沉默HOXC8增加A549细胞对放射敏感性作用机制研究

目的 探讨HOXC8对非小细胞肺癌A549细胞放射敏感性影响及潜在机制,以期为临床联合治疗提供新思路。方法 慢病素感染构建稳定沉默HOXC8的A549细胞,qPCR和蛋白印迹法进行验证;克隆形成实验检测A549稳转株对放射敏感性影响;蛋白印迹法检测沉默HOXC8后TGF-β1及其下游信号蛋白表达变化。结果 成功构建沉默HOXC8的A549稳转株;沉默HOXC8后A549细胞活力和克隆形成能力显著降低;沉默HOXC8后也增加了A549细胞对放射的敏感性;沉默HOXC8显著抑制了TGF-β1及其下游信号蛋白p-Smad2/3表达。结论 沉默HOXC8可能通过抑制TGF-β1信号转导增加A549细胞对放射的敏感性,HOXC8可能在其中起重要作用。     

沉默ANO9增加胰腺癌细胞AsPC-1放射敏感性的实验研究

目的 探讨ANO9对胰腺癌细胞AsPC-1放射敏感性的影响,以期为胰腺癌临床放射治疗提供新的增敏靶点。方法 蛋白印迹法检测胰腺癌细胞系(BxPC-3、PANC-1、AsPC-1)和正常胰腺细胞系中ANO9表达水平;慢病素感染构建沉默ANO9的AsPC-1稳转株,并用蛋白印迹法进行验证;MTT检测沉默ANO9对放射照射后AsPC-1细胞活力的影响;平板克隆形成实验检测沉默ANO9对AsPC-1细胞放射敏感性的影响;蛋白印迹法检测沉默ANO9对EGFR/ERK信号蛋白表达的影响。结果 与正常胰腺细胞系相比,3个胰腺癌细胞系中ANO9表达均增加(均P<0.05);沉默ANO9后细胞中ANO9蛋白表达水平较对照组显著降低(P<0.05),成功构建沉默ANO9的AsPC-1稳转株;沉默ANO9后AsPC-1细胞对放射照射的敏感性明显增加,放射增敏比为1.57,细胞中EGFR/ERK信号蛋白EGFR和p-ERK1/2均下调(均P<0.05)。结论 沉默ANO9能够显著增加胰腺癌细胞AsPC-1的放射敏感性,其机制可能与抑制EGFR/ ERK信号转导有关,ANO9可能成为遏制胰腺癌进展的新靶标。     

丹酚酸B对非小细胞肺癌细胞放射敏感性影响及机制研究

目的 探讨丹酚酸B对人非小细胞肺癌放射敏感性的影响及其可能机制。方法 MTT检测丹酚酸B对非小细胞肺癌A549、H1299细胞系的毒性作用。克隆形成实验检测丹酚酸B对放射敏感性的影响。Transwell实验检测丹酚酸B对肿瘤细胞迁移能力影响。蛋白印迹法检测丹酚酸B调控射线诱导的去泛素化酶OTUD7B及迁移标志蛋白MMP-2、MMP-9、E-cadherin、AKT及p-AKT的表达。结果 丹酚酸B能抑制A549、H1299细胞增殖。克隆形成实验显示丹酚酸B可增加A549、H1299细胞放射敏感性,放射增敏比分别为1.45、1.38。Transwell实验结果显示丹酚酸B可抑制细胞迁移能力(P<0.05)。蛋白印迹法结果示射线诱导A549、H1299细胞OTUD7B表达并有时间依赖性,而丹酚酸B能通过阻抑OTUD7B表达进而抑制MMP-2、MMP-9、p-AKT表达、促进E-cadherin表达。结论 丹酚酸B具有增强A549、H1299细胞放射敏感性的作用,其可能机制是丹酚酸B通过下调射线诱导的OTUD7B表达,抑制上皮-间质转化的进程而实现的。     

