内皮抑素基因定点突变体的构建

目的:内皮抑素是一种内源性的血管生成抑制剂。运用定点突变技术对人内皮抑素基因进行改造,将内皮抑素中的RGAD改为RGD序列。构建野生型和突变型RGD-en-dostatin基因的真核表达载体,为进一步探讨其对角膜新生血管的影响奠定基础。方法:以pMD18-T/endostatin载体为模板扩增野生型内皮抑素基因全长编码序列,克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP上,采用快速体外定点诱变技术获得RGD突变体。经PCR,酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。结果:PCR成功扩增了野生型和RGD突变型的内皮抑素基因,并成功构建了其真核表达载体。结论:改造的含有RGD结构的内皮抑素基因真核表达质粒的成功构建并鉴定。     

小鼠野生型和截短型睫状神经营养因子基因的克隆及真核表达

目的构建野生型和截短型小鼠睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)基因的真核表达载体,并在ARPE-19细胞系表达目的蛋白。方法通过逆转录聚和酶链反应(RT-PCR)扩增小鼠CNTF野生型全长编码序列,体外定点突变获取截短型CNTF的互补DNA编码序列,将上述两序列分别克隆至pTracer-CMV真核表达载体,转染ARPE-19细胞,免疫印迹检测2种CNTF的表达。结果PCR成功扩增了野生型和截短型CNTF基因,DNA序列分析证实2种真核表达载体中的CNTF序列与Gene Bank中目的序列一致。2种重组真核表达质粒转染ARPE-19细胞后,免疫印迹证实CNTF在ARPE-19细胞培养上清中有表达。结论野生型和截短型CNTF基因在ARPE-19细胞系的真核表达为视网膜色素变性基因治疗研究奠定了基础。     

小鼠睫状神经营养因子基因在视网膜色素上皮细胞系ARPE-19细胞中表达的研究

目的探讨野生型和截短型小鼠睫状神经营养因子（CNTF）基因的真核表达及其在视网膜色素上皮细胞系ARPE-19细胞中目的蛋白的表达及意义。方法通过逆转录聚和酶链反应（RT-PCR）扩增小鼠CNTF野生型全长编码序列,体外定点突变获取截短型CNTF的互补DNA（cDNA）编码序列,构建上述两序列分别克隆至pTracer-CMV真核表达载体,转染ARPE-19细胞,免疫印迹检测两种CNTF的表达。通过噻唑蓝（MTT）和流式细胞仪定量凋亡检测观察两种CNTF基因在去血清培养的ARPE-19细胞中表达后产生的生物学效应。结果PCR成功扩增了野生型和截短型CNTF基因,DNA序列分析证实两种真核表达载体中的CNTF序列与GeneBank中目的序列一致。两种重组真核表达质粒转染ARPE-19细胞后,免疫印迹检测结果证实CNTF在ARPE-19细胞培养上清中有表达。MTT检测结果显示CNTF不能促进ARPE-19细胞的增殖,流式细胞仪凋亡分析提示CNTF在一定程度上可以抑制去血清培养引起的ARPE-19细胞凋亡。结论野生型和截短型CNTF基因在ARPE-19细胞系的真核表达为视网膜色素变性基因治疗研究奠定了基础。     

人TGFBI基因克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆人TGFBI基因,并构建其真核表达载体.方法:通过RT-PCR从供体角膜移植术后留下的角膜组织中克隆人TGFBI基因全长编码区,将该DNA片断亚克隆到克隆载体pMD18-T中,进一步通过和SalI双酶切将目的片断定向克隆至真核表达质粒载pCI中.经PCR,酶切和序列测定方法鉴定重组质粒.结果:获得了人TGFBI的编码基因,并成功建了其真核表达载体.结论:人TGFBI基真核表达质粒的成功构建并鉴定.     

先天性核性白内障家系致病基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的克隆1个先天性核性白内障家系致病基因-突变型GJA8（mGJA8）,研究其编码的蛋白质在真核细胞系中的表达和定位。方法从研究发现的先天性核性白内障家系患者基因组中扩增突变型mGJA8,克隆入载体pGEF—T,然后酶切,定向克隆到真核表达质粒pEGFP-N1中,构建pEGFP—N1-mGJA8重组表达质粒,然后用限制性内切酶消化和DNA测序鉴定,最后通过脂质体包埋转染法,用pEGFP—N1-mGJA8和pEGFP—N1质粒转染COS-7细胞,荧光显微镜观察其在COS-7细胞内的表达,采用细胞免疫组织化学法验证蛋白表达。结果经双酶切和DNA序列测定,证实致病基因mGJA8重组质粒构建成功,荧光显微镜观察在COS-7细胞上致病基因mGJA8蛋白表达,细胞免疫组织化学法显示致病基因表达蛋白在COS-7细胞中特异性表达。结论成功克隆出该家系的致病基因mGJA8,并且完成了该致病基因在体外真核细胞中的特异性表达,为进一步研究该家系的发病机制奠定基础。     

