联合转染人VEGF165和ANG-1双基因对大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

[目的]研究联合转染入血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管紧张素-1(ANG-1)双基因对大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化潜能的影响.[方法]将本室构建的编码人VEGF165和ANG-1双基因腺病毒质粒pAd-VIA在QBI-293A细胞内进行包装和扩增,获得腺病毒载体pAd-VIA,将其体外转染大鼠BMSCs,应用诱导培养液定向诱导向成骨细胞分化.实验分为4组:A.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs并诱导组;B.BMSCs诱导组;C.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs组;D.单纯BMSCs组.通过碱性磷酸酶(ALP)染色和活性的测定、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色来评价联合转染双基因对BMSCs成骨分化潜能的影响.[结果]重组腺病毒质粒pAdVIA在QBI-293A细胞内成功包装和扩增,有大量的绿色荧光蛋白表达,体外转染大鼠BMSCs后,A、B组的ALP染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色为阳性,而C组和D组为阴性.ALP活性表达具有时间相关性,3 d开始表达,7 d到达高峰,在7、14 d,A、B组与C、D组之间ALP表达均具有统计学差异(P＜0.01),A组和B组之间,在各个时间点均无统计学差异(P＞0.05).[结论]腺病毒载体pAd-VIA转染大鼠BMSCs后,未明显影响其体外成骨分化潜能.     

5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记示踪脂肪成体干细胞体内成骨分化的研究

目的 观察经成骨诱导后的脂肪成体干细胞(ADASCs)在体内的成骨分化行为.方法 分离培养兔ADASCs,用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记,并通过免疫组织化学方法检查标记结果.将标记的ADASCs体外成骨诱导培养2周后与脱钙骨基质(DBM)复合,共培养7d后植入自体肌袋内.术后8周取材,固定、脱钙、包埋后切片染色,镜下观察.结果 大量ADASCs被标记,标记率达(82.3±8.6)%;体外标记后的ADASCs可以向成骨方向分化;切片苏木素-伊红(HE)染色示体内有新生骨形成,切片BrdU免疫组织化学染色示新生骨处有阳性细胞.结论 ADASCs经体外成骨诱导后植入体内能够继续维持成骨分化,并进一步形成新生骨.     

双向诱导的骨髓基质干细胞体外成骨与成血管的实验研究

目的 探讨双向诱导的骨髓基质干细胞(BMSCs)形成内皮细胞、成骨细胞与BMSCs共存体系的体外成骨与成血管的能力.方法 采用密度梯度离心法分离培养兔BMSCs.贴壁细胞分为四组:A组(单纯的BMSCs组)、B组(成骨诱导的BMSCs组)、C绀(内皮诱导的BMSCs组)和D组(双向诱导的BMSCs组).通过倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,并采用流式细胞仪检测诱导前后的细胞表面抗原,采用茜素红染色观察钙结节,基质胶成血管法观察四组细胞体外成血管的能力.结果 ①经流式细胞学检测,分离培养的BMSCs主要表达CD90、CD105和CD44;BMSCs向内皮细胞诱导1周后,细胞表面抗原CD34和CD133的表达升高,而CD90和CD105的表达减少,相比诱导前差异有统计学意义(P<0.05);BMSCs继续向成骨细胞诱导1周后,细胞表面抗原CD44和HLA-DR升高,相比诱导前差异有统计学意义(P<0.05).②茜素红染色结果显示D组的钙结节大于B组,而A组和C组未见钙结节形成.③体外血管新生试验中,C组的管道数目与面积大于D组,差异有统计学意义(P<0.05),而A组与B组未见管道形成.结论 BMSCs双向诱导形成内皮细胞、成骨细胞与BMSCs共存体系,在体外共培养过程中不仅可以形成钙结节,而且可以形成微血管,有利于骨组织和血管联合构建,是一种良好的构建组织工程骨的种子细胞.     

