miR-509-3p及XIAP表达与肝癌细胞增殖侵袭能力影响

目的了解微小RNA(micro RNA,miR)miR-509-3p和XIAP表达对肝癌细胞增殖侵袭能力的影响及其作用机制。方法应用实时定量PCR(RT-PCR)检测107例肝癌患者肝癌组织和癌旁组织中miR-509-3p和XIAP表达,利用细胞增殖实验和Transwell侵袭实验观察转染miR-509-3p类似物和抑制剂的HepG2细胞、RNA干扰XIAP表达的HepG2细胞的增殖和侵袭能力。结果肝癌组织miR-509-3p与XIAP的相对表达量分别为0.415±0.098、1.657±0.147,癌旁组织miR-509-3p与XIAP的相对表达量分别为1.127±0.126、0.425±0.113,癌组织中miR-509-3p相对表达量显著低于癌旁组织,差异有统计学意义(t=3.257,P=0.002),而XIAP的相对表达量显著偏高(t=4.201,P=0.000)。肝癌组织miR-509-3p与XIAP mRNA表达水平呈负相关(r=0.218,P=0.046)。与对照组相比,转染miR-509-3p类似物48、72、96及120 h时,HepG2细胞增殖率明显偏低,差异有统计学意义(均P0.05);与对照组相比,转染miR-509-3p抑制剂48 h后HepG2细胞增殖明显偏高(P均0.05),与对照组相比,转染miR-509-3p类似物后24 h HepG2细胞侵袭数目明显较低,分别为96.32±0.52、51.47±0.45,差异有统计学意义(t=2.263,P=0.021);与对照组相比,转染miR-509-3p抑制剂后24 h HepG2细胞侵袭数目明显较高,分别为94.65±0.42、120.14±0.45,差异有统计学意义(t=2.463,P=0.013)。结论 miR-509-3p与XIAP的表达与肝癌细胞的增殖与侵袭能力有关,miR-509-3p表达可能通过影响XIAP表达而发挥调节肝癌细胞增殖和侵袭能力的作用。     

miR-363靶向调控E2F3表达影响HepG2细胞增殖和凋亡研究

目的探讨微小RNA-363(miR-363)靶向调控E2F转录因子3(E2F3)的表达对HepG2细胞增殖和凋亡的影响。方法体外培养HepG2细胞,采用Lipofectamine法将miR-363抑制剂或其阴性对照转染到HepG2细胞,继续培养48 h,收获细胞,采用四噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖率,使用流式细胞术法检测细胞凋亡率,采用实时荧光RT-PCR法检测HepG2细胞miR-363 mRNA水平,采用Western Blot法检测HepG2细胞E2F3、BAX和Caspase-3蛋白表达水平。结果对照组HepG2细胞增殖率为(96.4±9.7)%,显著高于抑制剂处理组[(72.3±6.5)%,P0.05],凋亡率为(8.2±1.4)%,显著低于抑制剂处理组[(9.7±0.8)%,P0.05];对照组HepG2细胞miR-363 mRNA相对水平为(1.0±0.1),显著高于抑制剂处理组[(0.6±0.2),P0.05],E2F3蛋白表达量为(1.0±0.1),显著高于抑制剂处理组[(0.6±0.1),P 0.05],而对照组HepG2细胞Bax和Caspase-3蛋白表达量分别为(0.4±0.0)和(0.5±0.1),均显著低于抑制剂处理组[(0.6±0.1)和(0.7±0.0),P均0.05]。结论 miR-363可靶向调控E2F3的表达,抑制HepG2细胞增殖,诱导其凋亡。本研究结果为肝癌靶向治疗提供了一定的理论依据。     