A546D突变型TGFBI基因真核表达载体的构建及体外表达

目的 构建A546D突变型TGFBI基因真核表达载体和体外转染体系,为研究野生型及A546D突变型TGFBI基因的功能提供实验基础.方法 应用重叠延伸PCR法定点诱变,构建A546D突变型TGFBI基因真核表达载体,以阳离子脂质体介导体外转染技术瞬时转染人角膜上皮(human corneal epithelium,HCE)细胞,Western Blot法检测转染后培养基中HCE细胞分泌的TGFBI蛋白的表达.结果 重组质粒总长约7.5 kb,由HindⅢ、Xba Ⅰ双酶切鉴定产生5.4 kb和2.1 kb两条片段者为克隆正确质粒.测序鉴定证实了TGFBI基因编码区完整插入到载体pcDNA3.1的多克隆位点中,突变载体的第1685位碱基由C替换为A,使其编码的第546个氨基酸由Ala突变为Asp即A546D突变.野生型及A546D突变型载体转粢入HCE细胞后,TGFBI蛋白有效表达.结论 成功构建了A546D突变型TGFBI基因真核表达载体,为TGFBI基因相关性角膜营养不良致病机制的研究奠定了基础.     

蛋白酶体β5亚单位基因真核表达载体的构建

目的:构建蛋白酶体亚单位β5基因真核表达质粒。方法:从人晶状体上皮细胞株SRA01/04中提取总RNA,经RT-PCR扩增获得β5亚单位的全长cDNA片段,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1上。结果:RT-PCR法扩增出约792bp的β5亚单位基因全部编码序列的片段。酶切鉴定和测序分析证实所插入的β5亚单位的基因序列完全正确。结论:成功构建了蛋白酶体β5亚单位基因真核表达重组质粒。     

大鼠BDNF基因克隆和重组逆转录病毒pLXSN-BDNF的构建

目的克隆大鼠脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factors,BDNF)基因并构建含BDNF基因片段的真核表达载体pLXSN-BDNF,用于视神经损伤修复的基因治疗。方法利用RT-PCR的方法从大鼠海马组织的总RNA中扩增BDNF基因片段,序列两端分别引入限制性内切酶识别位点EcoR I和Xho I,并将其定向克隆入pMD18-T Si mple载体,测序正确后亚克隆入逆转录病毒载体pLXSN。结果经过PCR、酶切和测序鉴定,所克隆的BDNF基因序列正确,克隆的BDNF基因已经正确插入到逆转录病毒载体pLXSN中。结论成功克隆了BDNF基因并且构建了真核表达载体pLXSN-BDNF,为进一步研究基因治疗视神经损伤疾病奠定基础。     

大鼠FOXP3基因的克隆及真核表达载体的构建

目的 构建大鼠F0XP3真核表达载体,为转基因治疗角膜移植免疫排斥反应提供实验基础.方法 采用RT-PCR技术从SD大鼠脾脏扩增FOXP3基因,EcoRI、xhoI双酶切peDNA3.1载体和FOXP3,DNA连接酶连接,构建pcDNA3.1-FOXP3真核表达载体,测序鉴定.结果 从大鼠脾细胞中成功克隆获得了1290bp的FOXP3基因,测序结果表明正确构建了含有FOXP3基因的pcDNA3.1-FOXP3真核表达载体.结论 成功构建了真核表达载体pcLDNA3.1-FOXP3,为进一步研究其对角膜移植免疫排斥反应的影响奠定了基础.     

硅油取出术31例

３１例（３２只眼）行硅油取出术，其取出时间平均为硅油注入术后１３．９个月。取出原因主要为白内障形成、青光眼、硅油乳化等，其中６只眼为视网膜复位稳定无并发症者。硅油取出后，２４只眼视膜在位；２４只眼视力≥０．０２；８只眼发生术后并发症，其中７只眼为复发性视网膜脱离，对硅油取出术的意义和时机进行了讨论。     

RAB31基因的单核苷酸多态与高度近视的相关性

目的 分析高度近视及正常人的RAB31基因的单核苷酸多态(SNP)，探讨其与高度近视发病的关系。方法 收集178例高度近视先证者及71例正常人的外周血DNA，对RAB31基因的外显子及临近内含子序列进行PCR扩增，异源双链一单链构象多态性(HA-SSCP)及测序分析。结果 共发现7个SNP，位于内含子，同时出现在高度近视组和正常对照组中。对照组出现SNP106694C→T频率高于高度近视组，有显著性差异。结论 RAB31基因的SNP不会导致高度近视发病，SNP106694C→T可能是一个保护因子，其机制有待进一步研究。     

眼睑恶性肿瘤手术31例临床分析

目的 分析探讨眼睑恶性肿瘤的诊断及手术效果。方法 分析31例31眼眼睑恶性肿瘤的一般情况、临床表现。结果 基底细胞瘤、磷状上皮癌、睑板腺癌是眼睑部位的主要恶性肿瘤。其治疗方法仍以手术为主，手术效果主要取决于手术早晚、肿瘤的大小及部位。结论 眼睑恶性肿瘤(基底细胞癌、磷状上皮癌、睑板腺癌)手术越早，肿瘤越小，效果越好。     

皮質類固醇性青光眼31例臨床分析

目的 探讨皮质类固醇引起的青光眼的临床特徵及诊治原则。方法 对31例43眼患者病史,糖皮质激素使用情况作回顾性分析,结果 26例(38眼)临床表现为开角型青光眼,28例(40眼)在停用激素和采用抗青光眼药物治疗后,眼压恢复正常;3例(3眼)最终施行抗青光眼手术治疗。结论 临床连用皮质类固醇药物时应随访眼压、眼底。