在体种植后骨髓基质干细胞(BMSCs)的定位及成骨效应研究

目的 探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)与支架材料复合，并种植到动物体内后的定位及成骨情况。方法 分离培养绿色荧光蛋白(GFP)小鼠BMSCs，体外扩增后与猪脱细胞骨基质材料复合，植入裸鼠背部作为实验组，并以单纯材料植入作为对照组，8周后进行大体观察、常规组织学检查及荧光检测、结果 实验组移植物周围部成骨明显，GFP阳性细胞较多；中央部材料降解吸收，GFP阳性细胞少见。对照组成骨较少。结论 BMSCs作为种子细胞参与了骨重建，同时GFP示踪是观测BMSCs的一种较好方法。     

经骨向诱导的骨髓间充质干细胞在脱钙骨上生长行为的实验研究

目的:建立成骨细胞-脱钙骨支架复合物,观察其诱导成骨能力,从而探寻组织工程化骨的体外构建方法.方法:运用细胞沉淀法将大鼠BMSCs诱导形成的成骨细胞接种于脱钙骨支架,通过扫描电镜(SEM)、免疫荧光观察脱钙骨表面细胞生长情况,通过上清液碱性磷酸酶(ALP)活性及Ⅰ型前胶原羧端肽(PICP)、骨钙素检测观察成骨细胞活性.结果:扫描电镜示成骨细胞在脱钙骨表面生长良好,上清液ALP、PICP及骨钙素表达均明显高于对照组(P＜0.05),并随时间的增长而显著增加(P＜0.05).结论:采用细胞沉淀法成功将成骨细胞接种于脱钙骨支架,成骨细胞在支架材料中增殖旺盛,细胞活性状态良好,具有良好的骨形成能力,脱钙骨支架可作为骨组织工程中载体支架的较优选择.     

骨髓间质干细胞复合脱钙骨基质和骨形态发生蛋白行兔腰椎横突间融合

 目的 探讨骨髓间质干细胞复合脱钙骨基质和骨形态发生蛋白进行兔腰椎横突间融合的效果。
方法 体外分离、培养骨髓间质干细胞,复合于脱钙骨基质材料,以骨形态发生蛋白进行成骨化诱导。日本大耳白兔60只,随机分为三组,A组以骨髓间质干细胞+脱钙骨基质+骨形态发生蛋白、B组以脱钙骨基质、C组以自体髂骨行L_5,6横突间融合。术后8周取腰椎标本,评估植入材料融合情况;行DR片灰度分析,计算成骨密度及成骨面积;行CT扫描三维重建观察横突间融合形态。HE染色分析横突间融合组织结构。
结果 大体可见A组及C组植入材料与宿主横突融合,融合组织质地硬,形态不规整;B组横突间植入材料大部分被吸收。DR片示A组与C组横突间呈高密度影,成骨密度不均;B组未达到骨性融合。CT示A组与C组融合标本有明显的连续骨痂通过横突间区;B组未见连续骨痂。A组成骨密度和成骨面积均高于B组,与C组无差异。组织学观察示A组与C组大量软骨形成,靠近横突处新生骨小梁形成;B组横突间连接主要为纤维组织。
结论 骨髓间质干细胞复合脱钙骨基质和骨形态发生蛋白行兔腰椎横突间融合,其成骨能力接近自体髂骨,优于单纯应用脱钙骨基质。     

腺病毒介导BMP-2和EGFP基因转染兔骨髓基质干细胞及种植脱钙骨的体外观察

目的用腺病毒载体介导人骨形态发生蛋白-2及EGFP基因转染兔骨髓基质干细胞(rBMSC),种植DBM(脱钙骨)支架体外构建组织工程骨。方法兔髓基质干细胞(rBMSC)的分离、培养;流式细胞仪检测细胞表面标记;转染后,荧光显微镜观察细胞最适感染复数(MOI)及蛋白印迹检测外源基因的表达情况;采用Urist提供的方法制备脱钙骨(DBM),用细胞计量法测定BMSCs与DBM复合培养的黏附率。然后将转染后细胞接种到DBM支架上,用荧光显微镜观察细胞是否成功粘附于支架材料上,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果 BMSCs细胞表型鉴定:CD44表达阳性,CD45表达阴性;转染后,蛋白印迹试验检测到BMP-2表达增高;骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质的平均粘附率为(72.74±1.99)%;扫描电镜见转染细胞生长良好,伸出丝状突起,相互连接。结论成功培养及鉴定兔BMSCs,Ad-BMP-2/EGFP可高效转染兔BMSCs,转染后的细胞种植于DBM支架材料后生长状况良好,组织工程骨构建成功。     