微小RNA-221对HepG2细胞增殖及其凋亡的影响

目的 探讨微小RNA-221(miR-221)对肝癌细胞株HepG2细胞增殖与凋亡的影响.方法 将miR-221阻遏物及模拟物转染至HepG2后,用实时荧光定量RT-PCR检测miR-221的表达水平;用细胞增殖试剂盒、Hoechst 33342及碘化丙啶(PI)双重染色、流式细胞仪及caspase3/7活性试剂盒检测HepG2细胞增殖与凋亡情况.对数据进行多样本的单因素方差分析,两两比较采用LSD法;相关性比较用Pearson检验.结果 RT-PCR结果显示,转染miR-221阻遏物后其表达受到抑制,而转染miR-221模拟物可促进其表达.细胞增殖试剂盒及Hoechst 33342/PI染色结果显示,48 h后miR-221阻遏物明显抑制HepG2细胞增殖(P＜0.05),而miR-221模拟物促进HepG2细胞增殖(P＜0.05),两种方法结果呈正相关(r=0.993,P＜0.01).流式细胞仪检测细胞周期显示,miR-221模拟物组G1期细胞比例(47.6%±1.53%)明显低于空白对照组(59.00%±1.00%)及阴性对照组(58.00%±1.00%,F=81.77,P＜0.01); S期细胞比例(20.33%±1.15%)明显高于空白对照组(11.00%±1.00%)及阴性对照组(12.00%±1.00%,F=70.90,P＜0.01).Hoechst 33342/PI染色、流式细胞仪膜联蛋白V凋亡试剂盒检测均显示,转染miR-221阻遏物48 h后,细胞凋亡和坏死增加(P＜0.05),差异有统计学意义.Caspase-3/7试剂盒检测caspase-3/7活性变化结果显示,转染miR-221阻遏物24 h后,细胞caspase3/7活性明显增高(P＜0.05),差异有统计学意义.结论 miR-221可促进肝癌细胞生长增殖,抑制miR-221表达可诱导细胞凋亡.miR-221有望成为治疗肝癌新的分子靶点之一.     

乙型肝炎病毒X基因下调miR-192对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒X基因(HBx)通过调节人肝癌细胞株HepG2中miR-192的表达而抑制其凋亡的机制.方法 设立3个细胞组:稳定转染HBx基因的HepG2细胞(HepG2/HBx),稳定转染空载体pcDNA3.1的HepG2细胞(HepG2/pcDNA3.1)以及未作转染的HepG2细胞.用流式细胞术分析3个细胞组的凋亡率差异,用Taqman探针荧光定量PCR检测3组细胞中miR-192的表达水平.转染miR-192后,用流式细胞术检测HepG2细胞凋亡率的变化,同时用SYBR Green荧光定量PCR和Western blot检测细胞中p53、PUMA表达的变化.计量资料均数的比较用单因素方差分析.结果 HepG2/HBx细胞的凋亡率为2.37％±0.35％,较HepG2/pcDNA3.1、HepG2细胞(11.46％±0.69％、12.50％±0.66％)明显降低(F=171.722,P＜0.01).miR-192表达在HepG2/HBx细胞中为49.1％±5.9％,较HepG2/pcDNA3.1、HepG2细胞(98.0％±8.9％,100％)也明显下调(F=14.319,P＜ 0.05).转染miR-192后HepG2细胞的凋亡率(15.74％±1.17％)较转染相应阴性对照的HepG2细胞的凋亡率(10.74％±1.15％)显著升高(F=18.415,P＜0.05),同时,p53、PUMA基因在mRNA (953:1.68±0.12比0.90±0.09,F=43.115,P＜0.05 ; PUMA:1.66±0.10比0.98±0.06,F=22.541,P＜0.05)和蛋白质水平(p53:3.07比1,PUMA:2.13比1)的表达均显著上升.结论 miR-192促进HepG2细胞凋亡,HBx通过下调miR-192抑制HepG2细胞凋亡.     

miR-133a-3p重组腺相关病毒的构建及抑制LX-2细胞α-SMA基因表达

目的构建miR-133a-3p重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)过表达载体并转染肝星状细胞,鉴定其转染及干预作用。方法体外培养肝星状细胞株LX-2细胞,试验分为DMEM对照组,AAV8-Scrambled对照组,AAV8-miR-133a-3p组,应用qRT-PCR法检测miR-133a-3p转染表达量,检测胶原蛋白(COL1A1)、-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)和TGF-β/Smad信号通路基因的表达量。结果重组腺相关病毒成功构建并转染LX-2细胞,AAV8-miR-133a-3p转染LX-2细胞组的miR-133a-3p相对表达量为11 000±343.10,与DMEM对照组比较差异有统计学意义(t=32.07,P0.01)。AAV8-miR-133a-3p转染组与DMEM组α-SMA mRNA的相对表达量分别为0.42±0.06 vs 1.00±0.09(t=5.72,P0.05),COL1A1 mRNA的相对表达量为0.34±0.03 vs 1.00±0.04(t=12.66,P0.01)。结论重组腺相关病毒成功转染LX-2细胞,且能抑制肝星状细胞纤维化标志物α-SMA的表达,为探讨miR-133a-3p在调控肝星状细胞所致纤维化中的作用奠定了理论基础。     