沉默lncRNA HOTTIP通过上调miR-663a表达增加非小细胞肺癌细胞系放射敏感性

目的 探讨lncRNA HOTTIP通过调控miR-663a表达对4个非小细胞肺癌细胞系放射敏感性影响。方法 用0、2、4、6、8 Gy分别照射H838、H157、A549、H1299细胞系,采用克隆形成实验检测细胞存活情况。qRT-PCR检测细胞中HOTTIP和miR-663a表达水平。以A549、H1299细胞为研究对象,沉默HOTTIP表达、过表达miR-663a后用克隆形成实验检测细胞存活情况。流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot检测Cleaved caspase-3、Cleaved PARP和γ-H2AX表达。双荧光素酶报告基因实验和qRT-PCR检测验证HOTTIP和miR-663a的靶向关系。结果 HOTTIP在放射耐受的H157、A549、H1299细胞中表达上调,miR-663a表达下调。沉默HOTTIP或过表达miR-663a均可抑制A549、H1299细胞存活(放射增敏比分别为1.562、1.507),促进Cleaved caspase-3、Cleaved PARP和γ-H2AX表达,促进放射照射诱导细胞凋亡。miR-663a是HOTTIP的靶基因,HOTTIP可负性调控miR-663a的表达。抑制miR-663a表达可逆转沉默HOTTIP对肺癌细胞系放射敏感性的影响。结论 沉默HOTTIP通过上调miR-663a表达,抑制肺癌细胞系存活,促进其凋亡,从而提高肺癌细胞系的放射敏感性。     

沉默Ku86基因对Hela细胞放射敏感性影响

目的 探讨siRNA沉默Ku86基因表达对宫颈癌Hela细胞放射敏感性的影响。方法 X射线照射后采用qRT-PCR、蛋白印迹法检测Ku86基因在Hela细胞中的表达水平,利用siRNA沉默Ku86基因表达。将si-NC、si-KU86转染到宫颈癌Hela细胞中,0、2、4、6、8、10 GyX射线照射。CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,克隆形成实验分析转染前后细胞放射敏感性变化,检测p53、Caspase-8表达分析沉默Ku86基因表达对放射诱导的细胞凋亡影响。结果 X线照射后Ku86 mRNA和蛋白表达水平上调,沉默Ku86表达降低了Hela细胞的增殖能力和克隆形成能力,放射增敏比为1.57。沉默Ku86表达上调了p53和Caspase-8表达,细胞凋亡增加。结论 siRNA沉默Ku86表达提高了宫颈癌Hela细胞的放射敏感性。     

下调NEK-2表达对人肺癌A549细胞放射敏感性影响

目的 探讨下调NEK-2表达对非小细胞型肺癌A549细胞放射敏感性影响。方法 培养人非小细胞型肺癌A549细胞,通过siRNA技术沉默A549细胞中NEK-2的表达水平,通过蛋白印迹法实验进行验证。采用克隆形成实验检测放射增敏作用,用流式细胞技术检测下调NEK-2表达对辐射诱导A549细胞凋亡和周期的影响,采用免疫荧光实验检测DNA双链断裂和修复情况。结果 NEK-2 siRNA可明显下调A549细胞中NEK-2的表达水平。相对于空白对照组和阴性对照组,下调NEK-2表达能抑制肿瘤细胞的增殖能力,提高A549细胞的放射敏感性,平均致死剂量由1.80 Gy下降至1.40 Gy,放射增敏比值为1.32。下调NEK-2表达可提高因辐射诱导引起的凋亡水平(7.85%~17.17%),使细胞在 G2/M期阻滞(9.23%~30.16%),使DNA双链断裂的数量增加至165%,使DNA双链损伤的修复效率下降至48%。结论 下调A549细胞中NEK-2表达水平能降低细胞的增殖能力,提高细胞放射敏感性,其作用机制可能与细胞周期变化、细胞凋亡以及DNA双链的断裂与修复有关。     

STC1基因对A549细胞放射敏感性影响

目的 探讨斯钙素-1(STC1)基因对人肺癌A549细胞增殖凋亡及放射敏感性影响。方法 将合成的STC1-siRNA及不具有干扰作用的siRNA (阴性对照组)经Lipofectamine^TM2000转染人肺癌A549细胞,并设置空白组,通过Western blotting检测转染48 h后各组细胞STC1的蛋白表达。用克隆形成实验检测A549细胞经STC1-siRNA和照射处理后的增殖情况,用CCK8法检测细胞经STC1-siRNA和STC1-siRNA+8 Gy处理后的活力,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。用Western blotting检测ki67、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、STAT3和磷酸化的信号转导与转录因子3(p-STAT3)的蛋白表达。结果 STC1-siRNA转染的A549细胞STC1的蛋白表达低于空白组(P<0.05)。与单纯照射组比较,转染STC1-siRNA后的增敏比明显升高。与空白组比较,STC1-siRNA组细胞活力及ki67和p-STAT3的蛋白表达均降低,细胞凋亡率和Bax蛋白表达均升高;与STC1-siRNA组比较,STC1-siRNA+8 Gy组细胞活力及ki67和p-STAT3蛋白表达均降低,细胞凋亡率和Bax蛋白表达均升高(P<0.05)。结论 抑制STC1基因表达可增强非小细胞肺癌的放射敏感性并下调STAT3信号通路。     