联合培养时诱导的内皮细胞对自体骨髓基质干细胞成骨作用的影响

目的探讨由骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导的内皮细胞(EC)与自体BMSCs共培养时对BMSCs成骨作用的影响。方法采用密度梯度离心法分离兔BMSCs,培养细胞分为四组：A组(BMSCs组)、B组(BMSCs成骨诱导组)、C组(EC诱导组)及D组(BMSCs和诱导的EC联合培养组),通过干细胞形态、免疫荧光、细胞增殖、碱性磷酸酶活性及骨钙素含量从酶学、组织学及生化等不同方面观察诱导的EC对BM- SCs成骨活性及牛长情况的影响。结果细胞免疫荧光染色证实C组培养诱导的细胞为EC。倒置相差显微镜、HE染色均显示EC与BMSCs混合生长良好。MTF检测结果：各组细胞增殖差异无显著性意义(P＞0．05)。碱性磷酸酶活性和骨钙素含量检测结果：D组明显高于其它各组,差异有显著性意义(P＜0．05)。结论由BMSCs诱导的EC能够增强BMSCs的成骨活性,提高BMSCs的增殖能力。     

低频振动刺激BMSCs修复骨缺损在体实验研究

目的 通过在体试验,探讨以骨髓基质干细胞(BMSCs)为种子细胞种植于脱钙骨支架与低频振动相结合进行修复骨缺损的可行性.方法 对30只家兔随机分为三组,A组:植入脱钙骨,B、C组:植入脱钙骨复合BMSCs.A、B两组施加频率25HZ振动,C组不参加振动,第5周取标本观测骨缺损愈合情况.结果 通过大体标本,组织学,电镜及...     

脱钙皮质骨基质的拉伸力学性能研究

目的探讨脱钙皮质骨基质厚度与拉伸力学性能的关系,为将其作为组织工程支架材料奠定实验基础。方法取市售新鲜小牛胫骨,常规快速脱钙制备脱钙皮质骨基质,大体观察其颜色、质地等物理性状,并进行脱钙检测。将脱钙皮质骨基质沿径向纵切成不同厚度的片材,并根据厚度分为4组(n=16),分别为A组100～300μm,B组300～500μm,C组500～700μm,D组700～1 000μm;对每组标本进行拉伸性能和组织学观测。结果大体观察显示脱钙皮质骨基质经H2O2处理后呈乳白色,柔韧性好,富有弹性。脱钙皮质骨基质的脱钙率达97.6%。A组强度及弹性模量明显小于B、C、D组(P<0.05),B、C、D组间比较差异均无统计学意义(P>0.05);脱钙皮质骨基质刚度随厚度增加呈逐渐增大趋势,A组刚度显著低于B、C、D组(P<0.05),B、C组低于D组(P<0.05),B、C组间差异无统计学意义(P>0.05);各组极限应变差异均无统计学意义(P>0.05)。组织学观察各组均可见典型骨单位结构,其最大直径范围为102～325μm,平均最大直径为182μm。结论骨单位的完整性对脱钙皮质骨基质的力学性能有重要影响;脱钙皮质骨基质作为组织工程支架材料,在厚度>300μm时可保持其拉伸力学性能。     

应用显微外科技术修复骨肿瘤骨缺损

目的：介绍骨肿瘤骨缺损的显微外科治疗及临床疗效。方法：回顾性的总结15例骨肿瘤巨大骨缺损的显微外科手术治疗资料。病灶处理：切刮12例，段截3例。作带血管蒂的的骨块转位移植12例，吻合血管的游离腓骨移植3例。结果：全部病例获长期随访，平均随访3年。所有病例在术后3～4月达骨愈合，无一例复发。结论：应用显微外科技术修复骨肿瘤巨大骨缺损，能缩短骨愈合时间，复发少，患功能恢复好。     

