寨卡病毒NS1单克隆抗体制备及其在临床诊断中的应用

目的用寨卡病毒非结构蛋白NS1免疫小鼠并制备鼠源单克隆抗体,建立捕获ELISA方法检测寨卡病毒NS1蛋白。方法合成NS1基因序列构建真核表达载体pcDNA3.1-NS1,转染HEK293细胞收集上清,经Ni+柱亲和层析法纯化NS1蛋白。以纯化的NS1重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取脾脏进行细胞融合,筛选阳性细胞株,经酶联免疫吸附检测抗体活性和特异性。结果成功表达并纯化NS1重组蛋白,获得7株单克隆抗体,筛选非竞争单抗组合建立捕获ELISA法,该方法可特异性识别NS1重组蛋白,最低检出限为1 ng/ml,且未与其他黄病毒属病毒发生交叉反应。结论成功制备特异性抗寨卡病毒NS1蛋白的鼠源单克隆抗体,建立捕获ELISA法,为寨卡疫情的进一步防控奠定了基础。     

具备中和中东呼吸综合征冠状病毒活性的单克隆抗体的制备

目的制备并鉴定对中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)具有中和活性的单克隆抗体,为进一步开展MERS-CoV感染与免疫保护机制研究,以及发展诊断与治疗手段奠定基础。方法 MERS-CoV S蛋白受体结合区与人IgG Fc片段融合表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过ELISA筛选出阳性克隆,随后通过多次亚克隆筛选出稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单抗腹水并进行抗体效价测定及亚类鉴定;通过MERS-CoV假病毒及活病毒中和试验筛选出中和单抗。结果获得了10株能够稳定分泌抗原特异性单抗的杂交瘤细胞株。制备的腹水单抗亚类均为IgG1;其中7株单抗抗体ELISA效价达到10 000以上,并有1株单抗对MERS-CoV具有良好的中和活性。结论本研究获得了1株对MERSCoV具有良好中和活性的单克隆抗体。     

汉坦病毒单克隆抗体的制备和鉴定

本文用汉坦病毒A16和R22株活毒免疫BALB／c小鼠，取牌细胞与sp2／0骨髓瘤细胞融合，制备了6株分泌抗汉坦病毒单克隆抗体的杂交癌细胞系。单克隆抗体IgG亚类鉴定表明，其中2株为IgG1，1株为IgG2b，3株为IgG2a。用间接免疫荧光检测单抗腹水滴度，分别在1：10240～1：81920之间；用反向被动血凝抑制试验测定单抗腹水，滴度均低于1：20。免疫印迹试验表明，6株单克隆抗体均为抗核蛋白单抗。对已知型别病毒的反应话表明，其中3株为组特异性单抗，1株为汉滩型特异性单抗，2株为汉城型特异性单抗。还用6株单抗对宁夏新分离毒株进行抗原性分析。     

荧光免疫层析技术检测寨卡病毒IgG抗体

目的建立和开发一种高特异性、高灵敏度的寨卡病毒IgG抗体的检测方法。方法本研究对寨卡病毒E蛋白核酸序列优化,减低其交叉反应,经过大肠杆菌诱导表达,亲和层析纯化获得特异性蛋白。将获得的寨卡病毒E蛋白抗原喷于检测区捕获样品中的目标抗体,将羊抗小鼠IgG喷于控制区进行质量控制;将鼠抗体人IgG单克隆抗体标记荧光纳米颗粒(激发谱峰365 nm;发射光谱峰610 nm)作为标记抗体;建立荧光免疫层析试剂,配合荧光免疫检测仪YG10,检测人血清中的寨卡病毒IgG抗体,并对该检测方法进行性能验证。结果寨卡病毒E蛋白经大肠杆菌表达,菌液经过收集并超声后,上清和沉淀分别进行SDS-PAGE鉴定,多存在于沉淀中;纯化后的蛋白经SDS-PAGE鉴定,均呈现较单一的蛋白条带,纯度达到90%以上。建立的荧光层析试剂检测50份正常人血清,荧光免疫检测仪YG1分别扫描读取T、C信号值,读取T/C值,计算平均值(AVERAGE)和标准差(STDEVP),3倍标准差加上平均值作为阳性判断值,即:T/C≥3SD+AVG为阳性;与对比试剂ZIKV IgG酶联免疫试剂盒(Dia.Pro.)同时检测3份寨卡阳性标本均为阳性反应;10份正常人血清均为阴性反应;批内重复性CV≤20%,批间重复性CV≤15%;与相似的蚊媒病毒基孔肯雅病毒、登革病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒均无交叉反应。结论该荧光层析试剂具有较好的灵敏性和特异性,可作为人血清、血浆、全血样本中寨卡病毒IgG抗体的快速筛查。     

H7N9禽流感病毒血凝素线性B细胞抗原表位单克隆抗体的制备和鉴定

目的研制用于H7N9禽流感病毒诊断的血凝素线性B细胞抗原表位单克隆抗体。方法采用H7N9禽流感病毒血凝素特异性线性B细胞抗原表位免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞技术和间接ELISA法筛选、鉴定获得稳定分泌抗H7N9禽流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株;通过SDS-PAGE、间接ELISA和斑点免疫印迹技术鉴定其亚型、效价、纯度等生物学特征。结果共获得2株单克隆抗体(7C8H8和8E9E2),其中7C8H8抗体亚类为IgG2a,腹水抗体效价>1∶512000,且可以特异性结合H7N9禽流感病毒血凝素。8E9E2仅具有较低的H7N9禽流感病毒血凝素蛋白结合力。结论获得1株可分泌高效价、高特异性的抗H7N9禽流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株7C8H8。     

