黑色素瘤相关抗原A1在肝癌细胞株中的表达与基因甲基化程度的相关性

目的 探讨人肝癌细胞株中黑色素瘤相关抗原A1(MAGE-A1)表达状况与肝癌细胞基因甲基化的关系。方法 提取10种人肝癌细胞株的总RNA,用逆转录聚合酶链反应对细胞株的MAGE-A1基因的表达进行检测;提取10种人肝癌细胞株的基因组DNA,用限制性酶切和Southern印迹杂交对每种细胞的基因组甲基化程度进行定量分析。另外对基因组DNA行HpaⅡ酶切后,用引物CDS21、EDP4和CDS20、EDP4进行聚合酶链反应扩增,然后用特异性探针杂交来检测肝癌细胞株MAGE-A1启动子的甲基化状态。用特异性序列聚合酶链反应方法检测每一种细胞株的人白细胞抗原-A位点型别。结果 QGY-7703、SMMC-7721、HLE、BEL-7402、BEL-7404、BEL-7405肝癌细胞株的MAGE-A1基因表达阳性,且细胞分化程度均为中低分化;HepG2 2．2．15、HepG2、QGY-7701和Huh7肝癌细胞株的MAGE-A1基因表达阴性,且细胞分化程度均为高中分化。通过定量分析表明,MAGE-A1表达的肝癌细胞株与MAGE-A1不表达的肝癌细胞株比较,前者基因组甲基化程度较低(t=2．896,P=0．02)。肝癌细胞株MAGE-A1基因启动子区甲基化分析结果表明HepG2 2．2．15、HepG2、QGY-7701和Huh7为高甲基化,SMMC-7721、HLE、BEL-7402、BEL-7404、BEL-7405为低甲基化。结论 肝癌细胞株MAGE-A1 mRNA表达与其基因甲基化程度有关。     

人肝癌细胞系Slit/Robo启动子甲基化状态及基因表达的研究

目的 研究Slit/Robo信号通路相关基因Slit1、Slit2、Slit3和Robo1、Robo3在多种人肝癌细胞系中的表达及甲基化状态,探讨与肝癌发生和发展的关系. 方法提取9种人肝细胞癌细胞株(Hep3B、HepG2、PLC/PRF/5/PRF/5、SMMC-7721、BEL-7402、MHCC97-H,MHCC97-L、LM3、LM6)及对照细胞株L02的基因组DNA和总RNA,采用半定量逆转录聚合酶链反应技术和甲基化特异性聚合酶链反应技术检测Slit1、Slit2,Slit3和Robo1,Robo3基因的基因表达水平与启动子甲基化状态.实验数据应用Paired t检验. 结果 Slit1、Slit2、Slit3基因除个别细胞株外,在不同转移潜能细胞株中均发生了DNA甲基化,同时Slit1和Slit3在mRNA水平几乎均不表达,Slit2基因表达程度在不同转移潜能的细胞株之间存在差异,随着转移潜能的增加表达大致呈下降趋势.作为Slit2受体的Robo1基因在10株肝癌细胞株中均发生甲基化修饰,但除在SMMC-7721、BEL-7402、L02不表达外,其余7种细胞株均有表达.Robo3基因相关CpG岛在9种肝癌细胞株中均未发生甲基化,同时其在mRNA水平均无表达. 结论 Slit/Robo可能在肝癌发生和发展中发挥作用.而Robo3则在肝癌中不发生表达而且其表达沉默可能不受甲基化方式调控.     