microRNA-122抑制肝肿瘤细胞HepG2的增殖研究

目的探究microRNA-122(miR-122)对肝肿瘤细胞HepG2增殖的抑制效应。方法培养肝肿瘤细胞HepG2并随机分为miR-122组、阴性对照组(NC组)、空白对照组,miR-122组使用LipofectamineTM2000试剂转染肝癌细胞株HepG2细胞,NC组将阴性对照siRNA转染HepG2细胞,空白对照组只加胎牛血清RPMI-1640培养基。转染24 h后,采用MTS试剂盒测定细胞活力,计算细胞增殖抑制率,采用荧光定量PCR测定细胞中凋亡抑制蛋白(XIAP)、细胞周期素D1(Cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGFR1、VEGFR2、肝细胞生长因子(HGF)的mRNA含量。结果干预后24 h,miR-122组细胞的吸光值(OD)明显低于空白对照组、NC组,细胞增殖抑制率明显高于NC组(t=9.43、19.475、P0.05),miR-122组细胞中XIAP、Cyclin D1、CDK2、CDK4 mRNA含量明显低于空白对照组、NC组(t=8.135、7.542、11.740、5.937,P0.05),VEGF、VEGFR1、VEGFR2、HGF mRNA含量明显低于空白对照组、NC组(t=7.741、13.002、6.347、6.662,P0.05)。结论 miR-122能够抑制肝肿瘤细胞HepG2的增殖,靶向抑制细胞周期相关分子、血管新生相关分子的表达是miR-122发挥增殖抑制效应的可能机制。     

MicroRNA-21在胰腺癌细胞增殖和迁移中作用的研究

背景:大量研究表明microRNAs与肿瘤的发生、发展密切相关。MiR-21为最为常见的致癌性microRNAs分子之一,其对胰腺癌细胞增殖、迁移的具体作用及其机制尚未完全阐明。目的:探讨miR-21对胰腺癌细胞增殖、迁移的影响及其具体分子机制。方法:以PANC-1和MIA PaCa-2细胞为研究对象,通过转染慢病毒表达载体分别构建miR-21过表达和敲低的稳转株,以qRT-PCR法验证转染效率。采用CCK-8法检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,qRT-PCR和蛋白质印迹法分别检测Spry2 mRNA和蛋白表达,萤光素酶报告实验检测miR-21对Spry2的调控作用。结果:Mi R-21过表达可明显促进PANC-1细胞增殖和迁移(P 0. 05),miR-21表达下调可明显降低MIA PaCa-2细胞增殖和迁移(P 0. 05)。与对照组相比,miR-21表达上调可明显降低Spry2 m RNA和蛋白表达(P 0. 05),而敲低mi R-21表达可明显升高Spry2 mRNA和蛋白表达(P 0. 05)。上调miR-21表达可抑制含野生型Spry2 3’-UTR序列质粒的萤光素酶活性(P 0. 05),下调miR-21表达则增强萤光素酶活性(P 0. 05)。Spry2可逆转mi R-21介导的细胞增殖和迁移(P 0. 05)。结论:MiR-21能通过靶向调节Spry2的表达而影响胰腺癌细胞的生物学功能。     

HBx基因下调p21对HepG2细胞增殖与凋亡的影响

目的:构建转基因细胞模型HepG2/HBx,观察HBx基因对HepG2细胞增殖、周期和凋亡的影响, 探讨细胞周期蛋白P21在其中的作用和意义.方法:应用脂质体转染和G418筛选构建稳定表达HBx的转基因细胞HepG2/HBx,RT-PCR和Western blot鉴定HBx mRNA与蛋白的表达.分别以四唑蓝(MTT)比色法、流式细胞术检测HepG2/HBx细胞及对照组HepG2与HepG2/pcDNA3.1细胞(转染空载体pcDNA3.1的HepG2细胞)的增殖、周期和凋亡.另半定量RT-PCR检测各组细胞中细胞周期蛋白P21与抑癌基因p53mRNA的表达.结果:HepG2/HBx细胞中有HBx mRNA和蛋白的表达.HepG2/HBx细胞生长速度加快.HepG2/HBx中G0/G1期细胞比例较对照组显著减少(43.34%±3.11%vs57.69±4.28%,P<0.01),S期细胞比例明显增加(28.69%±1.17%vs22.41%±1.99%,P<0.05),同时还发现与对照组相比其凋亡率也显著降低(1.19%±0.06%vs 5.43%±0.42%, P<0.001).细胞周期蛋白p21 mRNA在HepG2/HBx细胞中的表达较对照组细胞显著降低(0.16±0.05vs0.78±0.15,P<0.001),而p53表达则无显著变化.结论:HBx基因可下调细胞周期蛋白P21mRNA的表达,可能参与HBx基因加速HepG2细胞周期进程、促进细胞增殖以及抑制细胞凋亡的作用.     