异体松质骨移植治疗骨肿瘤切除后骨缺损

目的：探讨应用异体松质骨移植治疗肿瘤切除后骨缺损的生物材料填充方法。方法：总结应用深低温冷冻保存异体松质骨移植治疗骨肿瘤切除后骨缺损57例。年龄6－56岁,平均年龄17．4岁。结果：除1例因感染异体骨取出外,其余56例均取得满意的骨愈合,愈合时间平均为4．5个月。依骨腔大小或植骨量的不同愈合时间 亦有所不同。单纯异体松质骨移植与异体松质骨加自体松质骨混合移植相比,愈合时间没有明显不同。植骨量越大,骨愈合时间越长。此组患者中未见明显排异反应及并发感染者。肿瘤复发率为7％。结论：同其他骨缺损填充方法和大块异体骨的使用相比,此种方法可行性较好,安全性较高。在骨愈合率,骨愈合时间上及复发以外并发症的发生上同自体松质骨植骨无明显差异。     

Prediction of bone loss using biochemical markers of bone turnover

Summary The association between baseline levels of eleven bone turnover markers and 5-year rate of bone density change was prospectively studied in a population-based sample of 601 75-year-old women. Several bone formation and resorption markers as well as urinary osteocalcin were modestly correlated to rate of bone density change. Introduction Prediction of bone loss by bone turnover markers (BTMs) has been investigated with conflicting results. There is limited information in the elderly. Methods Eleven bone turnover markers were analyzed in 75-year old women in the OPRA study (n = 601) and compared to the 5-year change of areal bone mineral density (aBMD) in seven skeletal regions. Results Annual aBMD change varied between +0.4% (spine) and −2.0% (femoral neck). Significant associations (p < 0.01) were found for four different serum osteocalcins (S-OCs) (standardized regression coefficient −0.20 to −0.22), urinary deoxypyridinoline (−0.19), serum TRACP5b (−0.19), serum CTX-I (−0.21), two of the three urinary osteocalcins (U-OCs) (−0.16) and aBMD change of the leg region (derived from the total body measurement). After adjustment for baseline aBMD, associations were found for all S-OCs (−0.11 to −0.16), two of the three U-OCs (−0.14 to −0.16) and aBMD change at the total hip, and for three of the four S-OCs (−0.14 to −0.15), S-TRACP5b (−0.11), two of the three U-OCs (−0.14 to −0.15) and aBMD change at the femoral neck. There were no significant results concerning aBMD change at the spine. Conclusion This study indicates that BTMs are correlated with aBMD loss in some skeletal regions in elderly women.     

硫酸钙人工骨填充良性骨肿瘤刮除后骨缺损愈合情况的临床研究

目的分析硫酸钙人工骨填充良性骨肿瘤刮除后骨缺损的愈合情况,探讨人工骨在骨肿瘤切除重建中的作用。方法自2005年12月至2008年3月,应用Osteo Set硫酸钙人工骨移植治疗72例原发良性骨肿瘤,其中随访资料完整的47例。根据术后随访期X线片所见评估人工骨降解、吸收和骨愈合生长情况,评估38例含脱钙骨基质（demineralized bone matrix,DBM）和9例未含DBM硫酸钙人工骨的愈合情况,研究植骨量对愈合情况的影响,同时采用肌肉骨骼肿瘤协会（Musculoskeletal Tumor Society,MSTS）功能评分评价关节功能。结果 47例患者获3～55个月随访,平均随访时间16.3个月。均有人工骨颗粒与宿主骨间隙变模糊以及颗粒间变模糊,平均用时3.1（1～6）个月;42例完全吸收,用时4.2（1～12）个月;27例重新塑形,用时7.3（3～17）个月。人工骨愈合良好39例（83.0%）,未出现不愈合病例。含DBM硫酸钙与不含DBM硫酸钙人工骨植入患者的愈合率分别为89.5%和77.8%。植骨量≤5mL组愈合率95.6%,用时6.8（3～12）个月;植骨量〉5mL组愈合率79.2%,用时5.5（3～17）个月。对两组愈合率、愈合时间进行比较,差异无统计学意义（Z=-0.100,P=0.920;Z=-0.650,P=0.516）。MSTS功能评分平均28.8分。术后2例出现伤口不愈合。结论对于良性骨肿瘤切除后骨缺损的重建,硫酸钙人工骨愈合效果满意,是一种安全、有效的移植材料。     

