Vero/Slam细胞在麻疹病毒分离中的应用

目的评价Vero/Slam细胞对麻疹病毒的敏感性,以及麻疹病毒在Vero/Slam细胞上的生长特点。方法组织细胞培养法分离病毒,将标本接种到长满单层的Vero/Slam细胞上,盲传3代,观察细胞病变(CPE)。将分离到的麻疹病毒通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增出核蛋白(N)基因碳末端450个核苷酸片段,对其产物测定基因序列以定型。结果Vero/Slam细胞对麻疹病毒高度敏感,其CPE特点是典型的细胞融合性病变。此次分离到的麻疹病毒为H1基因型,和中国的本土优势流行株相符。结论Vero/Slam细胞对麻疹病毒敏感,可在麻疹病毒分离中选用。     

2008年-2012年江西省麻疹病毒分离株H基因特征分析

目的分析江西省麻疹病毒分离株的分子生物学特征,掌握江西省目前麻疹病毒流行株的基因特性。方法采用淋巴信号激活因子转染的非洲绿猴肾细胞(Vero/SLAM)对2008年-2012年疑似麻疹患者咽拭子标本进行麻疹病毒分离,分离到的毒株通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增麻疹病毒血凝素(hemagglutinin,H)基因,并对扩增出的核苷酸序列进行测定,与Gen Bank中麻疹病毒各基因型参考株比较并分析毒株变异情况。结果 2008年-2012年江西省麻疹病毒分离株均为麻疹H1基因型,属于我国麻疹病毒的优势株。13株麻疹病毒分离株之间H基因氨基酸的同源性为98.1%~100.0%;与H1基因代表型China93-7的H基因氨基酸同源性为97.2%~98.1%;与中国疫苗株沪191株的H基因氨基酸同源性为94.8%~95.6%。结论 2008年-2012年江西省麻疹病毒流行株为H1基因型,说明江西省近年来麻疹的流行株仍然是H1基因型。     

2008-2012年江西省麻疹病毒分离株N基因特征分析

摘要:目的　分析江西省麻疹病毒分离株的分子生物学特征,掌握该省目前麻疹病毒流行株的基因特性。方法　采用Vero/SLAM细胞对2008-2012年疑似麻疹患者咽拭子标本进行麻疹病毒分离,分离到的毒株通过RT-PCR方法扩增麻疹病毒核蛋白（Nucleoprotein,N）基因,并对扩增出的核苷酸序列进行测定,与GenBank中麻疹病毒各基因型参考株比较并分析毒株变异情况。结果　2008-2012年江西省麻疹病毒分离株均为麻疹H1基因型,属于我国麻疹病毒的优势株。13株分离株之间N基因氨基酸的同源性为98.1%～100%;与H1基因代表型China93-7的N基因氨基酸同源性为97.5%～98.7%;与中国疫苗株沪191株的N基因氨基酸同源性为95.0%～96.2%。结论　2008-2012年江西省麻疹病毒流行株为H1基因型,说明江西省近年来麻疹的流行株仍然是H1基因型。     

2006年长春市儿童野生型麻疹病毒基因序列分析

目的:研究吉林省长春市0~12周岁儿童野生型麻疹病毒的基因型别及核蛋白(N)基因序列特征,探讨控制麻疹发生的措施。方法:采用Vero/SLAM细胞分离培养麻疹病毒,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法从分离的麻疹病毒中扩增核蛋白(N)基因羧基端450个核苷酸片段(bp)并进行核苷酸测序分析,对基因库中麻疹病毒的22个代表株基因序列的同源性进行比较。结果:分离得到9株野生型麻疹病毒,N基因与H1基因型代表株相比同源性为98.3%。结论:吉林省长春市麻疹流行株属于H1基因型。     