叉头状转录因子O1对游离脂肪酸诱导的人肝癌细胞株HepG-2胰岛素抵抗和脂质堆积作用的研究

目的研究叉头状转录因子O1（FoxO1）对游离脂肪酸介导的人肝癌细胞株（HepG-2）胰岛素抵抗和脂质堆积的作用以及对固醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）mRNA和蛋白表达的影响。方法将HepG-2细胞培养后用普通培养基培养为对照组,用含5．0×10μmol／L软脂酸的培养基诱导为软脂酸组,诱导后转染空白质粒为空白质粒组,诱导后转染FoxO1siRNA质粒载体为FoxO1siRNA载体组。运用实时定量聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测FoxO1mRNA表达,噻唑蓝（M33＂）比色法检测细胞增殖,葡萄糖氧化酶法检测培养基中葡萄糖消耗量,油红O染色观察细胞脂质堆积;RT—PCR和Westernblot技术分别检测SREBP-1c mRNA表达量以及蛋白的表达量。各组间均值比较采用单因素方差分析,样本间比较采用t检验。结果软脂酸组较对照组细胞葡萄糖消耗量减少（1．174-0．56vsVS4．31±0．21,t=10．587,P〈0．01）、细胞中的脂质堆积增多、FoxO1mRNA升高（0．784-0．10vs0．51±0．12,t=3．629,P〈0．05）、SREBP-1cmRNA升高（0．71±0．17vs0．25±0．08,t=6．290,P〈0．05）、SREBP-1c蛋白升高（0．694-0．10vs0．41±0．07,t=4．797,P〈0．01）。转染FoxO1siRNA质粒载体后葡萄糖消耗量较软脂酸组增加（2．26±0．41vs1．17±0．56,t=3．144,P〈0．05）,FoxO1mRNA、SREBP-1cmRNA、SREBP-1c蛋白的表达较软脂酸组均减少且接近于对照组（分别为0．38±0．06vs0．784-0．10,t=7．164,P〈0．01;0．45±0．13vs0．71±0．17,t=2．479,P〈0．05;0．41±0．06vs0．694-0．10,t=4．797,P〈0．01）,细胞中的脂质堆积也较软脂酸组减少。结论抑制FoxO1的表达,可改善游离脂肪酸诱导的细胞胰岛素抵抗、减少肝脏细胞内脂肪变性,其机制可能是通过下调SREBP-1c的表达。     

过表达miR-150通过PI3K/AKT信号通路调控结直肠癌细胞凋亡的机制研究

目的探讨过表达miR-150通过磷脂酰肌醇-3-羟激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxykinase/seronine kinase,PI3K/AKT)信号通路调控结直肠癌细胞凋亡的机制。方法将体外培养HT-29细胞分为空白对照组(转染空脂质体) NC组(转染mimic)和miR-150(转染miR-150 mimic);采用RT-PCR检测转染后细胞中miR-150 mRNA水平; CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡; WB法检测Cleaved caspase3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达。将对数生长期HT-29分为阴性对照组、miR-150组、LY294002组和LY294002+miR-150组,采用PI3K抑制剂验证LY294002在HT-29细胞凋亡中的作用。结果与空白对照组和NC组相比,miR-150组细胞中miR-150 mRNA水平明显升高(P 0. 05),24 h、48 h、72 h和96h的细胞抑制率明显升高(P 0. 05),细胞凋亡率明显升高(P 0. 05),Bcl-2/Bax、p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白的表达明显降低(P 0. 05),cleaved Caspase-3蛋白的表达明显升高(P 0. 05);与阴性对照组相比,miR-150组和LY294002组p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax蛋白表达均明显降低(P 0. 05),cleaved Caspase-3蛋白表达明显升高(P 0. 05);与miR-150组相比,LY294002+miR-150组p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax蛋白表达均明显升高(P 0. 05),cleaved Caspase-3蛋白表达明显降低(P 0. 05)。结论 miR-150过表达可能通过负调控PI3K/AKT信号通路抑制人结直肠癌细胞的增殖,促进其凋亡。     

