大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及生物学特性研究

目的建立大鼠骨髓间质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）体外分离、纯化及扩增的方法及对大鼠MSCs的生物学特性进行研究。方法采用贴壁筛选法分离大鼠MSCs，并通过不断传代进行纯化和扩增培养，检测大鼠MSCs生长周期，绘制细胞生长曲线。结果大鼠MSCs在体外分离培养扩增，大鼠MSCs形态呈长梭形，细胞周期显示第3代MSCs约有81．48％的细胞处于G0／G1期，细胞生长曲线呈S形。结论所建立的分离和培养方法获取的大鼠MSCs具有生物学特性。     

人骨髓间充质干细胞体外长期传代培养及恶性转化趋势实验研究

目的 探讨人骨髓间充质干细胞体外长期传代培养、扩增及其生物学特性,观察其恶性转化趋势的可能性.方法 采用密度梯度离心差速贴壁法对人骨髓来源的间充质干细胞进行分离纯化,并进行体外长期传代,观察细胞形态及生长方式;鉴定细胞分化能力;相关癌标志P53、Ki67的表达与成瘤性检测.结果 经过长期体外培养的人间充质干细胞,至36代时,细胞逐渐老化;成骨分化诱导能力丧失;相关癌标志表达阴性;无成瘤性.结论 人骨髓间充质干细胞在体外可以有限传代,无显著恶性转化趋势.     

类风湿关节炎骨髓间充质干细胞的体外培养和一般生物学特性的初步研究

目的 建立类风湿关节炎(RA)患者骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外培养、扩增方法,了解其一般生物学特性.方法 采集RA患者的骨髓标本,经密度梯度离心加贴壁法分离、纯化获得其BMSCs,进行体外培养扩增,观察原代和传代细胞的形态和生长状况、免疫表型分析及增殖能力检测,并对BMSCs进行成纤维细胞集落(CFU-F)形成分析.结果 来自RA患者的BMSCs呈典型的成纤维样细胞形态,表型鉴定CIM5阴性,SH2(CD105)、CD71、CD44阳性,其增殖能力和CFU-F形成能力与源于正常供者的BMSCs相当.结论 RA患者骨髓中存在具有多向分化能力的MSCs,来源于RA患者的BMSCs在体外具有良好的细胞增殖能力,在细胞形态、集落形成能力以及细胞免疫表型方面与正常供者的BMSCs差异无统计学意义.     

骨髓基质细胞在缺血心肌内存活及血管新生作用

目的观察体外扩增骨髓基质细胞(MSCs)在缺血心肌内存活以及其诱导血管新生作用. 方法无菌条件下从兔股骨和胫骨抽取抗凝骨髓,采用密度梯度离心获取单个核细胞,接种于DMEM/F-12培养基差速贴壁粘附纯化MSCs,建立体外培养体系,体外扩增传代,收获第二代细胞行4,6二氨基-2-苯茚二酮(DAPI)标记.     

犬骨髓间叶干细胞体外定向诱导分化心肌细胞的实验研究

目的:旨在建立骨髓间叶干细胞(MSCs)体外定向诱导分化心肌细胞的方法,为心肌疾患的移值修复治疗提供成体干细胞来源.方法:利用Percoll密度梯度法及MSCs黏附贴壁生长特性进行分离培养与扩增骨髓MSCs,并予以鉴定证实.应用5-氮胞苷对培养早期的骨髓MSCs进行定向诱导分化心肌细胞.通过细胞形态学、细胞免疫组化、透射电镜等技术观察分化细胞的肌管,心肌细胞特异性蛋白与细胞特异性超微结构以鉴定诱导分化的效果.结果:利用Percoll密度梯度法与细胞黏附贴壁生长特性,可分离培养与扩增足量骨髓MSCs.应用化学诱导剂5-氮胞苷10～20 μmol/L孵育早期培养的骨髓MSCs4～5周,可见细胞形成肌管;肌细胞特异性蛋白α-肌动蛋白,肌球蛋白以及心肌细胞特异性分子标志肌钙蛋白I免疫组化染色阳性;透射电镜可见肌丝与房性颗粒.结论:骨髓MSCs可在体外5-氮胞苷的诱导下定向转化为具有典型结构的心肌细胞.     