17-AAG-M诱导人NSCLC-A549细胞差异表达miRNA的筛选及对放射敏感性影响

目的 筛选17-AAG-M诱导的人非小细胞肺癌(NSCLC) A549细胞在X线下差异表达miRNA并研究其对放射敏感性的影响。方法 对17-AAG-M及4Gy处理的A549细胞完成芯片筛选,公共数据库观察兴趣miRNA在肿瘤中的表达,GO及KEGG分析目标miRNA并通过qPCR验证。MTT及克隆形成实验分别检测目标miRNA在X线作用下对A549细胞存活率及克隆增殖活力的影响,单击多靶模型拟合实验方程分析放射增敏性。结果 筛选出20个差异表达miRNA,其中下调的hsa-miR-30a-3p在数据库中表现出与肺癌的密切相关性,涉及含细胞增殖在内的50个生物学过程,影响MAPK信号通路、肿瘤相关路径及细胞周期等。与17-AAG-M组相比,hsa-miR-30a-3p在17-AAG-M和X线共同作用下,相对表达量由2.42降至0.16。而hsa-miR-30a-3p抑制A549细胞存活率,并在X线作用下由78.52%下降至69.00%。上调其表达能抑制肿瘤细胞增殖,提高放射敏感性,放射增敏比为1.18。在17-AAG-M作用下上述表现更加明显。结论 A549细胞中hsa-miR-30a-3p在17-AAG-M和X线的作用下差异表达,且上调其水平能抑制细胞生长及增殖,并提高放射敏感性,联合17-AAG-M后抑制效果更显著。     

甘露糖对6个人非小细胞肺癌细胞系放射敏感性影响

目的 探讨甘露糖对6个人非小细胞肺癌细胞系放射敏感性的影响及其可能机制。方法 采用Western blot检测磷酸甘露糖异构酶在6个肺癌细胞系中的表达。利用MTT法观察甘露糖对肺癌细胞系的增殖抑制作用;分别给予对照组、甘露糖组0、2、4、6、8、10Gy照射,采用平板克隆形成实验检测甘露糖对6个肺癌细胞放射敏感性的影响;流式细胞术检测对照组、甘露糖组、照射组及联合组细胞的凋亡情况。结果 6个肺癌细胞系中磷酸甘露糖异构酶表达量各不相同,其中A549细胞表达量最高,H460细胞表达量最低。11.1mmol/L甘露糖对A549、H460细胞系抑制作用相同,随着甘露糖浓度增加,对H460细胞系抑制作用更显著。采用11.1mmol/L的甘露糖可明显增加H460细胞系放射敏感性及细胞凋亡率,而对A549细胞系放射敏感性和凋亡率影响不大。结论 在磷酸甘露糖异构酶高表达的6个肺癌细胞系中,甘露糖可增强部分肿瘤细胞的放射敏感性。     

谷胱甘肽S-转移酶P1对小鼠肺癌细胞放射敏感性调控作用

目的 探讨谷胱甘肽S-转移酶P1(GSTP1)对小鼠路易斯肺癌细胞放射敏感性的调控作用。方法 使用shRNA干扰表达慢病毒和阴性对照病毒分别感染路易斯肺癌(LLC)细胞,并筛选出稳转株;应用RT-PCR和蛋白免疫印迹(WB)法检测LLC细胞GSTP1 mRNA和蛋白质表达水平,验证敲低效果;使用细胞增殖检测(CCK-8)法检测照射后细胞活力;使用克隆形成实验检测照射后细胞克隆形成能力;使用流式细胞术检测照射后细胞的凋亡水平。构建荷瘤小鼠并进行照射,检测照射后肿瘤体积变化;TUNEL染色检测照射后肿瘤细胞凋亡水平;免疫荧光检测照射后肿瘤内CD⁺₄CD⁺₈T细胞数量。结果 RT-PCR和WB结果显示shRNA慢病毒干扰后,GSTP1的mRNA和蛋白表达水平均明显下降。下调GSTP1能降低照射后细胞活力及克隆形成能力,并提高照射后细胞凋亡率。GSTP1敲低组荷瘤小鼠照射后肿瘤体积明显小于对照组,而肿瘤凋亡水平高于对照组,肿瘤内浸润CD⁺₄CD⁺₈T细胞数量亦高于对照组。结论 下调GSTP1能够显著增加LLC细胞的放射敏感性,并增加肿瘤组织中淋巴细胞的浸润。     