小干扰RNA干扰高迁移率族蛋白1对HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)抑制高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖和凋亡的影响. 方法设计并化学合成针对HMGB1的3对siRNA分子序列(siRNAH1、siRNH2、siRNAH3),同时设未转染对照组(Lipo组)及转染阴性siRNA组(阴性siRNA对照组).脂质体法瞬时转染HepG2细胞,通过PCR法和Western blot检测细胞中HMGB1基因在mRNA水平和蛋白质水平的变化,利用四甲基偶氮唑盐法检测转染HMGB1-siRNA的HepG2细胞增殖情况,TdT酶介导的缺口末端标记法检测细胞凋亡情况.两组数据间比较用t检验,组内数据比较用方差分析,细胞增殖数据采用可重复双因素方差分析.结果 3对特异性HMGB1-siRNA转染后,HMGB1 mRNA相对表达量分别为1.147±0.024、1.014±0.042和0.435±0.055,较Lipo组的1.411±0.065明显减少(t值分别为7.187、9.018和20.689,P值均＜0.01);HMGB1蛋白相对表达量分别为0.369±0.035、0.340±0.028和0.097±0.020,较Lipo组的0.553±0.051明显减少(t值分别为6.678、7.919和17.287,P值均＜0.01),其中以siRNAH3抑制效果最好,抑制率可达到80%.转染siRNAH3后HepG2细胞的增殖能力受到明显抑制,与Lipo组相比,72、96、120h时F值分别为34.651、540.550、3778.197,P值均＜0.01,HepG2细胞凋亡指数明显增高(F=130.696,P＜0.01).结论 靶向HMGB1基因的siRNA分子片段可以有效地抑制HepG2细胞生长,促进HepG2细胞凋亡,其作用与下调HMGB1的表达有关,HMGB1可能是肝癌治疗的一个潜在靶点.     

微小RNA-223及其标靶基因c-myc在肝癌发病中的作用

目的 探讨微小RNA-223(miR-223)对原癌基因c-myc的调控及其在肝癌发病中的作用.方法 通过实时定量聚合酶链反应和Western blot检测正常肝脏组织、癌旁组织、肝癌组织及肝癌HepG2细胞、胎肝L02细胞中miR-223和c-myc的mRNA和蛋白质表达水平.构建miR-223模拟物(mimics)上调肝癌细胞HepG2中miR-223表达后,实时定量聚合酶链反应和Western blot 检测HepG2细胞中c-myc表达水平的变化.分别用独立样本t检验和单因素方差分析进行两组及多组数据间的比较,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 miR-223在正常肝组织、癌旁组织和肝癌组织中的相对表达量分别为0.055±0.015、0.030±0.008和0.020±0.016,肝癌组织低于正常肝组织(t=-0.031,P＜0.05).miR-223在HepG2细胞中的表达较L02细胞下调(0.005±0.003比0.011±0.006,t=12.74,P＜0.01).c-myc mRNA在正常肝组织、癌旁组织和肝癌组织中的相对表达量分别为0.029±0.023、0.136±0.071和0.425±0.026,肝癌组织高于正常肝组织(t=-0.317,P＜0.05);c-myc蛋白在正常肝组织、癌旁组织和肝癌组织中的相对表达量分别为0.137±O.015、0.299±0.033和0.439±0.027,差异有统计学意义(F=103.35,P＜0.01).miR-223 mimics转染HepG2细胞后,c-myc蛋白在空白组、转染组和阴性对照组的相对表达量分别为0.423±0.041、0.116±0.015和0.432±0.034,转染组较其他两组明显降低(F=94.93,P＜0.05).结论 miR-223在肝癌组织中表达下调,丧失其对c-myc表达的抑制而导致c-myc异常高表达可能是肝癌发生的重要机制.

Abstract：

Objective To investigate the regulatory role of microRNA-223 (miR-223) on c-myc and its role in hepatocarcinogenesis.Method miR-223 and c-myc mRNA expressions in normal tissue,paraneoplastic tissue,liver cancer tissue and liver cancer cells were tested with microRNA microarray and quantitative real-time PCR (qRT-PCR).C-myc protein expression was detected by Western blot.MiR-223mimic was transfected into HepG2 cells and the expression changes of c-myc mRNA and protein were tested with qRT-PCR and Western blot respectively.Results MiR-223 was down-regulated by 61.53% and 30.77% respectively in hepatocellular carcinoma and adjacent tissues as compared to normal liver tissues and the expression of miR-223 was also decreased in HepG2 cell as compared to fetal liver cells L02,whereas the expressions of c-myc mRNA and protein increased in paraneoplastic and HCC tissues compared with normal liver tissues.It prompts that the expressions of miR-223 and c-myc are negatively correlated.No obvious difference found among c-myc mRNA expressions after miR-223 mimics transfection.Conclusions The cmyc abnormal high-expression may play a dynamic role in hepatocarcinogenesis due to the miR-223 downregulation.     

