几丁糖胶原复合膜及激活态雪旺细胞修复周围神经缺损的实验研究

目的研究几丁糖胶原复合膜、激活态雪旺细胞(activatedSchwanncell,ASC)促进周围神经再生的作用。方法将激活态雪旺细胞培养于几丁糖胶原复合膜后,将膜缝制成导管修复大鼠坐骨神经10mm的缺损(D组);并以自体神经移植(A组)、几丁糖胶原复合膜管(B组)及几丁糖胶原复合膜加脑源性神经营养因子[(brainderivedneurotrophicfactor,BDNF)C组]为对照。术后4、8、12周观察肢体运动,复合肌肉动作电位(CMAP)的波幅、潜伏期和运动神经传导速度(MNCV)。术后12周取材,样本染色观察神经轴突再生情况。结果几丁糖胶原复合膜加激活态雪旺细胞修复10mm神经缺损的效果优于几丁糖胶原复合膜加BDNF,与自体神经相似。结论几丁糖胶原复合膜加激活态雪旺细胞能有效地促进周围神经再生。     

人骨髓间充质干细胞与脐静脉内皮细胞体外共培养的研究

目的观察人骨髓间充质干细胞（Human bone marrow mesenchymal stromal cells,hBMSCs）与脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,hUVECs）体外共培养对hBMSCs成骨作用及hUVECs成血管功能的影响。方法分离鉴定hBMSCs和hUVECs,将hBMSCs及hUVECs按1∶1比例直接共培养,倒置相差显微镜观察细胞的生长特性和细胞相容性,Matrigel实验观察共培养对hUVECs体外血管形成能力的影响。将hBMSCs成骨诱导7 d后,茜素红染色观察共培养对其成骨分化能力的影响。结果 hBMSCs与hUVECs体外共培养细胞相容性良好,Matrigel实验显示共培养组形成的毛细血管状结构较单一细胞组多。成骨诱导的hBMSCs中,共培养组茜素红染色阳性,单一细胞组茜素红染色阴性。结论 hBMSCs与hUVECs具有良好的细胞相容性,在共培养体系中,未诱导的hBMSCs能促进形成毛细血管状结构,已成骨诱导的hBMSCs成骨矿化能力增强。     

导电材料神经导管桥接大鼠坐骨神经缺损观察

周围神经再生是世界难题。理想的组织工程神经支架材料需具备良好的降解性、组织相容性及一定的导电性能[1,2,3]。文献报道显示, 甲壳素、壳聚糖相对较为理想, 但两者皆不具备导电性。为赋予支架材料导电性, 规避甲壳素溶解性差等问题, 发挥低脱乙酰度壳聚糖降解性能好的特点[3], 本研究制备了纳米聚吡咯/不同乙酰度壳聚糖复合材料神经导管, 桥接大鼠坐骨神经缺损, 观察各导管修复神经缺损的效果。     

纳米PLLA膜复合内皮生长晕细胞的相容性研究

目的 通过观察内皮生长晕细胞(EOCs)与纳米聚-L-乳酸(PLLA)有序纤维膜体外复合培养的生物相容性及黏附、增殖情况,为构建组织修复材料提供理论依据.方法 通过静电纺丝技术制备的纳米PLLA纤维支架,行低温等离子体技术改性及 Ⅰ 型胶原表面涂覆,与EOCs复合培养,测定细胞黏附率及增殖率,观察细胞生长曲线,荧光显微镜及扫描电镜下观察支架材料与种子细胞EOCs形态特征和生物相容性.结果 制备的纳米PLLA膜孔径在300～400 nm之间,孔隙率>90%.各组(单纯细胞组、无序膜组、有序膜组及超级有序膜组)吸光度(A)值均随共培养时间的增加而逐步升高; 从第5天起,有序膜和超级有序膜组A值与无序膜和单纯细胞组比较,差异有统计学意义(P＜0.05); 单纯细胞组和无序膜组各检测时间点A值差异无统计学意义(P>0.05 ).复合培养12 h及24 h后有序膜组和超级有序膜组黏附率则明显高于无序膜组,差异有统计学意义(P＜0.01).复合培养1 d、3 d及7 d后,有序膜组和超级有序膜组的增殖率明显高于无序膜组(P＜0.05,P＜0.01).细胞在支架膜上生长良好,纳米无序膜的细胞生长较散在、杂乱; 有良好空间定向效果的有序膜及超级有序膜支架有利于细胞沿纤维定向附着、伸展、增殖,以超级有序膜更有利于保持其结构.结论 EOCs是理想的组织工程种子来源细胞; 纳米PLLA有序及超级有序膜支架能促进种子细胞在材料表面的黏附、增殖,并能较好地保持细胞的形态,是一种理想的组织修复材料.     