EGFRvⅢ单抗的制备及其特异性的研究

目的 制备EGFR vⅢ单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定.方法 将小鼠骨髓瘤细胞NS-1与免疫的BALB/C小鼠,免疫小鼠脾细胞进行融合,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选出EGFRvⅢ阳性的杂交瘤细胞株,单抗与EGFRvⅢ抗原结合的特性性通过Western blot进行鉴定.建立裸鼠人肺细胞癌和表皮细胞癌移植瘤模型,分别腹腔注射EGFRvⅢ单抗,尼妥珠单抗(Nimotuzumab),生理盐水,观察3组别的抑瘤效果和作用.结果 用单克隆抗体技术筛选得到的杂交瘤细胞株而制备的EGFRvⅢ单抗,经过Western blot鉴定,结果为可以特异性识别EGFRvⅢ.EGFRvⅢ单抗,尼妥珠单抗对人表皮细胞癌移植瘤的抑瘤率分别为84％和86.3％.结论 通过杂交瘤技术制备的EGFR vⅢ单克隆抗体,特异性好,在抑制肿瘤方面效果显著,对进一步的机制研究和临床应用有一定价值.     

酶联免疫吸附试验间接抗体夹心检测SARS-CoV抗原方法的建立和应用

目的制备和鉴定严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳(N)蛋白单克隆抗体(rnAb)和多克隆抗体建立SARS—CoVN抗原捕获抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)方法用于SARS-CoV感染的早期诊断。方法用基因重组SARS-CoV N蛋白免疫BALB/c小鼠和新西兰大白兔制备mAb和多克隆抗体，采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定，用单克隆抗体与兔多克隆抗体进行配对试验，建立抗原捕获抗体夹心ELISA法测定SARS-CoV N抗原。结果获得9株特异性针对SARS-CoV N蛋白的mAb和高效价的兔多克隆抗体，通过高亲和力的mAb与兔多抗的配对试验，筛选出3株单抗N1E8、N8E1和N10E4混合作为捕获抗体，与兔多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG组合作为测定抗体，建立了抗体夹心ELISA法，测定重组SARS-CoV N蛋白最高灵敏度为50pg／ml，特异性达99．86％，测定420份血清学确诊的SARS患者血清，其中发病1—10天阳性检出率为90.1％，11—20天检出率为23％，21天以上均为阴性，与其他呼吸道病毒和冠状病毒无交叉反应。结论获得特异性好、亲和力高的单克隆抗体和高效价的兔多克隆抗体，经过抗体的配对和优化，建立了一种灵敏度高、特异性强的SARS-CoV抗原的ELISA捕捉法．可应用于SARS早期诊断、溯源及流行病学研究。     

哺乳动物细胞西尼罗病毒样颗粒表达、纯化及其鉴定

目的利用哺乳动物细胞表达含有西尼罗病毒(WNV)prM和E蛋白,形成病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),为西尼罗病毒感染的免疫诊断试剂的研制奠定基础。方法筛选典型西尼罗病毒株,构建重组质粒,转染293T细胞,表达并纯化西尼罗病毒prM-E蛋白,利用透射电镜、免疫印迹试验、间接免疫荧光实验(IFA)和酶链免疫吸附试验(ELISA)对表达产物进行鉴定。结果重组质粒转染细胞后产生病毒样颗粒(viruslike particles VLPs),转染细胞上清纯化物中透射电镜观察到重组蛋白形成的球型颗粒,免疫印迹试验和间接免疫荧光试验表明,表达的病毒样颗粒蛋白能够与抗西尼罗病毒抗体特异结合,具有良好的抗原性;间接ELISA证实,重组蛋白可以作为抗原用于检测患者血清特异性抗体。结论在哺乳动物细胞中表达的西尼罗病毒样颗粒具有良好的抗原性,为西尼罗病毒感染快速特异诊断试剂研制奠定了基础。     

分泌甲型肝炎单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

1985年以来,我们开展了甲型肝炎单克隆抗体的研究。实验用提纯的粪便甲肝病毒抗原免疫Balb/c鼠,取其免疫脾细胞与SP2/o骨髓瘤细胞融合杂交,然后用固相酶联免疫测定法(ELISA)和间接免疫荧光法(IF)筛选.二次融合试验共筛出6个分泌抗甲型     

结核分枝杆菌Rv3428c重组蛋白表达与纯化及其单克隆抗体的制备

目的 制备并鉴定Rv3428c的单克隆抗体，为结核分枝杆菌快速特异性抗原检测奠定基础。方法 同源重组得到pET28a-Rv3428c表达载体，转入E.coli BL21(DE3)后进行IPTG诱导表达，用Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白。重组蛋白免疫小鼠后进行细胞融合，间接ELISA、Western Blot筛选阳性杂交瘤细胞系，以筛选获得的阳性杂交瘤细胞诱导小鼠产生腹水，蛋白A亲和层析法纯化抗体，BCA法测定浓度，ELISA和SDS-PAGE进行单克隆抗体的鉴定及亚型和效价的测定。结果 成功构建pET28a-Rv3428c表达载体、表达并纯化出目的蛋白。Rv3428c蛋白免疫小鼠使小鼠产生致敏B淋巴细胞，在聚乙二醇作用下，淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。筛选得到的阳性杂交瘤细胞株，通过体内诱生法制备获得Rv3428c单克隆抗体。该单抗属于IgG2a亚类，κ型轻链，效价约为1∶128 000,浓度为4 mg/ml。结论 本研究制备并纯化了Rv3428c重组蛋白，获得了抗Rv3428c单克隆抗体，为Rv3428c用于结核分枝杆菌快速特异性抗原检测奠定基础。