microRNA-34a增加奥沙利铂对结肠癌细胞敏感性的实验研究

目的:构建奥沙利铂耐药结肠癌细胞株(SW480/ADR),观察miRNA-34a对SW480/ADR细胞奥沙利铂敏感性的影响。方法:使用浓度梯度法构建奥沙利铂耐药细胞株(SW480/ADR)。miR-34a慢病毒转染SW480/ADR细胞,MTT法检测细胞增殖,Real-time PCR定量检测miR-34a表达,Western blot检测蛋白表达。结果:SW480、SW480/ADR和过表达miR-34a-SW480/ADR细胞miR-34a的2-△△Ct值为0.15±0.03、0.12±0.02和0.74±0.13,各组间差异有统计学意义(P<0.01)。奥沙利铂对SW480、SW480/ADR和过表达miR-34a-SW480/ADR细胞的IC50值分别为8.64±1.54、24.16±3.72和11.52±1.22μmol/L,各组间差异有统计学意义(P<0.01)。SW480、SW480/ADR和过表达miR-34a-SW480/ADR细胞OCT-4蛋白的相对灰度值为0.096±0.014、0.352±0.053和0.136±0.017,各组间差异有统计学意义(P<0.01)。结论:miR-34a可以显著降低结肠癌奥沙利铂耐药细胞OCT-4蛋白表达,逆转结肠癌细胞对奥沙利铂的耐药。     

结肠癌SW480细胞FAP-1表达与奥沙利铂化疗耐药关系的研究

目的探讨结肠癌FAP-1表达与其对奥沙利铂化疗耐药间的关系。方法用奥沙利铂处理结肠癌SW480细胞,用MTT法评价其细胞增殖能力,以RT-PCR法评价FAP-1 mRNA表达水平。结果奥沙利铂化疗仅能一定程度上抑制结肠癌SW480的增殖,但随作用时间的延长,SW480细胞仍能继续增殖。经过奥沙利铂化疗FAP-1的表达上调。结论奥沙利铂化疗可引起FAP-1表达的上调,增强肿瘤细胞对抗Fas诱导的细胞凋亡。这可能与结肠癌对奥沙利铂化疗的耐药相关。     

脆性组氨酸三联体基因转染对人结肠癌细胞株SW480奥沙利铂敏感性的影响

目的 观察脆性组氨酸三联体基因(FHIT)转染对人结肠癌细胞株SW480奥沙利铂敏感性的影响.方法 将重组真核表达质粒pRc/CMV2-FHIT通过脂质体转染技术导入人结肠癌细胞株SW480,筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染了空质粒pRc/CMV2的SW480细胞(SW480-pRc/CMV2)和正常SW480细胞为对照.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测FHIT基因的mRNA转录水平.以奥沙利铂作用于3组细胞,用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞的生长抑制率,用流式细胞仪检测奥沙利铂处理前后各组结肠癌细胞的凋亡率及细胞周期的变化.结果 SW480-FHIT细胞的RT-PCR产物经凝胶电泳有明显的阳性条带,而对照组则无;经奥沙利铂处理后,转染FHIT基因的SW480细胞的凋亡水平与空质粒转染组及结肠癌细胞株组比较明显增高(第2、3、4天A值比较P<0.05),并且FHIT基因与奥沙利铂有轻度的协同促进凋亡作用;同时奥沙利铂处理前后实验组结肠癌细胞的生长周期较对照组均出现了明显的G_0/G_1期阻滞,且细胞的生长抑制率存在浓度和时间依赖性.结论 外源性FHIT基因表达与奥沙利铂协同促进SW480细胞凋亡及细胞周期阻滞,FHIT基因可增加结肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性.     

结肠癌多药耐药性相关基因筛选与鉴定

目的筛选结肠癌多药耐药相关基因,探讨结肠癌多药耐药的机制。方法通过逐步递增氟尿嘧啶（5-FU）浓度孵育结肠癌Lovo细胞,建立耐药细胞株Lovo／5-FU。M1Tr法检测Lovo／5-FU细胞对5-FU和顺铂（CDDP）的敏感性。采用二维电泳-质谱联用技（2DE—MS）术比较Lovo和Lovo／5-FU两株细胞间差异表达蛋白,并采用Western blot法鉴定筛选蛋白。结果与Lovo相比,Lovo／5-FU细胞对5-Fu和CDDP的IC。值分别升高31倍和3倍（均P〈0.01）。通过2DE—MS筛选得到。在耐药株中CAP—G和RhoGD12表达上调,6-PGL、DCI、Prdx-6和Maspin表达下调。Western blot检测显示．Lovo／5-FU细胞中RhoGD12和CAP-G较Lovo增高6．14倍和2．98倍（均P〈0．01）．而Maspin则明显下降至Lovo中的5．2％（P〈0．01）。结论结肠癌耐药性的产生是多基因、多通路改变的结果。CAP—G、RhoGD12、Masoin是潜在的结肠癌多药耐药相关基因。     