大鼠雪旺细胞对脊髓源性神经干细胞生长及分化的影响

目的 观察雪旺细胞(SCs)在体外对脊髓来源的神经干细胞(NSCs)生长及分化的影响.方法 分别从胎鼠脊髓和出生24 h内的SD大鼠坐骨神经分离培养NSCs及SCs并鉴定.实验分成对照组:NSCs单独培养组;A组:脑源性神经营养因子(黼)与NSCs共培养组;B组:SCs与NSCs共培养组;C组:BDNF+SCs与NSC共培养组.观察NSCs的形态学变化,计数并测量细胞团的数量及直径.利用免疫细胞化学方法检测神经元样细胞的表达并计算其百分率及阳性细胞突起的平均长度.结果 来源于新生大鼠脊髓组织的NSCs能够表达NSCs的标志物神经巢蛋白(Nestin),NSCs可分化为神经元及星形胶质细胞;72 h,A、B、C组细胞团的数量及细胞团的平均直径,均大于对照组(P＜0.05);传代培养3 d、7 d、14 d的NAP-2染色阳性神经元样细胞所占的百分率及阳性细胞突起平均长度均大于对照组(P＜0.05).结论 大鼠SCs在体外能够促进脊髓来源的NSCs生长并诱导其定向分化.     

壳聚糖-胶原生物膜介导雪旺细胞联合神经干细胞桥接周围神经缺损

目的 观察以壳聚糖一胶原偶联的生物膜为载体,联合移植雪旺细胞(SCs)与神经干细胞(NSCs)在坐骨神经损伤修复过程中所起的作用,评价该方法的疗效.方法 分离纯化SCs和NSCs,传代4代后共培养于壳聚糖一胶原生物膜上.32只Wistar成鼠(体重350～400 g)建立坐骨神经缺损动物模型,随机分为4组:空白组;SCs移植组;NSCs移植组;NSCs联合SCs移植组.14周后观察Cy3荧光素染色、MBP免疫酶染色及苏木素-伊红(HE)染色的结果.结果 BDA示踪显示术后联合移植组和SCs组有较多的神经纤维穿过缺损部位,大鼠右后肢感觉和运动功能恢复较其他组明显,修复神经段神经传导速度比值也大于其他组(P<0.05).SCs组和联合移植组间差异无统计学意义(P>0.05).结论 NSCs和SCs与壳聚糖一胶原生物膜相容性良好,壳聚糖一胶原生物膜介导的SCs联合NSCs桥接周围神经缺损可使部分神经再生.     