2015年黔东南地区麻疹病毒分离株基因特征分析

目的 分析2015年黔东南地区麻疹病毒基因型别和特征。方法 采集疑似麻疹病例临床咽拭子标本,经Real - time RT - PCR初筛为麻疹病毒核酸阳性,使用Vero/SLAM细胞进行病毒分离,对阳性分离物提取病毒RNA,采用RT - PCR方法扩增麻疹病毒N基因羧基末端编码的634个核苷酸片段,并进行测序与分析。结果 35例疑似麻疹病例中检测到4例麻疹病毒阳性核酸,经分离得到2株麻疹病毒。基因亲缘关系显示2株为H1基因型中的H1a基因亚型。2株麻疹病毒株与H1基因型参考株MVi/Hunan.CHN/0.93/7(AF045212)比较,核苷酸和氨基酸同源性分别为97.7%和98.0%;与H1a基因亚型参考株Chin9322比较,核苷酸和氨基酸同源性分别为98.9%和99.3%;2株H1a基因亚型与往年及本省流行的麻疹病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.2%～100%和98.0%～100%。结论 黔东南地区2015年分离到的麻疹病毒为H1a基因亚型,与贵州省本土麻疹流行的优势基因亚型一致。     

南康市2007年一起麻疹暴发的分子生物学研究

[目的]分析南康市麻疹暴发的分子生物学特征,掌握麻疹病毒的基因特性.[方法]采用Vero/SLAM细胞对2007年暴发疫情患者咽拭子标本进行麻疹病毒分离,通过RT-PCR方法扩增麻疹病毒分离株核蛋白(nucleoprotein,N)基因,并对扩增出的核苷酸序列进行测定和分析.[结果]2007年南康市麻疹病毒分离株为麻疹H1基因型,属于我国麻疹病毒的优势株.两株分离株之间N基因氨基酸的同源性为98.7%;与中国疫苗株沪191株的N基因氨基酸序列比较,其同源性分别为94.7%和96.O%.[结论]南康市此次麻疹暴发疫情病毒分离株为H1基因型,并与中国疫苗株沪191株在基因特性上有明显差异.     

四川省2003～2005年麻疹野病毒分离株基因特征分析

目的了解四川省2003~2005年流行的麻疹野病毒分离株基因特征,为控制、消除麻疹提供科学依据。方法用B95a、Vero/Slam细胞从疑似麻疹爆发和散发患者的标本中分离麻疹病毒,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从分离到的22株麻疹病毒中扩增出核蛋白(nucleoprotein,N)基因羧基末端676个核苷酸片段,再对扩增产物进行核苷酸序列测定和分析,并以C末端456个核苷酸片段构建基因亲缘性关系树,进行核苷酸、氨基酸同源性分析。结果四川省2003~2005年从6个市(自治州,下同)分离的22株麻疹野病毒全部为H1基因型,除2株为H1b基因亚型外,其余均为H1a基因亚型。22株麻疹野病毒的核苷酸同源性为96.2%~100.0%,氨基酸同源性为95.3%~100.0%。四川省11株麻疹病毒代表株与中国S191疫苗株的核苷酸同源性为90.0%~92.5%,氨基酸同源性为86.7%~91.6%。结论四川省2003~2005年流行的麻疹野病毒以H1a为绝对优势基因亚型,H1b为弱势基因亚型,未发现H1c基因亚型。其中以H1a基因亚型为主的病毒株引起的多个传播链造成四川省各市的麻疹流行。     

浙江省2005年麻疹病毒流行株基因特性分析

目的分析浙江省2005年麻疹病毒流行株的基因特性.方法对暴发疫情中分离的4株麻疹病毒采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增血凝素蛋白（H）和核蛋白（N）基因,纯化产物进行核苷酸序列测定.结果浙江省2005年分离到的4株麻疹病毒流行株均为麻疹H1基因型,属于中国麻疹病毒优势基因型.各分离株之间H基因氨基酸同源性为99.2%～99.7%,N基因氨基酸同源性为99.8%;与中国疫苗株沪191株的H基因和N基因比较,其氨基酸水平上的同源性分别为95.2%～95.5%和95.5%.结论浙江省2005年分离到的麻疹病毒流行株属于同一性状毒株,均为H1基因型;与中国疫苗株沪191株相比较,两者在基因特性上存在明显差异.     