肝细胞核因子4α抑制人肝癌细胞株血管内皮生长因子表达和人脐静脉内皮细胞小管形成

背景:肝细胞核因子4α(HNF4α)在肝脏的发育过程中发挥重要作用。研究证实HNF4α与肝细胞癌(HCC)的发生相关。然而HNF4α对人肝癌细胞株血管内皮生长因子(VEGF)表达和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)小管形成的调控作用尚不明确。目的:探讨HNF4α对人肝癌细胞株VEGF表达和HUVEC小管形成的影响。方法:构建过表达HNF4α的慢病毒,并转染人肝癌细胞株HepG 2和SMMC-7721(实验组),以转染慢病毒空载体和未转染的细胞分别作为阴性对照组和空白对照组。分别以qRT-PCR、蛋白质印迹法检测HNF4α、VEGF mRNA和蛋白表达。将HUVEC与HepG2和SMMC-7721细胞不含血清的条件培养基共培养,检测小管形成数量。结果:成功构建了过表达HNF4α的HepG2和SMMC-7721稳转株。与阴性对照组和空白对照组相比,实验组HepG 2和SMMC-7721细胞中VEGF mRNA和蛋白表达均明显降低(P0.05),HUVEC小管形成数量明显减少(P0.05)。结论:HNF4α能明显抑制人肝癌细胞株中VEGF表达以及HUVEC小管的形成。     

抑制素在人肝癌细胞SMMC-7721和Huh-7中的表达及其编码序列扩增

目的检测抑制素在人肝癌细胞SMMC-7721及Huh-7中的基因表达,扩增抑制素全长编码序列。方法分别提取肝癌细胞SMMC-7721及Huh-7细胞总RNA,逆转录合成cDNA。使用Real time PCR,以GAPDH为内参检测抑制素的mRNA表达情况。采用RT-PCR方法扩增抑制素全长编码序列。结果 Real time PCR结果显示,SMMC-7721和Huh-7肝癌细胞株中均有抑制素的表达,且SMMC-7721细胞中抑制素表达量是Huh-7细胞中的6.652倍。RT-PCR方法扩增得到约835 bp的抑制素全长编码序列,条带特异,无非特异性扩增。结论人肝癌细胞株SMMC-7721中抑制素的表达量较高。     

血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶2在肝细胞癌中过表达并介导肝癌细胞中糖原合成酶激酶-3β/β-连环蛋白信号传导

目的探讨血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶(SGK2)在肝癌组织与正常肝脏组织中的表达差异以及介导肝细胞癌(HCC)细胞中糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)/β-连环蛋白(β-catenin)信号传导的相关机制。方法收集配对的HCC及正常组织20对,采用实时荧光定量PCR技术检测SGK2 mRNA表达情况。应用蛋白质印迹法检测人肝癌细胞系Huh-7、SMMC-7721以及正常人肝细胞系L02中SGK2蛋白水平。应用SGK2 siRNA转染人肝癌细胞系SMMC-7721、Huh-7,然后使用蛋白质印迹方法检测上述转染成功细胞系中GSK-3β、β-catenin的蛋白质表达水平。计量资料以均值±标准差(±s)表示,统计学方法采用Student t检验。结果与配对正常肝组织中的表达水平相比,所有20个HCC样品中SGK2 mRNA表达上调。在两种人肝癌细胞系(Huh-7和SMMC-7721)中SGK2蛋白水平显著高于正常人肝细胞系(P<0.01)。在人HCC细胞系SMMC-7721和Huh-7中,SGK2表达下调抑制了未磷酸化GSK-3β表达。另外,在HCC细胞系中SGK2表达下调通过阻止β-catenin蛋白酶体降解来降低β-catenin的去磷酸化。结论SGK2在HCC中过表达并介导HCC细胞中GSK-3β/β-catenin信号传导。     

肝癌细胞株中肿瘤特异性抗原MAGE、GAGE、BAGE基因表达的研究

目的 研究MAGE、GAGE、BAGE基因在肝癌细胞株中的表达情况,评价这些肿瘤特异性抗原作为肿瘤分子标记以及肿瘤免疫治疗特异性靶位的可能性。 方法 用RT-PCR检测国内建株的肝癌细胞株SMMC-7721、QQY-7701、BEL-7402中MAGE-1、MAGE-3、GAGE1-8、GAGE1-2和BAGE基因mRNA的表达,以GAPDH基因作为检测内对照,并与非肿瘤肝穿组织比较。 结果 肝癌细胞株SMMC-7721表达MAGE-1和BAGE基因;QQY-7701表达MAGE-3和BAGE基因;BEL-7402表达MAGE-1和GAGE1-2基因;3株肝癌细胞至少表达其中一个基因。肝硬化病人肝穿刺组织中MAGE、GAGE、BAGE基因表达均为阴性。 结论 MAGE、GAGE、B A G E肿瘤特异性抗原可以作为肝癌早期诊断的分子标记,并具有作为肝癌免疫治疗特异性靶位的潜在价值。     