谷康泰灵对骨质疏松模型大鼠骨形成和骨吸收功能的影响

目的　观察药物谷康泰灵对骨质疏松 (OP)模型大鼠骨形成和骨吸收功能的影响 ,为其临床治疗骨质疏松提供实验依据。方法　SD大鼠 4 4只 ,随机分为正常组 (13只 )和骨质疏松模型组 (31只 )。以维甲酸 80mg·kg- 1 ·d- 1 灌胃 15d,诱导OP模型。模型复制成功后 ,各组处死 5只 ,正常组 (8只 )继续观察 ,模型组又随机分为无措施对照组 (8只 )、谷康泰灵治疗组 (10只 ,0 0 8mg·kg- 1 ·d- 1 谷康泰灵腹腔注射 )和雌二醇治疗组 (8只 ,每只 0 0 5mg,每周 3次苯甲酸雌二醇腹腔注射 )。治疗期 30d。观察股骨松质骨区成骨细胞及破骨细胞数量和血清中AKP、TRAP活性变化。结果　与正常组相比 ,维甲酸诱导的OP模型大鼠股骨松质骨区成骨细胞功能活跃 ,数量变化不大 ;破骨细胞数量、活跃程度显著增加 ;血清中AKP和TRAP明显增高。谷康泰灵治疗后 ,OP大鼠活跃成骨细胞数量明显增加 ,破骨细胞数量显著减少 ,血清AKP活性明显增高 ,TRAP活性下降。结论　谷康泰灵对OP大鼠骨形成和骨吸收功能有显著影响 ,可刺激成骨细胞的产生增加成骨细胞的活性 ,减少破骨细胞的数量抑制破骨细胞的活性。     

Peak bone mass, bone loss and risk of fracture

Both peak bone mass and bone loss contribute to subsequent fracture risk. Other variables such as architectural abnormalities, microdamage, geometric properties, and trauma probably contribute as well. Until the contribution of these other potentially important risk factors can be quantified, it will be difficult to determine precisely the relative importance of peak bone mass and subsequent bone loss in the etiology of fractures.     

Isozymes of bone esterases

Esterase isozymes were studied in bone extracts from various species and in bone from newborn rabbits. Bone was frozen in liquid nitrogen and crushed. The isozymes were extracted with isotonic saline and separated by electrophoresis on starch gel. The isozyme pattern differed between species and between various developmental stages in the same species. Using specific enzyme inhibitors it was found that the esterase fractions identified in bone were presumably nonspecific organophosphate-sensitive esterases.This work was supported by grants from Gustaf V:s 80-årsfond and from Alfred österlunds Stiftelse.     