宁波市麻疹病毒血凝素基因的序列分析

目的：探讨现阶段在宁波市流行的麻疹野病毒的基因型别和特征。方法：在2004年和2005年医院住院麻疹病人中采集含漱液分离麻疹病毒，获得8株麻疹野病毒。通过RT-PCR方法扩增其中两株麻疹病毒血凝素（H）基凼全序列并对其进行序列测定和分析。比较这两株麻疹病毒和Genbank中麻疹病毒的各基因型代表株的同源性。结果：两株宁波麻疹毒株ningbo04-2和ningbo05-2的H基因之间核苷酸同源性为97．7％，与川基因型代表株China93-7之间核苷酸同源性分别为98．3％，97．7％。与它们在核苷酸水平上同源性最高的毒株分别是zhejiang05-2，china94-7，其同源性分别达到99，7％，99．4％。ningbo04-2在氨基酸240位由丝氨酸（S）突变成天冬酰胺（N），造成一个潜在的N型糖基化位点丢失。结论：宁波市麻疹流行株属于H1型，至少存在H1a，HIb两组。     

宁波市1988--2007年伤寒副伤寒流行病学和病原学研究

目的 探讨伤寒副伤寒高发地区的流行病学和病原学特征.方法 运用描述流行病学与分析流行病学对1988-2007年伤寒副伤寒疫情资料和暴发资料进行分析.采集市场贝壳类海产品进行污染情况检测,并对患者中分离到的菌株进行实验室系统研究.结果 1988-2007年全市累计报告伤寒副伤寒病例19 404例,死亡7例,年平均发病率为17.68/10万,病死率为0.36‰.发病呈现周期性波动,冬春季高发,且存在明显地区聚集性,发病以20～50岁年龄的青壮年为主.流行菌株以甲型剐伤寒沙门菌为主.传播因素调查分析显示,居民生吃毛蚶和牡蛎是造成伤寒副伤寒高发的主要危险因素;同时从市场所采集的毛蚶和牡蛎中,各检出1株甲型副伤寒沙门菌,并带有TEM-1型耐药基因.甲型副伤寒沙门菌在海产品牡蛎中存活观察试验证实菌株在带壳牡蛎活体水体中至少能存活10 d以上.PFGE基因分型表明,X2型是宁波地区甲型副伤寒优势流行株.结论 宁波地区居民生吃毛蚶和牡蛎是造成伤寒副伤寒高发的丰要危险因素,加强对贝壳类海产品的卫生监督管理和对居民的健康教育是预防控制伤寒副伤寒的关键措施.     

宁波市水痘-带状疱疹病毒流行株基因分型

目的分析浙江省宁波市2009—2010年水痘的流行病学特征,以及水痘-带状疱疹毒流行株基因分型特征,为预防控制水痘提供依据。方法根据法定传染病报告系统、宁波市全国突发公共卫生事件报告管理系统的水痘发病资料,收集数据并统计分析;同时对部分临床诊断水痘病例采集疱疹液标本,采用MRC-5细胞进行VZV分离,并提取脱氧核糖核酸进行聚合酶链反应,并对扩增产物测序,分析其基因型别。结果宁波市2009、2010年水痘报告发病率分别为23.33/10万和26.24/10万,各县(市)区均有病例报告,发病年龄组以7～12岁儿童发病率最高(245.21/10万),存在2个发病时间高峰,分别为5～6月份和11～12月份。15例患者水痘病毒核酸检测阳性,13例患者VZV为J型毒株,2例为M1型。结论宁波市水痘病例主要发生在冬春季节,主要以7～12岁及学龄儿童为主,J型毒株目前为本市流行主要毒株,但也有M1型毒株的局部流行。     

不同人群血清对麻疹疫苗株与流行株的中和能力比较

目的探讨不同人群血清对麻疹流行株与疫苗株中和能力的差异。方法采集麻疹患者急性期与恢复期血清、麻疹疫苗免疫前后儿童血清以及流动人口血清，分别对疫苗株沪191与2005年麻疹流行株进行中和抗体（NT）滴度测定。同时，利用疫苗株、浙江省当地流行株制备动物免疫血清，与相应毒株进行交叉中和试验，测定各毒株之间抗原比。结果疫苗免疫后儿童血清对疫苗株的中和抗体几何平均滴度（GMT）为50.82，高于流行株MVi／ZJ／05／7（GMT值为27．35）1．86倍；患者恢复期血清对流行株的中和能力（GMT值为386．95）显著高于疫苗株（GMT值为151．83）；流动人口血清对流行株中和抗体GMT值均小于疫苗株，差异为2．22～4．17倍；MVi／ZJ／99／1、MVi／ZJ／04／1和MVi／ZJ／05／7与疫苗株间抗原比分别为4．28、5．24和5．66。此外，部分患者急性期血清对疫苗株存在低滴度的中和抗体，GMT值1：4左右。结论不同人群血清对麻疹疫苗株与流行株的中和能力的差异有统计学意义，低滴度的疫苗抗体不能有效保护个体免受麻疹流行毒株的侵袭，应加强麻疹病毒变异与疫苗效果的相关研究。     