miR-26b对肝癌HepG2奥沙利铂耐药细胞的增敏作用研究

目的:构建肝癌HepG2奥沙利铂耐药细胞,观察miR-26b在其耐药机制中的作用。方法:使用浓度梯度法构建肝癌奥沙利铂耐药细胞株(HepG2/L-OHP)。miR-26b mimic转染HepG2/L-OHP细胞,CCK-8法检测细胞增殖,Real-time PCR定量检测miR-26b表达,Western blot检测蛋白表达。结果:HepG2细胞miR-26b的2-△△Ct值为0.206±0.024,显著高于HepG2/L-OHP细胞的0.152±0.017(P0.01)。奥沙利铂对HepG2、HepG2/L-OHP和转染miR-26b mimic的HepG2/L-OHP细胞的IC_(50)值分别为22.15±3.26、48.56±6.47和36.73±5.18μmol/L,各组间差异有统计学意义(P0.01)。HepG2、HepG2/L-OHP和转染miR-26b mimic的HepG2/L-OHP细胞的LC3-Ⅱ/Ⅰ比值为2.27±0.24、9.45±1.54和6.32±1.13,各组间差异有统计学意义(P0.01)。结论:miR-26b可以抑制肝癌奥沙利铂耐药细胞自噬激活,逆转肝癌细胞对奥沙利铂耐药。     

BH3-only在奥沙利铂诱导结肠癌细胞凋亡中的作用

目的研究BH3-only基因表达在奥沙利铂诱导人结肠癌细胞株凋亡中的作用及其机制。方法采用不同浓度（0．3、0．6、1．25、2,5、5、10和20mg／L）奥沙利铂处理人结肠癌细胞株SW480及HT29,应用MTT检测细胞生长抑制情况;流式细胞仪检测凋亡情况;荧光定量PCR检测BH3-only基Bim和PUMA表达。结果不同浓度奥沙利铂分别作用于结肠癌细胞SW480后,出现不同程度的细胞生长抑制作用,呈剂量依赖性。5mg／L和10mg／L浓度的奥沙利铂作用于SW480细胞24h后,细胞凋亡率分别为（4．87±0．55）％和（12．10±1．04）％,作用48h后分别为（11．47±0．85）％和（30．07±2．01）％,作用72h后分别为（28．99±2．12）％和（38．32±3．15）％,均显著高于相应时间点对照组细胞的凋亡率[（0．30±0．10）％、（0．40±0．10）％和（0．50±0．20）％,均P〈0．01]。同时Bim和PUMAmRNA表达水平也显著高于对照组（P〈0．05）。而同样处理的HT29细胞其生长抑制率、细胞凋亡率及Bim和PUMAmRNA表达水平与对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论奥沙利铂具有抑制结肠癌细胞株SW480生长并诱导其凋亡的作用,其机制可能与促凋亡相关基因BH3-only（Bim和PUMA）表达增强有关。     

脑胶质瘤中P-gP、GST-π、Topo Ⅱ表达的相互作用及其临床意义

目的 探讨P—gP、GST-π、TopoⅡ在脑胶质瘤中表达的相互关系以及其临床意义。方法 采用免疫组织化学技术链霉卵白素-过氧化物酶连结法（SP法）检测101例原发性脑胶质瘤组织中P-gP、GST-π和TopoⅡ在不同病理分级间（WHOⅠ级24例；Ⅱ级34例；Ⅲ级28例；Ⅳ级15例）的表达水平，评估三者间关系和临床意义。结果 P—gP、GST-πT和TopoⅡ阳性表达率分别为62．4％、64．3％、59．4％。P—gP及GST-πT表达水平在高级别（Ⅲ-Ⅳ级）胶质瘤显著高于低级别（Ⅰ～Ⅱ级）（P〈0．05）；TopoⅡ表达水平在高级别胶质瘤则显著低于低级别（P〈0．05）。各多药耐药因子共表达的比率分别为：P—gP＋GST-πT：44．6％，P—gP＋TopoⅡ：19．8％，GST-π＋TopoⅡ：17．8％：P-gp＋TopoⅡ＋GST-πT：4．95％，两个或以上MDR基因产物共表达率为87．2％，显著高于单一基因产物表达率：P—gP（5．9％），GST-πT（0．9％）及TopoⅡ（1．9％）（P〈0．05）。TopoⅡ阳性表达与P-gP、GST-πT阳性表达呈显著负相关（P〈0．01）。P—gP阳性表达与GST-πT阳性表达呈显著正相关（P〈0．01）。结论 原发性脑胶质瘤的多药耐药现象是由多个耐药因子共同参与作用的结果，多药耐药的发生在肿瘤细胞的病理分级间差异有统计学意义；同时检测三种耐药因子有助于优化临床化疗方案，提高化疗效果。     