miR-21靶向抑制RECK对宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭和放射敏感性作用

目的:探究miR-21对宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡、侵袭以及放射敏感性的影响和潜在作用机制。方法:利用RT-qPCR方法检测宫颈癌组织和相邻非肿瘤组织、正常宫颈上皮细胞(H8)以及宫颈癌细胞系(HeLa、SiHa、ME180)中miR-21表达水平。通过CCK-8检测、Caspase3/7活细胞凋亡检测、伤口愈合试验...     

SOX4对非小细胞肺癌细胞A549的顺铂耐药作用的影响

背景与目的 肺癌是最严重的恶性肿瘤之一,其中非小细胞肺癌发病率在肺癌中居首位.部分患者对顺铂耐受是导致化疗失败的主要原因.SOX4是转录调节因子,在多种肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用,通过调控β-catenin的表达对Wnt信号通路进行调控.本研究旨在探讨SOX4对非小细胞肺癌细胞A549的顺铂耐药作用的影响.方法 体外诱导法建立顺铂耐药的肺癌细胞株A549/DDP,CCK8法检测A549及A549/DDP细胞对顺铂的耐药性.绘制A549与A549/DDP细胞生长曲线.Western blot检测耐药细胞株中SOX4的蛋白表达水平.CCK8法检测敲减SOX4后耐药细胞株A549/DDP对顺铂耐药性.实时定量PCR和免疫印迹法检测敲减SOX4后A549/DPP细胞中β-catenin和Survivin蛋白的表达.结果 成功构建非小细胞肺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP,其耐药性是亲本细胞的13.7倍,差异有统计学意义(P<0.001).生长曲线显示耐药细胞株与亲本细胞增殖速度没有统计学差异(P<0.05);与A549细胞相比,耐药细胞A549/DDP细胞中SOX4的表达显著增高(P<0.001).敲减SOX4后,A549/DDP细胞的耐药性显著降低;敲减SOX4后,A549/DDP细胞中β-catenin和Survivin的mRNA和蛋白表达水平显著降低.结论 SOX4的表达水平影响非小细胞肺癌细胞A549对顺铂的耐药性.     

CCR4对肝癌细胞索拉非尼放射敏感性及裸鼠成瘤的影响

目的 探讨CC趋化因子受体4(CCR4)对肝癌细胞索拉非尼放射敏感性及裸鼠成瘤的影响。方法 采用Western blot检测CCR4在肝癌细胞系中的表达。利用慢病毒感染构建过表达及敲减CCR4的PLC/PRF/5和SMMC-7721稳转株,并采用Western blot进行验证。采用平板克隆形成实验检测CCR4对肝癌细胞放射敏感性的影响。通过裸鼠成瘤实验检测CCR4对肝癌细胞体内成瘤的影响。结果 高转移肝癌细胞中CCR4呈高表达,低转移肝癌细胞中CCR4呈低表达。成功构建稳定过表达CCR4的PLC/PRF/5和敲减CCR4的SMMC-7721肝癌稳转株,过表达CCR4可逆转索拉非尼放疗对PLC/PEF/5的抑制作用,而敲减CCR4可增加SMMC-7721对索拉非尼放射敏感性。过表达CCR4可促进PLC/PEF/5裸鼠体内成瘤能力,而敲减CCR4可抑制SMMC-7721裸鼠体内成瘤能力。结论 CCR4高表达能显著增强肝癌PLC/PEF/5细胞对索拉非尼放射抵抗及裸鼠体内成瘤能力,而敲减CCR4则可显著增加肝癌SMMC-7721细胞对索拉非尼放射敏感性并抑制其裸鼠体内成瘤能力     