体外培养、冻存及复苏对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

用密度梯度离心及贴壁法相结合的方法分离纯化Wistar大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs).第3代MSCs在10%二甲亚砜(DMSO)保护下放入液氮中(-196℃)冻存,6个月后复苏,检测其存活率,观察形态及生长情况,细胞计数试剂-8(CCK-8)检测MSC8的增殖能力、流式细胞仪检测细胞表面标记(CD29、CD34、CD44和CD45)的表达及细胞周期特性.结果:原代MSCs 72 h贴壁,呈梭形,呈集落样生长;传代后,细胞变为形态均一排列有序的成纤维细胞样.冻存MSCs复苏后存活率为86.5%.冻存MSCs与未冻存MSCs比较,增殖能力、细胞表面标记及细胞周期无明显变化.认为密度梯度离心法结合贴壁法可以获得比较纯的MSCs,采用液氮冻存大鼠MSCs不改变其增殖能力及生物学特性.     

系统性红斑狼疮骨髓间质干细胞的初步研究

目的探讨系统性红斑狼疮（SLE）患者骨髓间质干细胞（MSCs）生物学功能、细胞因子的表达异常与否.方法采用密度梯度离心和贴壁筛选法对10例SLE患者和11例正常人骨髓MSCs进行分离培养,流式细胞仪鉴定MSCs表面标志物及分析MSCs细胞周期和细胞凋亡,观察MSCs形态学改变,MTT法检测MSCs的生长情况,RT-PCR检测MSCs细胞因子mRNA水平表达.结果SLE骨髓MSCs传代率（30%）低于正常（100%）（P＜0.01）,SLE患者骨髓MSCs生长较正常活跃,凋亡率（2.36%）低于正常（6.79%）,两组MSCs均表达CD29、CD44、CD105,均不表达CD14、CD34、CD45,SLE患者骨髓MSCsIL-7mRNA表达低于正常.结论SLE骨髓MSCs生物学特性及细胞因子表达存在异常.     

巴马香猪骨髓间充质干细胞的分离扩增及初步鉴定

目的 建立巴马香猪骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分离、培养、扩增的方法,并进行鉴定.方法 采用梯度离心法分离并结合贴壁筛选法传代纯化培养猪的MSCs;采用倒置相差显微镜观察MSCs的形态学特征;流式细胞仪检测第3代细胞表面标志抗原CD71、CD34的表达率.结果 原代培养的MSCs于6 h后贴壁,贴壁细胞呈集群生长趋势.培养7～9 d后可见细胞融合,14～21 d达到95%融合.第3代细胞表面标记物CD71阳性率为95%,CD34阳性率为0%.结论 采用全骨髓梯度离心法分离并结合贴壁筛选法能够成功分离和培养巴马香猪的MSCs,在第3代可获得高纯度MSCs.     

贴壁法体外培养纯化鼠骨髓间充质干细胞

目的 研究贴壁法体外分离、纯化及增殖鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),并进行鉴定.方法 取出生5 d的Wistar乳鼠的股骨及胫骨,冲取骨髓,采用贴壁法分离筛选分离鼠的MSCs,通过传代进行纯化,增殖,测定其生长曲线,检测生长周期,流式细胞仪分析表面抗原.结果 贴壁培养法能够有效地分离鼠的MSCs,MSCs形态为均一的梭形,生长曲线呈S型,细胞周期显示第三代细胞约有80.89%处于G0/G1期,第三代以后细胞表面抗原CD90阳性,CD34、CD45阴性.结论 建立了一种较好的体外培养、纯化及扩增鼠MSCs的方法,适用于MSCs的进一步研究.     

人骨髓间充质干细胞体外培养及其生物学特性分析

目的探讨人骨髓间充质干细胞（MSC）的体外分离培养方法,并分析其生物学特性。方法无菌条件下抽取健康志愿者骨髓,采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中,用贴壁筛选法纯化获得MSC。相差显微镜下观察细胞形态学变化,细胞计数法绘制生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面抗原及细胞周期。结果原代和传代培养的细胞呈梭形,具有较强的生长增殖能力。细胞表面CD90、CD105表达阳性,CD34、CD11b阴性。第1、3、5代MSC生长曲线呈S形,均经历潜伏期、对数生长期和平台期。第3代MSC中,G0/G1期细胞约占77.42%,S＋G2/M期细胞约占22.58%。结论采用密度梯度离心结合贴壁筛选培养法可获得纯度较高的MSC,且该细胞增殖活性较强。密度梯度离心结合贴壁筛选培养法是一种简单、有效的分离纯化MSC的方法。     