宁波市2005-2012年登革热流行情况及其传播媒介调查

目的分析宁波市2005-2012年登革热病例流行病学特征,并结合病媒生物监测数据,分析宁波市出现登革热流行的风险。方法采用Excel2003软件分析宁波市登革热病例的流行病学特征;采用CO_2诱蚊灯法调查宁波市蚊类种群构成及其密度。结果2005-2012年宁波市累计报告11例登革热病例,均为输人性病例,其中25～50岁有8例,男女性别比为1．75：1。患者职业分布以商务人员为主（36．37％）。白纹伊蚊是宁波市登革热传播主要媒介蚊种。结论宁波市白纹伊蚊广泛存在,输入性病例逐年增多,存在发生登革热流行的风险。应继续做好蚊类监测,预防登革热流行的发生。     

宁波地区2014年麻疹流行情况及病毒基因型分析

目的 了解宁波市2014年麻疹流行情况以及病毒基因型特征.方法 采用描述流行病学方法分析法定传染病报告系统中2014年宁波市麻疹病例相关资料.采用RT-PCR对85份含漱液样本进行麻疹病毒分离,对所得麻疹分离株核蛋白羧基末端450个核苷酸进行扩增和序列测定,并与基因库中麻疹病毒各基因型参考株比对分析.结果 宁波市2014年麻疹确诊病例共176例,0～1岁组发病率最高(58.43/10万);发病主要集中在2-4月份(138例,78.41％).其间象山县发生2起麻疹暴发疫情(第1起20例,第2起16例).85份含漱液样本共分离得到23株麻疹分离株,分为两簇:其中B3基因型11株,均来源于象山县,与当时流行于英国的B3基因型麻疹毒株高度同源;另一簇为H1a亚型12株,来源于其他县市,与中国大陆近年流行株高度同源.B3基因型与中国疫苗株S191之间核苷酸和氨基酸的同源性分别为91.1％～93.2％和86.4％～88.6％,H1基因型与S191同源性分别为89.7％～90.6％和84.8％～87.9％.结论 宁波市2014年麻疹病例主要由本土流行株(H1a亚型)引起,B3基因型仅引起局部流行.我国的麻疹疫苗S191株可能对B3基因型及H1a基因型麻疹病毒感染仍有一定的保护作用.     

宁波地区新生儿轮状病毒VP7基因序列分析

目的研究宁波地区新生儿轮状病毒流行株VP7基因的分子生物学特点以及遗传变异规律。方法通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测新生儿病毒性腹泻便样中的轮状病毒核酸;选择特殊电泳带型样品通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增VP7全基因并测序;测序结果利用DNAstar和Blast软件进行比对。结果通过PAGE发现11份样品中有9份阳性样品,其中带型为4-2-3-2的有7份,带型为3-2-2-2和4-2-1-2的各1份。3种带型各选一株进行VP7基因的扩增并测序,测序结果经分析发现,06NB3和06NB9与G1型标准株Wa的核苷酸同源性为84.4%和91.5%,氨基酸同源性分别为87.4%和94.8%,06NB2与G3型标准株YO的核苷酸同源性为95.3%,氨基酸的同源性为96.6%。结论宁波地区在新生儿中有A组轮状病毒流行,其电泳带型以典型的4-2-3-2为主,也可见特殊带型。06NB3和06NB9的VP7基因片段属G1型,06NB2则属于G3型。06NB3与国内外近几年流行的G1型毒株基因序列有较大差异,06NB9和06NB2则差异较小。     