肝癌组织、缺氧SMMC-7721细胞中HPA的表达变化及机制探讨

目的观察肝癌组织及缺氧培养的肝癌SMMC-7721细胞中乙酰肝素酶（HPA）和缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的表达变化,并探讨其机制。方法免疫组化法检测50例肝癌组织、28例肝癌癌旁组织、14例正常肝组织中的HPA、HIF-1α蛋白。分别采用RT-PCR和Western blot法检测常氧和缺氧培养的人肝癌SMMC-7721细胞中HPA mRNA及其蛋白。结果 HPA、HIF-1α蛋白在肝癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁和正常肝组织（P〈0.05）;肝癌组织中HPA、HIF-1α蛋白的表达呈正相关（r=0.295,P〈0.05）。缺氧培养20 h后,SMMC-7721细胞HPA mRNA表达量（6.234±0.457）显著高于常氧培养细胞的表达量（2.910±0.137）,两者相比,P〈0.05;其HPA蛋白表达量（65 kD为1.437±0.067,50 kD为1.706±0.066）也显著高于常氧培养细胞的表达量（65 kD为1.192±0.060,50 kD为1.580±0.265）,两者相比,P〈0.05。结论肝癌组织中HPA蛋白阳性表达率升高,缺氧肝癌SMMC-7721细胞中HPAmRNA及蛋白表达量均升高,可能与缺氧导致的HIF-1α表达上调有关。     

γ-干扰素对肝癌细胞增殖和抗原表达影响的相关研究

目的探讨IFN-γ对肝癌细胞肿瘤抗原甲胎蛋白和MAGE-1表达的影响与机制。方法用重组人干扰素处理人肝癌细胞系SMMC-7721,用四氮唑比色法检测人肝癌细胞增殖活性,用间接免疫荧光检测MAGE-1表达,ELISA法检测甲胎蛋白表达,用BSP法测MAGE-1基因启动子甲基化状态,用免疫沉淀测JNK活性。结果在IFN-γ作用下,SMMC-7721细胞甲胎蛋白表达量下降,MAGE-1表达下降,MAGE-1基因启动子甲基化程度增加而JNK活性降低。结论 IFN-γ可增强MAGE-1基因启动子甲基化程度,下调MAGE-1表达,降低JNK活性,抑制细胞增殖。     

不同转移潜能肝癌细胞株血管内皮生长因子及其受体的表达和意义

目的 探讨血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1)在不同转移潜能肝癌细胞株中的表达及其意义.方法 应用半定量RT-PCR、酶联免疫吸附试验和(或)Western blot检测4株不同转移潜能的肝癌细胞株及一株正常肝细胞中VEGFR-1、VEGF-A、VEGF-B及VEGFR-2的mRNA和(或)蛋白质表达.结果 MHCC97-H、MHCC97-L和SMMC-7721细胞均有VEGFR-1 mRNA和蛋白质表达,且VEGFR-1 mRNA和蛋白质在MHCC97-H中的表达高于MHCC97-L、SMMC-7721的表达,两者比较,差异有统计学意义(P＜0.05),而其配体VEG-A和VEGF-B在检测的4种肝癌细胞株和正常肝细胞株L-02中均有表达.同时在检测的四种肝癌细胞株和正常肝细胞株L-02中均能检测到VEGFR-2 mRNA和蛋白质表达,但各组间表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 具有转移潜能的肝癌细胞株有VEGFR-1表达,而且其表达强弱与肝癌细胞株的转移潜能呈正相关,VEGFR-1的表达可能促进了肝细胞癌的侵袭转移.     