D-双功能蛋白在大鼠和裸鼠肝细胞癌生长中的作用

目的探讨肝细胞癌大鼠模型肝癌组织中D-双功能蛋白(DBP)的表达及DBP诱导裸鼠肿瘤生长情况。方法 22只雄性SD大鼠随机分为2组,正常对照组大鼠8只,腹腔注射2-乙基亚硝胺诱导肝细胞癌模型组大鼠14只,蛋白免疫印迹、免疫组化和逆转录聚合酶链反应检测DBP表达。14只雄性SPF级BALB/c-nu小鼠,随机分为2组,用空质粒和DBP过表达质粒分别转染HepG2细胞,将2组细胞分别注射于裸鼠皮下,空质粒对照组8只,DBP高表达组6只,检测2组裸鼠成瘤的大小。计量资料2组间比较采用t检验。结果肝细胞癌模型组大鼠肝癌组织中DBP的蛋白表达高于正常大鼠肝脏,差异具有统计学意义(1. 10±0. 35vs 0. 67±0. 12,t=-7. 48,P 0. 05); mRNA表达也高于正常大鼠肝脏,差异具有统计学意义(3. 70±0. 85 vs 1. 17±0. 72,t=-20. 46,P 0. 05)。DBP过表达组的裸鼠肿瘤体积显著大于空质粒组,差异具有统计学差异[(7590. 50±1867. 97) mm~3vs (1663. 78±420. 24)mm3,t=-39. 78,P 0. 01]。结论高表达的DBP在大鼠肝癌的发展进程中发挥了促进作用,并且为肝癌的治疗和抑制药物的研发提供新的靶点。     

shRNA沉默Kir6.2基因表达载体的构建及其对HepG2细胞增殖和侵袭的影响

目的 构建shRNA体内表达载体pGenesil-3-shRNA,研究抑制Kir6.2基因表达对HepG2细胞增殖和侵袭的影响. 方法 以Kir6.2基因为目的 基因,以产生shRNA质粒载体pGenesil-3为表达模板,细胞内转录合成2条shRNA.重组质粒经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切鉴定和测序后,使用Lipofectamine 2000转染HepG2细胞.实验分为SK组(未转染)、SK-HK组(阴性对照),SK-K1(转染干扰序列1)组和SK-K2(转染干扰序列2)组.G418筛选出荧光单克隆进行培养.Westernblot检测Kir6.2蛋白在各组细胞中的表达.MTT法和Transwell系统分别检测各组细胞的增殖和侵袭能力. 结果 经酶切、测序鉴定,重组质粒符合设计要求.Western blot检测结果显示SK组,SK-HK组、SK-K1组和SK-K2组Kir6.2蛋白质相对表达量分别为0.9349±0.0443,0.9098±0.0195,0.2869±0.0295,0.3256±0.0341;和对照组相比,实验组Kir6.2蛋白减少.MTT法检测SK组、SK-HK组、SK-K1组、SK-K2组细胞的增殖分数分别为0.7523±0.0681,0.7351±0.0589,0.2494±0.0485,0.2261±0.0298,F=0.2401,P=0.000.Transwell实验结果显示,SK组、SK-HK组,SK-K1组、SK-K2组细胞的穿膜数分别为47.0±7.1,40.7±8.0,14.3±5.1,15.0±3.7,F=-30.74,P=0.000.和对照组相比,实验组HepG2细胞增殖和侵袭能力均明显降低.结论 抑制HepG2细胞Kir6.2基因的表达可降低HepG2细胞的增殖和侵袭能力.     

miR-18b靶向CDKN2B促进大肠癌细胞HCT116增殖和迁移研究

目的研究miR-18b靶向CDKN2B对大肠癌细胞HCT116增殖和迁移的作用及miR-18b与CDKN2B相关性。方法大肠癌细胞经过细胞培养、转染分为大肠癌细胞组、miR-18b沉默组、miR-18b过表达组。检测大肠癌细胞增殖、细胞周期、细胞迁移,荧光定量RT-PCR检测miR-18b、CDKN2B mRNA表达,Western Blot检测CDKN2B表达。结果 miR-18b过表达组在24 h、48 h和72 h时的大肠癌细胞增殖显著较高,48 h时大肠癌细胞增殖效果最明显。miR-18b过表达组G0/G1期、S期细胞百分比较高且细胞迁移数量较高。miR-18b过表达组miR-18b表达水平高于大肠癌细胞组、miR-18b沉默组,CDKN2B mRNA低于大肠癌细胞组、miR-18b沉默组(P 0. 05)。miR-18b与CDKN2B mRNA呈负相关(r=-0. 708,P=0. 001)。结论 miR-18b过表达能增强CDKN2B表达水平,miR-18b表达上调能够促进大肠癌细胞HCT116增殖和迁移,miR-18b沉默则相反。     