人结肠癌耐药细胞系SW480/ADM的建立及其生物学特性

目的　建立人结肠癌SW4 8 0耐阿霉素细胞系 (SW4 8 0 /ADM) ,研究其耐药机制及逆转。方法　应用人结肠癌细胞系SW4 8 0,以递增阿霉素 (ADM)浓度的方法,体外连续培养建成一株SW4 8 0 /ADM。观察该细胞生长规律。用MTT比色法检测该耐药细胞系的多药耐药性;以流式细胞术检测该耐药细胞的细胞周期分布、细胞表面多药耐药基因 (MDR)的表达产物P-糖蛋白 (P gp) 、多药耐药相关蛋白 (MRP)及谷胱甘肽硫转移系统 (GSH/GST)的表达;用高效液相色谱仪检测耐药细胞内阿霉素含量。结果　SW4 8 0 /ADM细胞与SW4 8 0细胞相比,生长缓慢,倍增时间延长,细胞周期分布发生改变;SW4 8 0 /ADM细胞较SW4 8 0的阿霉素半数抑制浓度 (IC50 )增大 1 3. 2 2倍,并对多种抗癌药物产生耐药性。SW4 8 0 /ADM细胞表面MDR的表达产物P gp,MRP和GSH/GST的表达均较SW4 8 0细胞显著升高 (P< 0. 0 1 )。SW4 8 0 /ADM细胞内阿霉素含量明显低于SW4 8 0细胞。结论　SW4 8 0 /ADM细胞对阿霉素的耐药是获得性的,并呈多药耐药性特征,可用于对人结肠癌耐药、逆转和MDR机制等方面的研究。     

PAC-1|L-OHP单用及联合用药对人结肠癌细胞的抑制作用

目的观察体外单用及两者联合应用半胱天冬酶原活化复合物-1(PAC-1)和奥沙利铂(L-OHP)对人结肠腺癌细胞株HCT116、SW480、HT-29,SW116和SW620的生长抑制作用。方法 MTT法检测两药单用和合用前后对细胞增殖活性的影响。结果 PAC-1和L-OHP单用对5种人结肠癌细胞均有明显的诱导凋亡和增殖抑制作用,并呈时间和浓度依赖性;PAC-1对上述细胞的半数抑制浓度(IC50)之间无统计学差异(P0.05),L-OHP对上述细胞的的IC50值有统计学意义(P0.05)。PAC-1与L-OHP联用(同时给药)产生拮抗作用(CI(1)。结论 PAC-1与L-OHP单用均对人结肠腺癌细胞有抑制作用,但各细胞株对两药的敏感性不同,两者联合应用(同时给药)起拮抗作用。     

Ad-p53对乳腺癌阿霉素耐药细胞株多药耐药基因1/P-gp表达的影响

目的 观察腺病毒介导的p53基因(Ad-p53)逆转乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/Adr多药耐药作用及其对MDR1 mRNA/P-gP表达的影响.方法 以人乳腺癌MCF-7细胞及其阿霉素耐药株MCF-7/Adr为实验对象,以50 MOI Ad-p53感染MCF-7/Adr细胞,CCK-8法观察Ad-p53对多药耐药的逆转作用,实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测MDR1 mRNA变化,免疫荧光组织化学及Western blot检测P-gP蛋白表达的变化.结果 50 MOI Ad-p53能使MCF-7/Adr细胞阿霉素IC50由(4.54±0.91)mg/L降到(0.26±0.11)mg/L,逆转耐药倍数为18.1倍(P《0.01);MDR1 mRNA相对表达量由1.32下降至0.85(P《0.01),P-gP蛋白表达量亦下降.结论 Ad-p53具有对人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/Adr多药耐药的逆转作用,其可下调MDR1 mR-NA/P-gP表达.     