不同转移潜能人肝癌细胞株趋化因子受体谱差异表达

目的对比观察不同转移潜能人肝癌细胞株趋化因子受体谱差异性表达。方法Pre- mier软件设计18对趋化因子受体引物,RT-PCR分析SMMC-7721、MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM6细胞侵袭转移潜能逐渐增强的人肝癌细胞株趋化因子受体谱。结果4组不同转移潜能细胞株趋化因子受体表达谱存在明显差异（P＜0．01）,其中CCR10、CXCR4、CXCR6表达随转移潜能增加逐渐降低。HCCLM6表达谱中CCR3、CCR4、CCR10、CCR12及XCR1比SMMC-7721表达明显降低甚至缺失（P＜0．01）,而CXCR1（P=0．006）、CXCR5（P=0．003）表达高于低转移潜能组SMMC-7721。MHCC97-H和MHCC97-L比较,除CXCR2、CXCR6、XCR1外差异均有统计学意义,其中CCR1（P=0．002）、CCR2（P=0．004）、CCR5（P=0．046）表达高于MHCC97- L。CXCR4在模板减量时只能在SMMC-7721组检测到。结论高低转移潜能肝癌细胞株趋化因子受体表达在mRNA水平存在差异性表达,与肝癌细胞株差异性转移潜能相关。     

白细胞介素2和6对肝癌细胞表达血管内皮生长因子D的调节

目的探讨白细胞介素(IL)-2和IL-6对肝癌细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)-D的调节。方法采用由IL-2或IL-6分别对肝癌细胞株SMMC-7721和BEL-7402进行刺激,采取逆转录-聚合酶链式反应技术(RT-PCR)观察其VEGF-D基因表达。结果 IL-2使细胞株SMMC-7721和BEL-7402产生VEGF-D mRNA减少;IL-6对肝癌细胞株BEL-7402 VEGF-D mRNA表达存在促进效果,但是无法从作用时间上来显著判断。IL-6对肝癌细胞株SMML-7721 VEGF-D mRNA表达存在促进效果,当浓度条件满足情况下,促进作用和作用时间存在正相关。结论抑制肝癌细胞VEGF-D mRNA的表达方面,IL-2作用比较明显,对肝癌淋巴转移能够形成一定作用;肝癌细胞BEL-7402和SMML-7721 VEGF-D mRNA的表达方面,IL-6带来的促进效果明显,但是对肝癌作用需更多研究。     

NRF2/PI3K通路介导肝癌细胞SMMC-7721出现索拉非尼耐药的机制研究

目的探讨NRF2PI3K通路介导肝癌细胞SMMC-7721出现索拉非尼耐药的机制研究。方法建立肝癌细胞系SMMC-7721耐药细胞株SMMC-7721-SR,构建NRF2-siRNA转染肝癌细胞,并给与10μmol/L索拉非尼处理48 h。采用CCK-8法检测细胞活力,采用流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测NRF2、Keap1、ARE、p-PI3K和p-Akt蛋白表达水平。Real-Time PCR检测NRF2、Keap1、ARE、p-PI3K和p-Akt基因表达水平。结果索拉非尼明显抑制肝癌细胞SMMC-7721的存活率,促进肝癌细胞SMMC-7721凋亡发生(P0.05)。索拉非尼对SMMC-7721细胞促凋亡作用明显强于SMMC-7721-SR细胞(P0.05)。SMMC-7721-SR细胞中NRF2蛋白水平及mRNA表达明显高于SMMC-7721细胞,Keap1、ARE、PI3K和Akt蛋白水平及mRNA表达明显增加(P0.05)。索拉非尼明显上调SMMC-7721细胞中NRF2蛋白水平及mRNA表达(P0.05)。抑制NRF2 mRNA表达并给予索拉非尼处理后,SMMC-7721-SR细胞存活率明显降低,凋亡率显著升高,Keap1、ARE、p-PI3K和p-Akt蛋白水平及mRNA表达明显降低(P0.05)。结论索拉非尼激活NRF2后诱导肝癌细胞SMMC-7721出现耐药;抑制NRF2可逆转肝癌细胞SMMC-7721对索拉非尼的耐药情况。     