MicroRNA-196a抑制序列对人胰腺癌PANC1细胞株HOXB8基因表达的影响

目的 观察microRNA-196a(miR-196a)抑制序列转染胰腺癌细胞株PANC1后对其HOXB8基因表达的影响.方法 将PANC1细胞分为对照组、miR-196a抑制序列组和siRNA对照组.采用脂质体法将miR-196a抑制序列及对照siRNA分别转染PANCI细胞.应用RT-PCR和蛋白质印迹法检测转染细胞miR-196a及其下游靶基因HOXB8 mRNA和蛋白的表达.结果 转染miR-196a抑制序列后,PANC1细胞miR-196a表达量较siRNA对照组显著减少(0.050±0.054比0.839±0.025,t=3.12,P＜0.05);HOXB8 mRNA表达量较siRNA对照组增高1.57倍(2.20 ±0.07比1.29±0.10,t=3.86,P＜0.05);HOXB8蛋白表达量也显著增强(0.90±0.03比0.40±0.10,t=3.11,P＜0.05).结论 miR-196a可以下调HOXB8基因的表达.     

miR-21对HepG2细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

目的研究miR-21对HepG2细胞增殖和凋亡的影响并探讨其可能的分子机制。方法体外培养HepG2细胞,并将细胞分为增强组、抑制组和对照组,分别给予Lipofectamine 2000和Hsa-miR-21 mimics (50nm/L)、Lipofectamine 2000和Has-miR-21 inhibitor(100 nm/L)转染或者给予Lipofectamine 2000处理干预。采用Western blot法检测B细胞异位基因2(BTG2)蛋白表达,采用CCK-8法检测细胞增殖,使用流式细胞术(FCM)检测细胞周期和凋亡变化。结果增强组细胞BTG2蛋白表达水平最低,抑制组细胞BTG2蛋白表达水平最高,对照组细胞BTG2蛋白表达水平强于增强组而低于抑制组,组间差异比较有统计学意义(P0.05);抑制组细胞增殖率较增强组和对照组明显降低(P0.05),增强组较对照组明显增强(P0.05);与增强组或对照组比,抑制组细胞周期S期明显减少(P0.05),而G2期则明显增多(P0.05),与对照组比,增强组S期明显增加,而G2期明显较少(P0.05);与增强组和对照组比,抑制组细胞凋亡率显著增加(P0.05),而与对照组比,增强组细胞凋亡率显著减少(P0.05)。结论 miR-21可能通过直接靶向调控BTG2表达而影响HepG2细胞的生长,可能成为干预肝癌生长的新途径。     

下调miR-221对胃癌细胞SGC-7901增殖的影响及其相关机制研究

目的探讨下调miR-221后对胃癌细胞SGC-7901增殖的影响及其相关机制。方法收集2015年6月至2017年7月我院就诊的48例胃癌患者的癌旁组织、癌组织和32例同期体检健康者的正常胃组织,采用Real-time Q-PCR检测miR-221的表达水平。体外培养胃癌细胞SGC-7901,根据处理的方法不同分为组1(mimics对照组)、组2(hsa-miR-221组)、组3(antimiR组)、组4(anti-miR-221组),运用Real-time Q-PCR检测四组miR-221的表达,并通过噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的增殖,同时运用免疫印迹法(Western blotting)检测细胞增殖的相关信号通路STAT3蛋白的改变。结果胃癌组织miR-221阳性表达率显著高于癌旁组织、正常组织(均P 0. 05),癌旁组织miR-221阳性表达率高于正常组织,但差异无统计学意义(P 0. 05)。胃癌SGC-7901细胞中的miR-221表达水平高于正常胃上皮细胞(4. 56±1. 21 vs. 15. 32±2. 74),差异有统计学意义(P 0. 01)。组2的增殖能力最强,组4的增殖能力最弱,组1和组3两组无明显差异(P 0. 05)。四组细胞中STAT3蛋白的相对表达量分别为0. 341±0. 028、0. 748±0. 052、0. 376±0. 031、0. 218±0. 022,组2的STAT3蛋白表达水平最高,组4 STAT3表达水平最低,组1和组3两组无明显差异(P 0. 05)。结论胃癌组织和胃癌细胞中miR-221的表达明显升高,下调miR-221可抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖,其机制可能与下调STAT3蛋白有关。     