短发夹RNA干扰表达质粒逆转人大肠癌细胞LOVO／5-Fu多药耐药的研究

目的：探讨短发夹RNA（shRNA）沉默多药耐药MDR）基因对大肠癌多药耐药细胞株LO-VO/5-Fu生长的影响。方法：构建靶向MDR1的shRNA干扰质粒转染人大肠癌多药耐药细胞株LO-VO/5-Fu,MTT法检测各组细胞对5-Fu的敏感性,流式细胞术检测细胞周期变化、凋亡情况及P-糖蛋白（P-gp）的表达,Realtime-PCR检测各组细胞MDR1 mRNA表达的变化,Western blot检测各组细胞P-gp表达的变化。结果：与对照组质粒组和未转染组相比,转染含shRNA干扰质粒细胞的实验组IC50明显降低,为（2.304±0.232）μmol/L,且差异有统计学意义（P〈0.05）,敏感性的相对逆转率为73.8%;凋亡率明显升高为（5.767±0.694）%（P〈0.05）;MDR1 mRNA表达明显下调（P〈0.05）;P-gp的表达水平降低（P〈0.05）。结论：靶向MDR1的shRNA干扰质粒有效抑制了MDR1的表达,使P-gp的表达降低,从而增强了LOVO/5-Fu细胞对5-Fu的敏感性,有可能为临床上克服大肠癌化疗过程中出现的耐药提供新的作用靶点和治疗途径。     

利用新型载体运转MDR1 siRNA以逆转胰腺癌化疗耐药性的研究

目的:以新型载体运转MDR1 siRNA导入胰腺癌细胞株后,观察其多药物耐药基因(MDR1)的表达及其对胰腺癌化疗耐药性的影响。方法:采用RNA干扰技术,构建可用于包装成自我复制rAAV病毒载体的质粒,以运转不同长度的MDR1 siRNA。采用实时PCR检测MDR1 mRNA的表达,Western印迹法检测总P-糖基化蛋白(P-gp)的表达水平,用流式细胞仪检测细胞表面的P-gp表达,并从不同层面检测胰腺癌细胞株P-gp表达的抑制率,从而筛选出最佳的质粒载体。采用MTT检测IC50值,进行各载体逆转胰腺癌细胞株化疗耐药性的研究。结果:拟用于构建自我复制rAAV病毒载体的25-mer MDR1 siRNA质粒能有效地将目的基因MDR1 siRNA导入胰腺癌细胞株,并予稳定的表达,发挥作用。导入胰腺癌细胞株的MDR1 siRNA能有效地在mRNA水平上沉默MDR1基因,显著抑制其表达,使其蛋白产物P-gp的表达明显减少,及其在细胞膜上的数量显著降低。结果能有效、显著地逆转胰腺癌细胞株的化疗耐药性,转染前SW1990/ADM细胞对ADM的IC50值约是转染后的50倍。结论:采用可用于构建新型sc-rAAV载体的质粒作为投递siRNA的工具,并选择MDR1为研究靶点,通过实验证实该策略在逆转胰腺癌化疗耐药性中的有效性。     

氟尿嘧啶对人结肠癌SW480细胞ABCG2表达的影响

目的观察氟尿嘧啶（5-FU）对人结肠癌SW480细胞ABCG2表达的影响。方法用不同药物浓度的5-FU处理SW480细胞,用CCK8法检测5-FU在SW480中的IC50,流式细胞仪检测SW480细胞ABCG2的阳性表达率．RT—PCR检测ABCG2的mRNA在SW480细胞中的表达差异。结果5-FU对SW480细胞的IC50随着药物浓度的增加而升高（P〈0．05）。流式细胞仪检测发现,正常SW480细胞（A组）中ABCG2阳性表达率为（6．26±0．86）％;在药物处理48h后即刻检测时（B组）的阳性表达率下降至（3．43±1．18）％（P〈0．05）;在药物处理48h后的第2代细胞检测时（c组）则升高至（12．91±3．42）％（P〈0.05）。3组ABCG2mRNA表达趋势与流式细胞仪检测结果的趋势一致。结论不同浓度的5-FU可以影响人结肠癌SW480细胞ABCG2的表达。     