细胞周期激酶亚单位1对肝细胞癌细胞增殖能力的影响

目的观察细胞周期激酶亚单位1(CKS1)在肝细胞癌及正常肝组织中的表达以及其对人肝细胞癌细胞BEL-7405的增殖能力的影响。方法应用免疫组织化学检测65对手术肝细胞癌组织及癌旁正常组织CKS1的表达水平。应用Western印迹检测肝癌细胞系与正常肝脏细胞中CKS1表达量的差异。应用小干扰RNA(siRNA)技术转染肝细胞癌BEL-7405细胞,Western印迹检测CKS1 siRNA对CKS1蛋白的干扰效果,同时应用细胞计数试剂盒(CCK-8)和平板克隆增殖实验检测CKS1对BEL-7405细胞增殖能力的影响。结果免疫组织化学染色结果显示,CKS1在正常肝组织中表达量较肝细胞癌组织中表达量低,且差异有统计学意义(P0.05)。Western印迹检测表明CKS1在7种肝细胞癌细胞系表达量显著高于正常肝细胞株,且CKS1的表达量在肝细胞癌BEL-7405细胞株显著高于其他肝癌细胞株。CCK-8法检测CKS1的siRNA转染BEL-7405细胞与阴性对照组和空白对照组相比明显抑制细胞增殖,在48、72和96 h A值分别降低了0.376、0.566、0.972(P0.05);平板克隆增殖形成实验表明,CKS1的siRNA转染BEL-7405细胞后肿瘤细胞形成的克隆增殖集落明显少于阴性对照组和空白组,干扰组与空白、阴性对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论 CKS1在肝细胞癌组织中表达量显著高于正常肝组织,在肝癌细胞中表达量显著高于正常肝细胞,CKS1在肝细胞癌细胞BEL-7405的增殖中扮演了重要的角色,CKS1可能成为针对肝细胞癌基因治疗的新兴靶点。     

XPD对SMMC-7721肝癌细胞中DNp73和GADD45β的调控及意义

目的:观察人剪切修复基因人类着色性干皮病D组基因(xeroderma pigmentosum group D,XPD)转染至人肝癌细胞株SMMC-7721细胞后XPD、DNp73和GADD45β基因的表达变化以及对肝癌细胞生长的影响.方法:实验分4组:重组质粒SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD(XPD组)、空载质粒SMMC-7721-pEGFP-N2组(N2组),脂质体组和SMMC-7721细胞空白对照组.应用Lipofectamine2000脂质体瞬时转染,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹(Western blot)法检测转XPD基因后,人肝癌细胞株SMMC-7721细胞中DNp73以及GADD45β的mRNA和蛋白质的表达量变化,并用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖的活力,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化.结果:荧光显微镜下,XPD组和N2组细胞中观察到绿色荧光蛋白表达,说明转染成功;RT-PCR检测显示:XPD组中DNp73 mRNA相对表达量较其他3组显著下调,XPD和GADD45βmRNA相对表达量较其他3组明显上调(均P<0.01);Western blot检测显示:XPD、DNp73以及GADD45β蛋白相对表达量在各组间的差异与其mRNA各组间差异一致;MTT检测示:SMMC-7721细胞空白对照组、脂质体组、N2组、XPD组的吸光度(A)值分别为0.633±0.012,0.623±0.009,0.628±0.016,0.384±0.011,XPD组低于其他3组,差异均有统计学意义(均P<0.01),表明转染XPD后SMMC-7721细胞的增殖能力减弱.流式细胞仪检测SMMC-7721肝癌细胞凋亡:转染XPD的SMMC-7721细胞凋亡显著,凋亡率达56.53%,而其他3组均未见明显凋亡.结论:XPD基因在肝癌的发生发展中起抑制作用,癌基因DNp73的表达随XPD表达增加而降低,抑癌基因GADD45β则随XPD表达增加而增加,提示两者可能在XPD抑制肝癌细胞的生长机制中起重要作用.     