Differentiation of a Vero cell adapted porcine epidemic diarrhea virus from Korean field strains by restriction fragment length polymorphism analysis of ORF 3

A porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) designated DR13 was isolated in Vero cells and serially passaged by level 100. The virus was titrated at regular intervals of the passage level. Open reading frame (ORF) 3 sequences of the virus at passage levels 20, 40, 60, 80, and 100 were aligned and compared using a computer software program. Suitability of the restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis for differentiating the virus from other Korean field strains was investigated. The DR13 field isolate was successively adapted in Vero cells as observed through polymerase chain reaction (PCR) and titration of the virus. RFLP analysis identified change in cleavage sites of HindIII and Xho II from passage levels 75 and 90, respectively; these RFLP patterns of ORF 3 differentiated the Vero cell-adapted virus from its parent strain, DR13, and 12 other strains of PEDV studied. The cell adapted DR13 was tested for its pathogenicity and immunogenicity in piglets and pregnant sows. The results indicated that cell adapted DR13 revealed reduced pathogenicity and induced protective immune response in pigs. Differentiation between highly Vero cell-adapted virus and wild-type virus could be the marker of adaptation to cell culture and a valuable tool for epidemiologic studies of PEDV infections. The results of this study supported that the cell attenuated virus could be applied as a marker vaccine candidate against PEDV infection.     

A Vero-cell-adapted vaccine donor strain of influenza A virus generated by serial passages

A cell culture-based vaccine production system is preferred for the large-scale production of influenza vaccines and has advantages for generating vaccines against highly pathogenic influenza A viruses. Vero cells have been widely used in human vaccine manufacturing, and the safety of these cells has been well demonstrated. However, the most commonly used influenza-vaccine donor virus, A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) virus, does not grow efficiently in Vero cells. Therefore, we adapted the PR8 virus to Vero cells by continuous passaging, and a high-growth strain was obtained after 20 passages. Sequence analysis and virological assays of the adapted strain revealed that mutations in four viral internal genes (NP, PB1, PA and NS1) were sufficient for adaptation. The recombinant virus harboring these mutations (PR8-4mut) displayed accelerated viral transport into the nucleus and increased RNP activity. Importantly, the PR8-4mut could serve as a backbone donor virus to support the growth of the H7N1, H9N2 and H5N1 avian viruses and the H1N1 and H3N2 human viruses in Vero cells without changing its pathogenicity in either chicken embryos or mice. Thus, our work describes the generation of a Vero-adapted, high-yield PR8-4mut virus that may serve as a promising candidate for an influenza-vaccine donor virus.     

Outbreak of Serratia marcescens colonization and infection traced to a healthcare worker with long-term carriage on the hands.

OBJECTIVE: To reveal the source of a nosocomial outbreak of colonization and infection with a strain of Serratia marcescens positive for Guiana extended-spectrum beta-lactamase 1 (GES-1) that occurred among patients in a neurosurgical intensive care unit (ICU) in a Dutch university medical center from May 2002 through March 2003. METHODS: Samples from the environment and from the hands of healthcare workers (HCWs) were cultured. A retrospective case-control study was carried out. RESULTS: Fifteen neurosurgical ICU patients who had 1 or more cultures that yielded the epidemic strain of S. marcescens from May 2002 through March 2003 were defined as case patients and matched with 30 control patients. Environmental cultures did not reveal a prominent source of S. marcescens. Cultures of specimens from the hands of 100 HCWs revealed colonization of a single HCW with the epidemic strain. Although this HCW instantly went on leave, serial cultures detected prolonged carriage of the epidemic strain on the hands of the HCW for 3 months. The skin of the HCW's hands was psoriatic. The epidemic abruptly ended after the colonized HCW went on leave. Retrospective case-control analysis showed that the patients colonized or infected with S. marcescens received significantly more nursing care from the colonized HCW than did control patients (P<.05). From February 2004 through October 2004, a second cluster of 3 patients was detected with the epidemic strain of S. marcescens. In October 2004, the formerly colonized HCW appeared to have carriage of the epidemic strain on the hands again. CONCLUSIONS: A single HCW with the epidemic strain of S. marcescens on the hands was considered the source of this outbreak.