O,O-双十二酰基壳聚糖/聚乳酸复合膜的特性和生物相容性的研究

目的评价O,O-双十二酰基壳聚糖/聚乳酸复合膜的特性和生物相容性,从而寻找新型的组织工程支架材料。方法采用FTIR、WAXD及SEM研究复合膜的理化特性;采用小鼠胚胎成纤维细胞(3T3)作为实验细胞,通过细胞粘附实验、细胞活性MTT实验、小鼠全身过敏实验和皮下埋植急性毒性实验对复合膜的生物相容性进行评价。结果OCS与PLLA之间存在强烈的氢键作用,材料结构均一,无相分离;OCS/PLLA的粘附率较PLLA的高;复合膜的细胞毒性为零级;而且用复合膜100%浸提液注射小鼠,对小鼠生长无不良反应,在小鼠皮下埋植复合膜,该膜与皮下组织粘附良好,膜上粘附有肌肉,同时膜有部分降解。结论O,O-双十二酰基壳聚糖可提高聚乳酸的细胞亲和性,OCS/PLLA复合膜对组织的生物相容性好,该复合膜可能成为一种机械性能好、细胞亲和能力强的新型组织工程支架材料。     

壳聚糖／氧化钛复合膜的制备及其表征的实验研究

目的通过溶液浇注的方法制备壳聚糖／氧化钛（TiO2）复合膜，并对复合膜的力学性能和细胞相容性进行了研究，探讨此复合膜作为肝细胞载体的可行性。方法将不同质量的TiO2粉体加入壳聚糖溶液中，超声分散后浇注在培养皿上，自然干燥成膜。采用万能力学测试机测定了复合膜的拉伸强度和拉伸率，场发射扫描电镜（Field emission scanning electron microscope，FESEM）观察了膜的表面特征，并选择含10wt％TiO2的复合膜进行了肝细胞培养，观察了细胞在膜表面的生长状况。结果氧化钛在壳聚糖基体上分布较为均匀，但粉体颗粒有团聚。随着氧化钛加入量的增加，复合膜的拉伸强度增加，但超过20wt％，强度反而下降。与纯壳聚糖膜相比，复合膜的拉伸率持续下降。肝细胞在复合膜上生长良好，呈伸展的多边形态。结论初步研究显示，与纯壳聚糖相比，氧化钛的加入在一定范围内可以提高复合膜的强度。壳聚糖／氧化钛复合膜具有较好的肝细胞相容性，有可能作为肝细胞载体材料。     

壳聚糖支架负载SHH和CM-Dil标记的脂肪干细胞移植后存活分化研究

目的:观察壳聚糖支架负载音猬因子(Sonic hedgehog,SHH)和脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)移植后,ADSCs存活分化的效果。方法:将健康C57BL/6小鼠随机分为A组(PBS+ADSCs)、B组(SHH+ADSCs)、C组(壳聚糖+ADSCs)、D组(壳聚糖+SHH+ADSCs)。将各组混合物分别注射到小鼠背部皮下。术后1、2、4、8周处死小鼠,通过对移植组织一般观察、荧光显微镜观察、HE染色、免疫组化染色来评价移植细胞存活分化的情况。结果:术后8周,壳聚糖支架完全降解,大体观察、HE染色、免疫组化染色均说明壳聚糖支架同时搭载SHH和ADSCs脂肪干细胞存活率较高,新生血管增加,效果均优于A、B、C三组。结论:壳聚糖支架同时负载SHH和ADSCs可有效促进干细胞存活,显著增加血管组织数量。     