肝癌组织中TGF-β1、TGF-β1RⅡ和NF-κB的表达

目的:探讨转化生长因子β1(TGF-β1)、转化生长因子β1Ⅱ型受体(TGF-β1RⅡ)、核转录因子-κB(NF-κB)在肝细胞癌(HCC)中表达.方法:在30例肝癌组织和癌旁肝组织中,用免疫组化技术,分别检测TGF-β1 TGF-β1RⅡ及NF-κB蛋白的表达;用原位杂交方法检测TGF-β1mRNA的表达,以CD34标记血管内皮细胞,观察TGF-β1及TGF-β1RⅡ蛋白与微血管密度(MVD)、TGF-β1蛋白与TGF-β1mRNA、NF-κB与TGF-β1的关系.结果:肝癌组织TGF-β1mRNA平均光密度明显高于癌旁组织(0.1 043±0.035 vs 0.0 620±0.0 225,P＜0.01)、TGF-β1蛋白平均光密度表达明显高于癌旁组织(0.0 72 5±0.0 102 vs 0.0 442±0.0 103,P＜0.01);肝癌组织TGF-β1RⅡ蛋白平均光密度表达明显低于癌旁组织(0.0 402±0.0 113 vs 0.0 669±0.0 157,P＜0.01);肝癌组织NF-KB蛋白表达均明显高于癌旁组织(0.0 723±0.0 210 vs 0.0 305±0.0116,P＜0.01),肝癌组织MVD明显高于癌旁组织(31.23±9.25 vs 4.24±2.10,P＜0.01),肝癌组织TGF-β1蛋白阳性表达与MVD呈正相关(t=3.25,P＜0.01);TGF-β1 mRNA与TGF-β1蛋白呈正相关(χ2=8.21,P＜0.01);NF-κB蛋白阳性表达与TGF-β1蛋白阳性表达呈正相关(χ2=9.075,P＜0.01);而TGF-βRⅡ蛋白与MVD呈负相关.结论:肝癌组织中TGF-β1基因的变化发生在多个水平,肝癌细胞中TGF-β1RⅡ、NF-KB蛋白表达异常,并与MVD相关,提示他们在肝细胞癌血管形成中发挥重要作用,NF-κB可能在介导TGF-β1的活化或产生中发挥一定的作用.     

MMP-2和ICAM-1在裸鼠体内塞来昔布抑制肝癌组织中的表达

目的:研究机体内部选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂对肝细胞癌的抑制作用.方法:将三种肝癌细胞株HepG2、BEL-7402和SMMC-7721分别接种于6周龄裸鼠肝脏被膜下;将接种了不同肝癌细胞株的裸鼠分别分为3组,阴性对照组给予生理盐水灌胃,实验组给予塞来昔布灌胃,阳性对照组进行生理盐水灌胃的同时使用阿霉素腹腔注射;3 wk后对裸鼠肝脏肿瘤取材、免疫组织化学法观察肿瘤组织中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及其抑制剂(TIMP-2)以及细胞间黏附因子-1(ICAM-1)的表达.结果:在肝脏被膜下接种了HepG2、BEL-7402和SMMC-7721肝癌细胞株的裸鼠中,应用塞来昔布的裸鼠肿瘤组织中MMP-2的表达下降(P<0.05),MMP-2的表达增加(P<0.05),TIMP-2/MMP-2比值增加.在肝脏被膜下接种了BEL-7402和SMMC-7721肝癌细胞株的裸鼠中,应用塞来昔布的裸鼠肿瘤组织中ICAM-1表达下降.结论:塞来昔布在机体内部可能具有抑制肝癌细胞转移和改善预后的作用.     