肝病患者血清诱导间充质干细胞表达肝细胞特异性标志物的实验研究

目的：观察重型肝病患者血清对人骨髓间充质干细胞（MSCs）的诱导分化作用，探讨人MSCs分离培养、体外扩增的条件和方法。方法：从肋骨分离、培养人骨髓MSCs、体外扩增培养、鉴定，并采用重型肝病患者血清诱导培养，分别在诱导培养0、7、14、21、28天时留取细胞，并采用免疫细胞化学方法检测肝特异性标志物（AFP、Alb、CK-18）、用PAS进行糖原染色实验。结果：诱导后5天、MSCs表现为肝细胞样细胞，随着诱导培养时间的延长，肝特异性标志物逐渐出现和成熟。AFP在7天时表达水平最高，培养14、21、28天时表达逐渐减弱；Alb、CK- 18和糖原随着诱导时间的延长，表达逐渐增强。结论：密度梯度离心，贴壁培养和消化时间控制相结合，是一种较为有效的分离纯化方法。重型肝病患者血清能诱导骨髓MSCs表达肝细胞的特异性标志物。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的初步研究

目的探讨体外培养、扩增骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法,诱导MSCs向神经元样细胞定向分化。方法取大鼠骨髓,采用贴壁培养筛选法分离MSCs,进行培养扩增,观察其生物学特性;用IBMX诱导MSCs向神经元样细胞分化,并通过细胞免疫化学法鉴定分化细胞。结果大鼠MSCs可通过贴壁法成功分离,并可在体外大量扩增,经IBMX诱导,MSCs可向神经元样细胞分化,出现胞体和突起,细胞免疫化学染色神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白呈阳性。结论MSCs易分离和培养,体外培养条件下生长良好,可连续传代,诱导剂作用下可分化出神经元样细胞。     

采用1.068 g/ml分离液对犬骨髓间充质干细胞的分离纯化与体外培养方法的探讨

目的探讨更为可靠、纯净度高的犬骨髓间充质于细胞分离、培养方法。方法将犬骨髓抽取液分别以1．068g／ml及1．073g／ml分离液进行密度梯度离心，采用贴壁培养法获得骨髓间充质干细胞（MSCs）；以LG-DMEM加15％FBS培养；应用于细胞表面标志蛋白，多向诱导分化等方法进行细胞鉴定。结果采用1．068g／ml分离液可获得纯度较高的单核细胞，接种细胞生长良好，孵育24h即可见细胞贴壁生长，平均倍增周期为1d，细胞呈纺锤状，螺旋梳状排列。连续培育8代以上，未见细胞形态、增殖特性改变。MSCs表面标志SH2阳性，CD45阴性，可定向分化为心肌细胞、成骨细胞及脂肪细胞。结论采用1．068g／m1分离液能够较好地进行犬MSCs的体外分离、培养与扩增，分离得到的细胞具备MSCs的特性。     

人骨髓基质细胞的培养及鉴定

目的:探讨骨髓基质细胞的分离、体外培养方法,为基因治疗提供载体细胞.方法:采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离人骨髓进行体外培养扩增,用倒置显微镜观察细胞形态学特征并用流式细胞仪鉴定其CD90表达.结果:分离培养的骨髓基质细胞似成纤维状,原代细胞呈集落生长,并可表达CD90,传代后细胞形态较一致,且随着传代次数的增加CD90表达越高,第3代可达94.31%.结论:骨髓基质细胞可通过体外培养纯化获得,随着传代次数增加,纯度越高,该方法是一种较理想的骨髓基质细胞培养方法.     

小鼠骨髓基质干细胞的鉴定及体外诱导分化为肝细胞的可行性

目的:分离、鉴定小鼠骨髓基质干细胞(MSCs)并探讨在体外多种细胞因子的诱导下分化为肝细胞的可行性.方法:获取小鼠骨髓干细胞,进行体外贴壁培养、纯化,观察不同传代次数细胞形态特点.流式细胞法检测不同传代细胞的表面标志物CD45和CD90.分离后的MSCs再经含有HGF,FGF-4,EGF三种细胞因子的诱导体系继续培养21 d,分别以半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测诱导后细胞的白蛋白(ALB)、细胞角化蛋白18(Cg18)、以及甲胎蛋白(AFP)在基因和蛋白水平的表达.结果:培养的骨髓干细胞随传代次数增多细胞形态趋向为长梭形.传代到第5代,基质干细胞的表面标志CD90阳性细胞从原代的25.42%增加到93.47%,造血干细胞的表面标志CD45表达阳性细胞从原代的86.49%降低到2.77%.通过RT-PCR可检测出诱导第7天细胞表达AFP mRNA,ALB mRNA及CK18 mRNA;通过Western blot可检测出诱导第21天的细胞表达ALB和CK18.结论:小鼠MSCs可以在体外被有效地分离纯化,可以被诱导为表达肝细胞表面标志的肝细胞样细胞.     