壳聚糖多孔支架复合BMSCs移植修复大鼠创伤性脑损伤的实验研究

目的探讨壳聚糖多孔支架复合BMSCs移植修复大鼠创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)的可行性。方法取成年SD大鼠胫骨及股骨骨髓,采用全骨髓贴壁培养法分离培养BMSCs,并传代。取第3代细胞行表面抗原CD29、CD45鉴定及BrdU标记。采用冷冻干燥法制备壳聚糖多孔支架,并与BrdU标记的第3代BMSCs进行体外共培养;扫描电镜观察细胞黏附情况,MTT法检测支架内细胞生长情况。取50只成年SD大鼠,随机分为A、B、C、D、E组(n=10)。A～D组大鼠采用Feeney自由落体打击致伤原理制备TBI模型,造模后72 h分别移植BMSCs-壳聚糖多孔支架复合体、BMSCs、壳聚糖多孔支架和完全培养基;E组为假手术组。于造模前及造模后1、7、14、35 d,各组大鼠行改良神经功能缺损评分(modified neurological severity scores,mNSS);造模后进行Morris水迷宫测验,包括定位航行测验(造模后31～35 d连续5 d检测潜伏期)及空间探索测验(造模后35 d检测穿越平台次数);造模后36 d取标本行HE染色、BrdU与高分子量神经丝蛋白免疫组织化学双重染色以及BrdU与神经胶质酸性蛋白免疫组织化学双重染色,观察大鼠脑损伤区BMSCs的迁移与分化情况。结果流式细胞仪检测示第3代BMSCs的CD29阳性率为98.49%,CD45阳性率仅为0.85%;扫描电镜示支架-细胞共培养48 h后,BMSCs呈梭形并分泌细胞外基质黏附于支架上;MTT法检测示壳聚糖多孔支架对BMSCs的增殖分化无不良影响。TBI造模后35 d,A组大鼠mNSS评分、定位航行测验的潜伏期显著低于B、C、D组,空间探索测验的穿越平台次数显著高于B、C、D组,差异均有统计学意义(P0.05);A、E组间上述指标比较差异均无统计学意义(P0.05)。HE染色示A组壳聚糖多孔支架已部分降解,其与脑组织融合良好,修复程度优于B、C、D组。免疫组织化学双重染色结果示,A组移植的BMSCs存活、分化为神经元和神经胶质细胞,并迁移至正常脑组织内,修复程度优于B、C、D组。结论壳聚糖多孔支架介导的BMSCs移植能够明显改善大鼠TBI后的神经功能,亦能抑制大鼠脑损伤区胶质瘢痕形成,并可使BMSCs在脑损伤区存活、增殖和分化为神经细胞。     

小鼠诱导多能干细胞与PHBHHx膜体外共培养的实验研究

目的探讨小鼠诱导多能干细胞(mi PSCs)与聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸共聚物(PHBHHx)膜材料的体外相容性。方法复苏mi PSCs,培养传代后,分为两组,一组与PHBHHx膜材料在体外共培养,通过DAPI染色方法观察mi PSCs在膜上的粘附情况,细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定mi PSCs在PHBHHx膜上的增殖,扫描电镜观察细胞与膜材料的复合情况;另一组用传统的培养皿培养mi PSCs,CCK-8测定细胞活力。结果小鼠诱导多能干细胞能够与PHBHHx膜材料良好的粘附和增殖,CCK-8实验测定细胞活力OD值结果显示PHBHHx膜显著大于传统的细胞培养皿培养(0.617±0.019 vs.0.312±0.004,P0.05)。结论 PHBHHx与mi PSCs体外共培养制成的细胞补片表面上有细胞粘附及增殖,与传统的细胞培养皿培养相比,PHBHHx膜培养在细胞的粘附和增殖中具有很大的优势,PHBHHx可作为干细胞治疗多种疾病的支架材料之一。     

