位Kv4.2基因表达上升,可能减少心律失常发生.     

两种骨髓间充质干细胞分离方法的对比研究

目的比较全骨髓贴壁法和骨组织消化法分离获取骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMMSCs)的效果。方法分离获取小鼠股骨,冲洗骨髓腔并收集骨髓悬液培养BMMSCs为全骨髓贴壁法;去骨髓的股骨剪碎、消化后培养BMMSCs为骨组织消化法。比较两组BMMSCs的原代细胞数量、细胞生长曲线、细胞传代增殖能力、免疫表型及成骨分化潜能。结果骨组织消化法的BMMSCs原代细胞数量明显多于全骨髓组,并且在第7天细胞就可以融合达到90%;骨组织组的BMMSCs生长快,并且细胞传代增殖能力比全骨髓组强,传代计数实验显示第5次传代后,骨组织组的细胞数量达全骨髓组的4倍(P<0.05);流式表型鉴定结果显示,两组细胞均高表达干细胞表面标志物Sca-1及表面黏附分子CD29,其中骨组织组Sca-1及CD29阳性细胞的比例均高于全骨髓组;骨组织组BMMSCs几乎不表达CD45和CD11b,而全骨髓组CD45阳性细胞的比例为3.18%,CD11b阳性细胞的比例为9.11%。两组BMMSCs均能分化为成骨细胞。结论骨组织消化法操作简单、成本低,且获得的BMMSCs纯度高,可短时间内纯化得到大量BMMSC细胞,是基础研究中值得推广的实验方法。