活骨移植治疗四肢骨肿瘤切除后长段骨与关节缺损

目的:探讨四肢骨肿瘤的广泛或边缘切除后,长段骨关节缺损的修复方法及其疗效。方法:四肢骨肿瘤切除术后骨缺损14例,男10例,女4例;年龄4~37岁。骨巨细胞瘤4例,骨化性纤维瘤1例,非骨化性纤维瘤2例,韧带样纤维瘤1例,骨纤维结构不良3例,侵袭性骨母细胞瘤1例,软骨母细胞瘤1例,瘤样病损致骨溶解1例。14例四肢侵袭性良性骨肿瘤行肿瘤广泛或边缘切除,应用吻合血管的腓骨、带腓骨头腓骨近端和带旋髂深血管的髂骨瓣移植修复骨缺损、重建桡腕关节和重建肩关节。移植体行简单内固定加外固定。术后定期复查X线片、多普勒血管超声,其中3例行ECT核素骨扫描,并作关节功能评定。结果:随访3个月~5年,13例均于手术后3个月后达Ⅰ期愈合,其中1例因内固定松动再次手术而愈合。1例肿瘤局部复发,再次行肿瘤切刮与植骨术后愈合;2例畸形愈合行截骨矫形后愈合。关节功能评定:优9例,良3例,差2例。结论:骨肿瘤切除后行骨移植修复骨缺损、重建关节,手术切除彻底,复发率低,植骨愈合可靠,重建后的关节功能良好。     

Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats

Low-calcium-fed animals have been accepted as one of the experimental models showing a reduction in bone mass. However, the effects of short-term low-calcium feeding on bone turnover, the development of osteoprogenitor cells, and gene expression of bone matrix proteins have not been reported. In this study, we examined the effect of a low-calcium diet on rat tibia and analyzed the changes in the bone by histomorphometry, bone marrow cell culture, and in situ and Northern hybridization of the bone matrix proteins. Rats were fed either a low-calcium diet (0.05% Ca) or a normal calcium diet (0.5% Ca) using the pair feeding technique. They were killed at day 0, 12 h, and days 1, 2, and 3. In the low-calcium group, the serum parathyroid hormone (PTH) level was temporarily increased in 12 h after feeding the low-calcium diet. Bone mineral density in the trabecular bone was significantly decreased from 1 day after the low-calcium feeding, but cortical bone did not show any changes during the experimental period. The bone volume per tissue volume in the proximal tibia also decreased from day 1 in the low-calcium group. The number of osteoclasts and osteoblasts on the trabecular bone surface was increased in the low-calcium group compared with the normal-calcium group. An ex vivo study showed that the number of progenitors of osteoclasts and osteoblasts in bone marrow was also increased in the low-calcium group of rats. The localization of type I collagen mRNA was observed in osteoblasts in the low-calcium group. The Northern hybridization study showed that the gene expression of type I collagen, osteopontin, and osteocalcin was increased at day 3 in the low-calcium group. These results indicated that the trabecular bone surface quickly responded to the low-calcium feeding and that bone remodeling activity was activated probably by PTH. The changes in bone marrow cell populations and the gene expression of bone matrix proteins are closely associated with increased bone turnover induced by the low-calcium diet, resulting in rapid bone loss of the trabecular bone.     

人工骨联合自体骨髓移植技术的骨缺损修复研究与应用

目的分析人工骨联合自体骨髓移植技术治疗骨缺损的临床疗效。方法选取2011年4月至2013年9月,来本院诊治的四肢粉碎性骨折术后骨缺损患者40例,随机分为两组（A、B组）,分别行自体髂骨植骨和人工骨联合自体骨髓移植治疗四肢粉碎性骨折所致骨缺损。术后观察两组骨折愈合时间,骨折愈合率,并发症的发生及骨缺损的修复和功能重建优良率。结果两组均行6～12个月随访,平均（9.14±1.36）月,所有患者植骨术后均无切口感染、发热等并发症。A组15例骨缺损区愈合良好,住院时间平均（19.36±2.54）天,骨折愈合时间平均（5.67±1.52）个月,骨缺损的修复和功能重建评价标准,优12例,良3例,可3例,差2例,优良率75%;B组18例骨缺损区愈合良好,住院时间平均（12.19±1.52）天,骨折愈合时间平均（3.61±1.13）个月,骨缺损的修复和功能重建评价标准,优16例,良2例,可2例,差0例,优良率90%。B组骨缺损治疗效果显著优于A组。结论人工骨联合自体骨髓移植较单纯自体髂骨移植治疗骨缺损更能促进骨痂生长,加速骨折后骨缺损愈合,更加有效地减少住院时间及骨折愈合时间,骨折愈合率更高,骨缺损修复和功能重建效果更加显著。