包埋NGF的壳聚糖-PLGA双壁微球制备及其相关性能研究

目的评估壳聚糖-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物[poly(lactide-co-glycolide),PLGA]双壁微球在体外持续缓释具有生物活性的NGF的可行性。方法应用乳化-离子交联方法制备包埋NGF的、具有不同三聚磷酸钠(sodium tripolyphosphate,TPP)交联浓度[1%、3%、10%(W/V)]的壳聚糖-PLGA双壁微球,同时制备包埋NGF的PLGA微球。通过光镜、扫描电镜、激光共聚焦显微镜观察双壁微球的表面及内部形态,并行双壁微球的粒径分析和红外光谱分析。取包埋NGF的PLGA微球或1%、3%、10%TPP浓度交联的包埋NGF的壳聚糖-PLGA双壁微球(分别设为A、B、C、D组),于不同时间点行体外微球降解率测定、微球中NGF缓释率检测;以未包埋NGF的壳聚糖-PLGA双壁微球缓释液(设为A1组)作为对照,比较A1、B、C、D组体外微球缓释液中NGF的生物活性[以缓释液中具有阳性轴突延长反应的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞百分比表示]。结果包埋NGF的壳聚糖-PLGA双壁微球呈球形结构,具有相对粗糙的外表面;激光共聚焦显微镜观察示PLGA微球均匀分布于壳聚糖-PLGA双壁微球内;双壁微球的粒径范围为18.5~42.7μm;红外光谱分析结果说明双壁微球中壳聚糖的氨基与TPP中的磷酸基发生了静电反应。体外降解率测定显示,B、C、D组双壁微球降解速度明显快于A组,并随着TPP浓度的增加而逐渐减慢,培养各时间点各组间微球降解率比较差异均有统计学意义(P<0.05)。体外NGF缓释率测定显示,与A组PLGA微球相比,B、C、D组双壁微球以相对较慢的速度缓释NGF,且缓释速度随TPP浓度增加而减慢。除84 d外,各时间点B、C、D组间比较NGF总缓释率差异均有统计学意义(P<0.05)。体外NGF的生物活性评估显示,培养各时间点B、C、D组缓释液中具有阳性轴突延长反应的PC12细胞百分比均显著高于A1组(P<0.05)。培养7、28 d,B、C、D组间比较差异无统计学意义(P>0.05);56、84 d时,C、D组缓释液中具有阳性轴突延长反应的PC12细胞百分比显著高于B组(P<0.05),C、D组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论包埋NGF的壳聚糖-PLGA双壁微球在周围神经损伤后的再生方面具有临床应用潜力。     

同轴电纺聚左旋乳酸-己内酯共聚物/牛血清白蛋白纳米纤维的体内外生物相容性研究

目的 研究同轴电纺的聚左旋乳酸-己内酯共聚物/牛血清白蛋白[P(LLA-CL)/BSA]"壳-芯"结构纳米纤维在体内外的生物相容性.方法 应用同轴静电纺丝技术制备具有"壳-芯"结构的P(LLA-CL)/BSA纳米纤维膜.将在体外分离培养好的SD乳鼠雪旺细胞分别接种于该纳米纤维膜(材料组)及空白培养板(对照组)上进行复合培养.通过MTT法检测纳米纤维膜上雪旺细胞的活性,并与对照组比较;在扫描电镜下观察不同时间段雪旺细胞在纳米纤维膜上的黏附、生长与增殖情况.将该纳米纤维材料植入大鼠椎旁肌内,不同时间点取材,观察材料周围的炎症反应和纤维包囊形成情况. 结果 复合培养第3天后,材料组的雪旺细胞活性均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);第7天时,材料组和对照组的OD值平均分别为0.67±0.09、0.55±0.07.扫描电镜观察见纳米纤维膜表面雪旺细胞增殖黏附良好,胞体突起显著,呈端对端连接或成束排列.纳米纤维材料植入后第1周,可见大量淋巴细胞聚集在材料表面,呈现出急性炎症反应,无明显的纤维包囊形成.随着时间的推移,炎症反应逐渐消退,材料周围的纤维包囊也由厚变薄,植入后第12周,材料周围已无明显的纤维包囊,仅有少量的多核巨细胞出现. 结论 P(LLA-CL)/BSA纳米纤维材料在体外与雪旺细胞具有良好的相容性,能促进雪旺细胞的黏附与增殖分化;植入大鼠体内后,无急性毒性及免疫反应发生,与周围组织之间有着良好的相容性.     