PITX1和Pan-ras在肝癌细胞中的表达及意义

目的研究抑癌基因PITX1和其下游癌基因Pan-ras在正常胚肝细胞株L02，肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721中的表达，探讨其在肝癌发生发展中的作用和关系。方法应用SABC免疫组织化学染色技术和westem blot蛋白质印迹以及半定量RT-PCR检测L02、HepG2和SMMC-7721细胞株中PITX1和Pan-ras基因的表达情况，并分析其意义。结果PITX1在肝癌细胞（HepG2、SMMC-7721）中表达比正常肝细胞L02显著降低，Pan-ras在肝癌细胞（HepG2、SMMC-7721）中的表达与正常肝细胞L02相比显著升高。结论PITX1在肝癌细胞中的低表达，以及Pan-ras的高表达，可能导致肝癌无限增殖，构成了肝癌细胞信号传导网络中的重要一环。     

siRNA沉默Cyclin E基因对肝癌HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞增殖和侵袭能力的影响

目的:观察siRNA沉默Cyclin E基因表达对肝癌HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞增殖和侵袭能力的影响.方法:构建2个靶向Cyclin E基因siRNA载体,转染人肝癌HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞.RT-PCR、Western blot检测转染后HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞Cyclin E基因mRNA和蛋白表达水平.CCK-8试验、软琼脂克隆形成实验检测HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞增殖、克隆形成能力.流式细胞术、transwell试验分别检测HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞周期和侵袭能力.结果:构建的2个Cyclin E基因siRNA载体插入序列与所设计序列均一致;转染HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞后,干扰1组、干扰2组与空白对照组和阴性对照组比较,C y c l i n E m R N A和蛋白表达量均显著降低(P<0.05),细胞生长速度延缓,软琼脂细胞集落形成数、穿透细胞数均显著降低(P<0.05),S和G2/M期细胞比例减少,G0/G1期细胞比例增加.结论:沉默肝癌细胞Cyclin E表达水平,可有效抑制细胞生长、增殖和侵袭能力.     

缺氧环境中黏着斑激酶对SMMC-7721细胞侵袭能力的影响

目的 研究缺氧对人肝癌细胞SMMC-7721黏着斑激酶(FAK)表达的影响以及FAK表达对SMMC-7721细胞侵袭能力的影响.方法 通过1%体积分数O2的低氧培养建立人肝癌细胞SMMC-7721物理缺氧模型,Western blot检测FAK的表达.构建针对FAK mRNA的干扰质粒pshRNA-FAK及阴性对照质粒pGensil-2,并将其转染至SMMC-7721细胞,G418筛选稳定转染细胞株.Western blot检测FAK蛋白表达的变化,细胞迁移和侵袭实验检测缺氧条件下细胞迁移和侵袭能力的改变.在正常条件下将FAK真核表达质粒pcDNA3-FAK转染至SMMC-7721细胞,观测其侵袭能力的改变.根据数所资料的不同分别采用t检验、单因素方差分析,LSD法及Dunnett法进行统计学处理. 结果低氧培养的SMMC-7721细胞FAK蛋白表达水平逐渐升高,24 h后较0 h时明显升高(P<0.01).SMMC-7721细胞稳定转染pshRNA-FAK后,FAK蛋白表达显著下降,抑制率达74.6%±5.1%,在正常及缺氧条件下都对FAK表达有显著抑制作用.细胞迁移实验结果显示,缺氧显著促进SMMC-7721细胞迁移能力(t=18.66,P<0.01),侵袭实验结果与迁移实验结果一致.转染pshRNA-FAK对促进SMMC-7721细胞在缺氧环境中的迁移能力有显著抑制作用,透膜细胞数(353±36)个较对照组(392±31)个明显降低(F=173.983,P<0.05);细胞侵袭实验显示,转染pshRNA-FAK对促进SMMC-7721细胞侵袭能力有显著抑制作用,透膜细胞数(160±12)个较对照组(194±13)个明显降低(F=59.674,P<0.05).同时转染真核表达质粒pcDNA3-FAK显著促进SMMC-7721细胞侵袭能力.结论 缺氧促进SMMC-7721细胞侵袭可能与FAK表达水平升高相关,FAK表达的上调可能是缺氧促进肝癌细胞侵袭转移的机制之一.