CTEN通过TGF-β1促进非小细胞肺癌细胞紫杉醇耐药的作用及机制研究

目的:探讨CTEN通过TGF-β1促进非小细胞肺癌（NSCLC）细胞紫杉醇耐药的作用和分子机制。方法:采用逐步增加剂量间歇作用的方法诱导非小细胞肺癌紫杉醇耐药细胞系并命名为A549/R,采用定量PCR和Western blotting检测耐药细胞和亲本细胞中CTEN和TGF-β1 mRNA及蛋白的表达,应用Lipofectamine 2000分别将CTEN高表达质粒pcmv-CTEN及其对照质粒pcmv转染至非小细胞肺癌A549细胞,分别为高表达组和对照组,分别用定量PCR和Western blotting检测CTEN和TGF-β1 mRNA及蛋白水平的变化;MTT法检测A549细胞对紫杉醇的敏感性及细胞增殖。应用Lipofectamine 2000分别将CTEN干扰质粒siCTEN及其对照siNC转染至紫杉醇耐药细胞系A549/R细胞,分别为干扰组和对照组,分别用定量PCR和Western blotting检测CTEN和TGF-β1 mRNA及蛋白水平的变化;MTT法检测A549/R细胞对紫杉醇的敏感性及细胞增殖。应用Lipofectamine 2000分别将TGF-β1干扰质粒siTGF-β1及其对照质粒siNC转染至非小细胞肺癌A549细胞,分别为干扰组和对照组,分别检测两组细胞中TGF-β1 mRNA及蛋白水平的表达情况,然后再分别用Lipofectamine 2000将CTEN高表达质粒pcmv-CTEN转染入两组细胞,MTT法检测A549细胞对紫杉醇的敏感性及细胞增殖。结果:成功构建在5 μg/mL紫杉醇中稳定生长的非小细胞肺癌耐药细胞系A549/R。定量PCR和Western blotting显示,CTEN和TGF-β1 mRNA及蛋白在紫杉醇耐药细胞系A549/R中的表达明显高于在其亲本细胞系A549中的表达;与对照组相比,高表达CTEN组的A549细胞中TGF-β1表达上升,细胞对紫杉醇的敏感性降低,细胞增殖增强;与对照组相比,低表达CTEN组的A549/R细胞中TGF-β1表达降低,细胞对紫杉醇的敏感性升高,细胞增殖减弱;在A549细胞中低表达TGF-β1后再过表达CTEN,其促进紫杉醇耐药及细胞增殖的作用也明显减弱。结论:CTEN具有促进非小细胞肺癌A549的紫杉醇耐药,促进细胞增殖的作用,其发生机制可能与上调TGF-β1的表达有关。     

BMAL1基因抑制耐放射鼻咽癌细胞株增殖、迁移和侵袭能力机制研究

目的探究BMAL1基因对耐放射鼻咽癌细胞株（5‐8FR）增殖、迁移和侵袭能力的影响及分子机制。方法 小剂量分次照射构建鼻咽癌耐放射细胞5‐8FR,运用克隆形成实验结果拟合多靶单击模型并计算放疗增敏比。通过蛋白质印迹实验检测5‐8FR和对照组5‐8F细胞株中PI3K/Akt/MMP‐2/9信号通路相关蛋白的表达。构建BMAL1基因的高表达及敲除载体,分别转染鼻咽癌细胞株5‐8F和耐放射细胞株5‐8FR,获得BMAL1基因过表达（pcDNA‐BMAL1）及其对照组（pcDNA）和干扰（BMAL1‐shRNA）及对照组（con‐shRNA）的稳转细胞株。蛋白质印迹法验证感染效率,检测两组细胞过表达或干扰BMAL1基因后PI3K/Akt/MMP‐2/9信号通路相关蛋白的改变情况。采用CCK‐8法、划痕实验、Transwell法检测过表达及干扰BMAL1基因后耐放疗细胞株5‐8FR增殖、迁移和侵袭能力的变化。结果 鼻咽癌耐放射细胞株中BMAL1基因表达下调,PI3K/Akt通路蛋白及下游相关分子MMP‐2、MMP‐9表达增加,TIMP‐2、TIMP‐1表达降低。过表达BMAL1基因可抑制PI3K/Akt通路蛋白及下游相关分子MMP‐2、MMP‐9表达,促进TIMP‐2、TIMP‐1表达,抑制耐放射鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,干扰BMAL1基因则结果相反。结论 BMAL1基因可以逆转耐放射鼻咽癌细胞株PI3K/Akt/MMP‐2/9信号通路相关蛋白的表达,并抑制耐放射鼻咽癌细胞株的增殖、迁移和侵袭能力。