3-D打印胶原蛋白-硫酸肝素仿生脊髓支架的研究

目的利用3-D生物打印机制备胶原蛋白-硫酸肝素仿生脊髓支架,为组织工程化治疗脊髓损伤提供细胞载体。方法制备硫酸肝素-胶原蛋白水凝胶,采用3-D打印仿生脊髓支架,扫描电镜观察其结构,排水法计算孔隙率,体外降解实验测量支架p H值和质量变化。取孕14 d SD大鼠的胎鼠脑皮质分离培养神经干细胞(neural stem cells,NSCs),实验分为2组,A组取仿生脊髓支架体外与NSCs共培养,B组直接将细胞悬液接种于预涂左旋多聚赖氨酸的24孔培养板上。采用光镜和扫描电镜观察细胞黏附与形态变化,MTT检测细胞活力,免疫荧光染色鉴定NSCs的分化情况。结果 3-D打印机成功制备出胶原蛋白-硫酸肝素仿生脊髓支架,扫描电镜显示内部具有纵行排列、平行的微孔结构,孔隙率为90.25%±2.15%;体外降解实验中,支架p H值未发生明显变化,8周左右支架降解完全,符合组织工程支架要求。MTT检测示两组培养1、3、7 d吸光度(A)值比较差异均无统计学意义(P0.05);光镜观察两组均可见大量神经球分化,神经纤维交织成网状;培养7 d A组扫描电镜观察示细胞黏附于支架上,大量细胞伸出轴突,并且有神经球形成;免疫荧光染色示,两组均可分化为神经元和胶质细胞,定量分析显示A、B组分化率分别为29.60%±2.68%和10.90%±2.13%,差异有统计学意义(t=17.30,P=0.01)。结论 3-D打印的胶原蛋白-硫酸肝素仿生脊髓支架具有良好的生物相容性,能促进NSCs增殖和分化,作为神经组织工程支架具有良好的研究和应用前景。     

VEGF/PELA/bFGF混合微囊促进大鼠BMSCs成血管分化研究

目的观察VEGF/聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物(polylactide-polyethyleneglycol-polylactic acid copolymer,PELA)/bFGF对SD大鼠BMSCs成血管分化作用。方法经全骨髓贴壁法分离培养BMSCs并传代。取第3代BMSCs行Wright-Giemsa染色及流式细胞术鉴定。利用复乳溶剂挥发法制备VEGF/PELA/bFGF(A组)、PELA/bFGF(B组)、VEGF/PELA(C组)及PELA(D组)微囊。对PELA微囊行降解性能及细胞毒性检测,VEGF/PELA/bFGF混合微囊行VEGF及bFGF体外释放检测。取4组微囊缓释上清液分别与第3代BMSCs培养。培养1、3、7、14、20 d于倒置显微镜下观察细胞形态变化;21 d时,行摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-labeled acetylated low density lipoprotein,Dil-ac-LDL)及FITC标记的荆豆凝集素(FITC-labeled ulex europaeus agglutinin I,FITC-UEA-I)实验,观察细胞摄取能力;同时行Matrigel基质胶小管形成实验,定量分析小管形成指标(节点数、交叉点数、主干数及主干长度)。结果经鉴定分离培养的细胞为BMSCs。PELA微囊在37℃恒温条件下降解时程超过20 d,且对BMSCs活力无明显影响。VEGF/PELA/bFGF混合微囊体外释放检测显示,至20 d时VEGF、bFGF累积释放量分别超过95%、80%。倒置显微镜下观察共培养期间A、B、C组BMSCs均出现形态学变化,其中A、B组20 d细胞呈典型内皮细胞"铺路石"样改变。荧光显微镜观察,A组双荧光标记细胞最多,B组次之,C组较少,D组几乎不具备内皮细胞特有的摄取功能。Matrigel基质胶小管形成实验示,A、B组诱导细胞在Matrigel基质胶上均形成网格状结构;定量分析显示A、B组节点数、交叉点数、主干数以及主干长度均多于C、D组(P0.05)。A组节点数以及主干长度多于B组(P0.05);两组交叉点数、主干数差异无统计学意义(P0.05)。结论 VEGF/PELA/bFGF混合微囊具有显著促进BMSCs成血管分化的能力。     