miR-146a对原发性胆汁性肝硬化辅助性T细胞增殖调控作用的研究

目的 研究miR-146a对原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者T细胞增殖以及白细胞介素(IL)-2分泌的调控作用.方法 荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测20例PBC患者和20名健康个体外周血单个核细胞( PBMC)、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、B细胞和单核细胞内miR-146a的表达.将miR-146a表达载体和表达抑制体转染入PBC患者辅助性T细胞内,以抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激辅助性T细胞,以CCK-8法检测辅助性T细胞增殖能力,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测培养基内IL-2水平,以RT-PCR法监测辅助性T细胞内miR-146a的表达.2组间的比较采用t检验.结果 PBC患者PBMC内miR-146a的表达(0.46±0.20)较健康个体(1.00±0.26)明显降低(t=7.47,P＜0.01).PBC患者辅助性T细胞和单核细胞内miR-146a的表达(分别为(0.33±0.13,0.56±0.11)较健康个体(分别为1.00±0.14,1.00±0.11))明显降低(t=6.15,4.97;P＜0.01或P＜0.05),但PBC患者与健康个体细胞毒性T细胞(0.98±0.15,1.00±0.12,t=0.22,P＞0.05)和B细胞(0.91±0.06,1.00±0.14；t=0.97,P＞0.05)内miR-146a的表达量之间的差异无统计学意义.抗CD3和抗CD28可以诱导辅助性T细胞表达miR-146a(刺激前:1.00±0.18；刺激后:9.12±2.05；t=8.81,P＜0.01).PBC患者辅助性T细胞较健康个体具有较强的增殖能力{PBC:0.35±0.06[吸光度(A值)]；健康个体:0.26±0.04(A值)；t=2.83,P＜0.05}以及释放IL-2[ PBC (686±109)pg/ml;健康个体(512±72) pg/ml；t=2.96,P＜0.05]的能力.miR-146a可以抑制PBC患者T细胞的增殖以及分泌IL-2的能力.结论 miR-146a可以负向调控活化的PBC患者辅助性T细胞增殖以及分泌IL-2的能力.PBC的发病机制可能与患者辅助性T细胞内miR-146a表达降低、对细胞增殖的抑制作用减弱有关.     

MicroRNA-377和组蛋白甲基转移酶SMYD3在肝细胞癌中的表达及两者的相关性

目的:探讨microRNA-377(miR-377)与组蛋白甲基转移酶SMYD3在肝癌中的表达规律及与肝癌的相关性.方法:利用实时定量PCR分别检测不同肝组织及肝细胞系中miR-377表达水平, 应用实时定量PCR和Western blot分别检测不同肝组织及肝细胞系中SMYD3 mRNA和蛋白水平的表达情况. 通过转染miR-377模拟物上调其在肝癌细胞株HepG2中表达后, 应用实时定量PCR、Western blot分别检测转染前后HepG2中SMYD3 mRNA和蛋白表达的变化.结果:MiR-377 mRNA在人肝癌旁组织和肝癌组织中的表达较正常肝脏明显降低(0.331±0.059, 0.139±0.064 vs 0.874±0.178, 均P <0.05);在HepG2中的表达较L-02明显降低(0.145±0.021 vs 0.868±0.194, P <0.05).SMYD3 mRNA和蛋白质在人肝癌旁组织和肝癌组织中的表达较正常肝脏明显升高(mRNA: 3.836±0.137, 5.836±0.965 vs 1.235±0.332;蛋白: 0.381±0.020, 0.484±0.030 vs 0.252±0.015;均P <0.05). SMYD3 mRNA和蛋白质在肝癌细胞系HepG2中的表达较正常肝细胞系L-02明显升高(mRNA: 0.845±0.047vs 0.348±0.134;蛋白: 0.575±0.008 vs 0.259±0.007, 均P <0.05). 转染miRNA-377模拟物上调HepG2中miR-377表达后转染组SMYD3mRNA和蛋白表达较空白组和阴性对照组均明显下降(mRNA: 0.125±0.010 vs 0.857±0.163, 0.779±0.167;蛋白: 0.092±0.026 vs0.347±0.040, 0.383±0.054, 均P <0.05).结论:miRNA-377在肝癌中表达明显下调,其靶基因SMY D3表达上调;表达下调的miRNA-377丧失对SMYD3表达的抑制可能是肝癌发生的重要机制.