17β-雌二醇在大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞转换中的作用

目的探讨17β-雌二醇对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的作用。方法体外分离培养SD大鼠MSCs,诱导大鼠MSCs向成骨细胞定向分化,应用放免法、酶联免疫吸附法观察应用17β-E2对成年大鼠来源的MSCs成骨分化的影响。结果分离得出BMSCs细胞为长梭形或纺锤形,诱导7 d时,大部分细胞逐渐变为多边形,可见碱性磷酸酶(ALP)染色呈阳性;诱导约14 d,细胞互相聚集周围有钙盐晶体形成;诱导培养21 d,细胞聚集形成典型的骨小结,茜素红染色将骨结节中沉积的钙盐染成红色。结论密度梯度离心与贴壁筛选法相结合,是体外分离、纯化MSCs的理想方法;雌激素能通过增强MSCs的成骨分化能力来发挥促骨形成作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和外源基因的导入

目的探讨绿色荧光蛋白基因转染骨髓间质干细胞的可行性。方法采用F icoll-PaqueTMP lus淋巴细胞分离液,根据细胞密度梯度原理,分离大鼠骨髓间充质干细胞(rM SC s)并进行体外原代培养和传代扩增,倒置相差显微镜观察细胞生长情况,免疫细胞化学法对其初步鉴定。流式细胞仪分析转染效率。结果原代和传代培养的细胞呈现梭形外观,具有较强的生长增殖能力;细胞均一表达CD44、CD54、CD106、CD29抗原。电穿孔法转染rM SC s转染率为32.8%±3%。结论采用比重为1.077 g/L的F icoll-PaqueTMP lus能分离获得大鼠骨髓间充质干细胞,经原代培养和传代培养能够迅速扩增。电穿孔法具有较高的介导外源基因表达于rM SC s的效率。     

血管内皮生长因子对骨髓间充质干细胞分离培养的诱导分化作用

目的　结合骨髓间充质干细胞与血管内皮生长因子（VEGF）的优点,探讨VEGF对其体外诱导分化的作用。为缺血性疾病的治疗提供新思路。方法　成人新鲜骨髓,Percoll梯度分离法培养,单克隆培养法分离传代扩增骨髓基质细胞（MSCs）。在大肠杆菌DH5α中扩增和提取,纯化、克隆pcDNA3.0-VEGF165质粒。脂质体法转染MSCs。流式细胞术检测诱导前后MSCs免疫表型变化。一抗VEGF和CD31（1∶50）,FITC标记的VEGF二抗和cy3标记的CD31二抗与细胞共同孵育,甘油封片,在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞染色情况。结果　转染前表达CD44（75.86%）、CD31（5.63%）。转染后CD44表达明显下调（40.18%）,CD31则明显上调（56.20%）。FITC标记后VEGF抗体使细胞显现绿色荧光,cy3标记的CD31抗体使细胞显红色荧光。结论　转染VEGF后骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化且有分泌VEGF的功能,为干细胞植入及血管再生起到指导作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定

目的 探讨体外分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的生物学特性,对其表型和生长曲线进行初步鉴定.方法 采用全骨髓培养法提取培养MSCs,绘制原代及三代细胞生长曲线,利用免疫组化法检测表面标志物CD34、CD44;流式细胞分析法检测表面标志物CD90.结果 成功培养出MSCs,免疫组化CD44阳性表达,CD34阴性表达;流式细胞术CD90阳性表达.结论 该实验分离培养的细胞群与MSCs的生物学特性相吻合,说明MSCs易于体外分离、培养和扩增.     

骨髓间充质干细胞移植修复心肌梗死的可行性研究

目的初步观察骨髓间充质干细胞(MSCs)移植后在大鼠心肌梗死周边区的定位、存活及分化情况. 方法采用密度梯度离心法及贴壁分离法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞术鉴定细胞表面抗原,体外定向诱导分化为具有心肌特异性结构蛋白的心肌样细胞,同时进行形态学及免疫组化鉴定.