nHA-PLGA支架材料与兔软骨细胞体外培养的生物相容性研究

目的 研究新型多孔复合支架材料纳米羟基磷灰石(nHA)-聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)的生物相容性,探讨其作为骨组织工程支架的可行性.方法 将胎兔膝关节软骨细胞接种于制备的nHA-PLGA复合支架上,体外共同培养后采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测软骨细胞增殖活性,倒置荧光显微镜、扫描电镜观察支架材料表面和孔隙内软骨细胞黏附情况,流式细胞术检测软骨细胞周期情况.结果 实验组(A组)复合支架材料上细胞增殖活性与空白对照组(B组)相比,无统计学差异(P＞0.05);倒置荧光镜、扫描电镜观察显示A组细胞在复合支架材料表面和孔隙内大量黏附、生长,其数量随着共培养时间增加呈几何级增长;流式细胞仪检测显示A组与B组细胞周期差异无统计学意义(P＞0.05).结论 nHA-PLGA多孔复合支架生物相容性好,是一种性能良好的骨组织工程支架材料.     

不同数量BMSCs对大鼠背根神经节生长影响的实验研究

目的 BMSCs作为雪旺细胞的替代细胞可提高周围神经损伤修复效果,但目前对于神经支架内添加适宜的种子细胞数量未达成共识。研究不同数量BMSCs对大鼠背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)生长的影响。方法取4周龄雄性SD大鼠3只,体重80～100 g,体外培养扩增BMSCs。取新生1～2日龄SD大鼠3只,雌雄不限,体重4～6 g,制备DRG。取第3代BMSCs制备BMSCs-生物蛋白胶复合物,按照加入细胞数量的不同,将实验分为A组(1×103个)、B组(1×104个)、C组(1×105个)和D组(0个),并与SD大鼠DRG共培养。48 h后通过形态学观察,神经丝蛋白200和雪旺细胞S-100免疫荧光染色,对SD大鼠DRG轴突生长长度、雪旺细胞迁移距离和轴突面积指数进行定量评价。结果 48 h后可见各组BMSCs生长出多个长突起;雪旺细胞移行和轴突从DRG长出,呈多方向性生长;BMSCs生物蛋白胶具有生物活性且影响DRG生长。A、B、C组DRG轴突生长长度及雪旺细胞迁移距离均明显大于D组(P<0.05),C组小于B组(P<0.05),A、C组间及A、B组间差异无统计学意义(P>0.05)。A、B组轴突面积指数明显大于D组(P<0.05),C组大于D组但差异无统计学意义(P>0.05),A、B、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论乳鼠DRG体外培养实验,可作为研究周围神经损伤修复的体外模型。不同数量BMSCs生物蛋白胶复合物对DRG生长的影响具有量效关系,为组织工程神经选用合适数量BMSCs提供了理论依据。     

羧甲基壳聚糖通过抑制线粒体途径保护氧化损伤诱导雪旺细胞凋亡

[目的]探讨线粒体途径在羧甲基壳聚糖(carboxymethylated chitosan,CMCS)保护过氧化氢(H_2O_2)诱导雪旺细胞(Schwann cells,SCs)凋亡中的作用及机制。[方法]体外培养SCs,S-100免疫荧光染色鉴定。将SCs分为空白对照组、H_2O_2诱导组、H_2O_2加CMCS处理组。流式细胞仪检测细胞凋亡比率,罗丹明(Rhodamine123)荧光染色检测细胞线粒体膜电位水平,Western blot检测SCs内细胞色素C(Cytochrome C)表达水平。[结果]本实验培养细胞经S-100荧光染色鉴定阳性率达95%以上,H_2O_2诱导SCs凋亡,降低线粒体膜电位,增加细胞色素C释放;而在加入CMCS后SCs凋亡比例降低,线粒体膜电位增加,细胞色素C释放减少。[结论]CMCS通过抑制线粒体细胞凋亡途径保护H_2O_2诱导SCs凋亡。     