干扰素α2a对人结肠癌细胞胸苷磷酸化酶表达和5＇脱氧氟尿苷抗癌活性的影响

目的探讨干扰素-α2a（IFN-αt2a）对人结肠癌细胞胸苷磷酸化酶（TP）mRNA表达水平以及5＇-脱氧氟尿苷（5’-DFUR）和氟尿嘧啶（5-FU）抗癌效应的影响。方法不同剂量IFN-α2a分别处理人结肠癌细胞LOVO和SW480．荧光定量PCR检测TPmRNA表达水平：MTT法检测联合应用IFN-α2a前后5．FU和5＇-DFUR对LOVO和SW480抑制作用的半数有效浓度（IC50）变化情况。结果与0U／mlIFN-α2a浓度组相比．500U／ml及5000U／ml组可明显上调LOVO和SW480细胞TPmRNA表达（P〈0．01）,而50U／ml则对上述两种细胞TPmRNA表达水平无明显影响（P〉0．05）。联合应用浓度为20U／ml的IFN-α2a后．5．FU对LOVO和SW480细胞的IC50无明显改变（P〉0．05）．但5’-DFUR的IC50则明显降低（P〈0．05）。结论IFN-α2a能上调结肠癌细胞TPmRNA的表汰水平并可使5＇-DFIIR对结肠痛细胞的1C50明显下降而对5-FI7则无明显影响。     

粉防己碱逆转大肠癌耐药细胞株LOVO/5-Fu多药耐药性的实验研究

目的 探讨粉防己碱(tetrandrine,Tet)逆转人大肠癌多药耐药细胞LOVO/5-Fu的多药耐药性(multidrug resistance,MDR)及其机制.方法 Tet作用于LOVO/5-Fu细胞48 h后,用噻唑蓝法检测LOVO/5-Fu细胞耐药性,流式细胞术检测细胞凋亡、周期变化及其p-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达水平,实时荧光定量PCR检测各组细胞MDR1 mRNA表达水平,Western blot检测各组细胞P-gp蛋白的表达水平.结果 经过Tet作用48 h后,大肠癌LOVO/5-Fu细胞株的IC50降低为(4.15±0.31)μg/ml(P＜0.05),细胞凋亡率增加为(3.44%±0.28%)(P＜0.05),MDR1 mRNA转录水平降低为(570 ±85)(P＜0.05),P-gp的表达水平下降.结论 Tet能逆转大肠癌多药耐药细胞LOVO/5-Fu的MDR,其机制可能是抑制MDR1基因的表达,使P-gp的表达降低,从而增强了LOVO/5-Fu细胞对5-Fu的敏感性.

Abstract：

Objective To explore the reversal effect on MDR1 gene-mediated multidrug resistance in human colon carcinoma LOVO/5-Fu cells by tetrandrine ( Tet) and to clarify its molecular mechanism.Methods LOVO/5-Fu cells were treated for 48 h with Tet.Drug sensitivity was measured by MTT.The cell cycle, apoptosis of cells and expression of P-glycoprotein (P-gp) were determined by flow cytometry assay.Expression of MDR1 mRNA was detected by real-time quantitative PCR (real-time PCR).P-gp expression was detected by Western blot.Results After LOVO/5-Fu cells were treated for 48 h with Tet, the IC50 of 5-Fu decreased to ( 4.15 ± 0.31 ) μg/ml ( P ＜ 0.05 ) ; and the apoptotic rate increased to (3.44% ± 0.28% ) ( P ＜ 0.05) ; the expression of MDR1 mRNA reduced to (570 ± 85) (P ＜ 0.05 ).Conclusions Tetrandrine reverses MDR1 gene-mediated multidrug resistance in human colon carcinoma LOVO/5-Fu cells possibly by inhibiting the expression of MDR1, decreasing the expression of P-gp, thus enhancing the sensitivity of LOVO/5-Fu cells to 5-fluorouracil.     

膀胱癌多药耐药性的检测及其意义

目的探讨膀胱癌的多药耐药性(MDR)以指导灌注化疗用药。方法采用免疫组化法检测44例膀胱癌病理标本,分析P-糖蛋白(P-gp)、谷胱甘肽S转移酶(GST-π)和拓扑异构酶(TOPO-Ⅱ)的表达情况。结果54．5％的病例P-gP高表达;65．9％的病例GST-π无表达和低表达;TOPO-Ⅱ,高表达29．5％,而低表达65．9％。结论检测膀胱癌MDR可指导灌注化疗用药。     

体外转染KISS-1基因对SW480细胞系侵袭和迁移力的影响

目的 探讨人肿瘤转移抑制基因KiSS-1对人结肠癌SW480细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响.方法 将携有KISS-1基因的重组真核表达质粒pRc/CMV2-KISS-1转化大肠杆菌DH5et并扩增,抽提纯化质粒并进行酶切鉴定,pRc/CMV2-KISS-1体外转染SW480细胞(SW480-FH1T),筛选稳定转染的细...