成骨细胞与血管内皮细胞联合培养的生物学特性

目的探讨成骨细胞与血管内皮细胞联合培养的生物学特性. 方法取2周龄乳兔颅盖骨及肾脏皮质传代培养制备成骨细胞(A组)、血管内皮细胞(B组)及成骨细胞与血管内皮细胞联合培养(C组),用Ⅰ型胶原和血管Ⅷ因子免疫细胞化学染色鉴定成骨细胞和血管内皮细胞,倒置相差显微镜和组织学染色观察细胞的生长特性和细胞相容性,检测碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase,ALP)活性,观察血管内皮细胞对成骨细胞产生的ALP活性有无影响,MTT法检测细胞活力,分析细胞生长和增殖情况. 结果免疫细胞化学染色证实,培养的细胞为成骨细胞和血管内皮细胞.倒置相差显微镜、HE和Masson染色均显示两种细胞混合生长良好.ALP检测结果:C组ALP活性明显高于A组和B组(P＜0.01),A组高于B组(P＜0.05).MTT检测结果表明:C组细胞早期增殖较慢,而后期增殖较快. 结论成骨细胞与血管内皮细胞具有良好的相容性,血管内皮细胞能够增强成骨细胞的ALP活性,提高成骨细胞的增殖能力.联合培养细胞具有很强的增殖潜能.     

人牙骨移植材料对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7增殖分化的影响北大核心CSCD

目的探讨人牙骨移植材料对巨噬细胞增殖分化以及形态的影响,了解人牙骨移植材料的生物相容性和细胞毒性。方法收集新鲜人离体牙,制备人牙骨移植材料,共聚焦显微镜下观察小鼠单核巨噬细胞RAW264.7与人牙骨移植材料共培养后对材料黏附情况。扫描电镜观察人牙骨移植材料、OSTEONⅡ人工骨植入物及未处理牙粉的形貌。配制不同成分浸提液,分4组:A组(含10%FBS的DMEM培养液)、B组(人牙骨移植材料)、C组(OSTEONⅡ人工骨植入物)、D组(未处理牙粉)。分别将4组浸提液与细胞共培养,倒置显微镜观察细胞形态变化定性判定细胞毒性,结合MTT法检测细胞增殖分化结果及细胞相对增殖率定量判定细胞毒性;通过锥虫蓝染色检测各组细胞活力;ELISA法检测炎性因子TNF-α和IL-6表达。结果扫描电镜观察示,人牙骨移植材料和OSTEONⅡ人工骨植入物的表面都具有均匀的孔状结构,而未经处理牙粉胶原纤维结构及脱矿牙本质层全层塌陷,无特定结构。共聚焦显微镜观察示,细胞在人牙骨移植材料上生长良好。细胞与浸提液共培养后,观察示A、B、C组细胞形态和数量正常,毒性反应分级均为0级,而D组均为3级。MTT检测示,B、C组各时间点细胞毒性均为0级或1级,提示材料合格;D组培养1 d时细胞毒性为2级,3、5、7 d均为4级,结合细胞形态分析,提示材料不合格。锥虫蓝染色示,各时间点A、B、C组细胞数量均显著高于D组,差异有统计学意义(P<0.05),A、B、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。ELISA检测示,各时间点A、B、C组TNF-α和IL-6含量均显著低于D组,差异有统计学意义(P<0.05);A、B、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论人牙骨移植材料与小鼠单核巨噬细胞共培养无细胞毒性,其浸提液对细胞增殖分化无明显影响,并不增加炎性因子表达,具有良好的生物相容性,有望用于临床骨缺损修复。