半乳糖化白蛋白磁性阿霉素纳米粒对肝癌细胞株HepG2侵袭力的影响

目的 研究半乳糖化磁性白蛋白阿霉素纳米粒(Gal-MADM)对肝癌细胞株HepG2侵袭力的影响。方法应用Gal-MADM于HepG2细胞,并设A组:RPMI 1640对照组、B组:普通盐酸阿霉素(ADM)组、C组:磁性白蛋白阿霉素纳米粒联合磁场(MADM M)组、D组:半乳糖化白蛋白阿霉素纳米粒(Gal-ADM)组、E组:Gal-MADM联合磁场(Gal-MADM M)组。药物作用后以β-actin基因作为参照,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测组织蛋白酶(C)B mRNA的表达差异,应用Transwell小室检测体外侵袭力的变化,并用裸鼠肝癌皮下转移模型检测对体内侵袭力的影响。结果Gal-MADM作用HepG2肝癌细胞后CB mRNA表达降低较其他各组更为明显且有显著性,侵过小室滤膜细胞数目减少于其他各组且差异有显著性(P<0.01),裸鼠肝癌生长明显受到抑制(P<0.01)。结论Gal-MADM抑制肝癌细胞株HepG2的侵袭力的作用较ADM、MADM和Gal-ADM为强。     

交变磁场介导下半乳糖白蛋白磁性阿霉素对人肝癌细胞和肝细胞的影响

目的 观察半乳糖白蛋白磁性阿霉素纳米粒联合交变磁场对肝癌细胞和人肝细胞的影响.方法 将人肝癌细胞HepG2及人肝细胞L-02细胞,随机分成A1、A2组(即RPMI 1640对照组),B1、B2组(游离阿霉素),C1、C2组(半乳糖白蛋白磁性阿霉素纳米粒),D1、D2组(阿霉素纳米粒),E1、E2组(半乳糖白蛋白磁性阿霉素纳米粒),实验组每组含有0.5 mg/L或等量的阿霉素;除C1、C2组外,其他各组置交变磁场(频率为100 kHz、磁场强度为15 kA/m)中,作用30 min.通过细胞计数、Hoechst荧光染色、DNA蛋白电泳、流式细胞仪检测,观察细胞生长曲线、细胞形态、细胞凋亡及细胞周期的变化.结果 (1)E1、E2组,HepG2和L-02细胞增殖抑制作用最强,DNA梯形带最明显,细胞凋亡率分别达40.12%、45.3%;S期细胞分别为39.53%、53.46%,明显高于其他组(P＜0.01);(2)L-02细胞的形态改变、细胞增殖抑制、细胞凋亡率明显强于HepG2细胞(P＜0.05).结论 半乳糖白蛋白磁性阿霉素纳米粒在交变磁场介导下,对HepG2和L-02细胞产生热化疗协同增效的作用.     

荧光分光光度法检测纳米粒运载的阿霉素在大鼠体内的分布

目的　观察由半乳糖化磁性白蛋白纳米粒运载的阿霉素经舌静脉给药后在大鼠体内的的分布状况。方法　全部大鼠随机分为 4组 ,经舌静脉 ,按分组分别注射 :游离阿霉素组(FADM ) ;磁性阿霉素白蛋白纳米粒 (MADM ) ;半乳糖化磁性阿霉素白蛋白纳米粒组 (Gal2 9 ADM ) ;半乳糖磁性阿霉素白蛋白纳米粒 外加磁场 (Gal2 9 ADM M ) ,剂量均为阿霉素 2 .5mg/kg体重。取全血、心、肺、肝、脾、肾。全血制成血浆 ,器官组织制成匀浆 ,盐酸乙醇法提取阿霉素 ,用荧光光度计测量。结果　静脉注射同等剂量、不同剂型的阿霉素药物后 ,阿霉素在器官中的蓄积程度从高到低 :肝 :D靶肝 >D非靶肝、C >B >A ;心脏、肾、血浆 :A >B >D、C ;脾 :B >A、C、D ;肺 :B>A >C、D。磁性阿霉素白蛋白纳米粒注入体内后 ,在心、肺、肝、脾、肾中的药物浓度在 15～ 3 0min达峰值 ,而半乳糖化后 ,阿霉素的药物峰值提前到 5min或之前。外加磁场和未加磁场的半乳糖化磁性阿霉素白蛋白纳米粒组的药物靶向指数和药物选择指数是均高于磁性白蛋白纳米粒。结论　磁性阿霉素白蛋白纳米粒经半乳糖化后 ,可显著增强阿霉素对肝脏的靶向性 ,并显著降低心、肺、脾、肾、血浆肝外器官的组织阿霉素浓度。利用外加磁场 ,可提高阿霉素在肝脏特定部位蓄积的能力。     

外加磁场对半乳糖化白蛋白磁性阿霉素纳米粒在大鼠体内分布的影响

目的　观察半乳糖化白蛋白磁性阿霉素纳米粒在正常肝脏中的靶向性 ,并观察半乳糖化白蛋白磁性阿霉素纳米粒在全身各脏器的分布特征及外加磁场对其分布的影响。方法　大鼠正中开腹 ,肝动脉插管并固定 ,肝动脉注射12 5I半乳糖化白蛋白磁性阿霉素纳米粒 (相当于阿霉素0 .5mg/kg) ,左外叶加磁场 ,磁场应用 3 0min ,移去磁场后 ,动物立即处死 ;对照组 :肝动脉注射半乳糖化白蛋白磁性阿霉素纳米粒 ,左外叶不加磁场 ,3 0min后 ,移去磁场后 ,动物立即处死 ,立即取靶区肝、非靶区肝、肾、心、肺、小肠、脾及周围血作γ计数。肝组织作病理切片。结果　注入的纳米粒75 %～ 85 %分布于肝脏 ,其他脏器极少。病理切片显示磁区小动脉见大量纳米粒存在 ,对照组及非磁区肝中纳米粒很少见。结论　半乳糖化白蛋白磁性阿霉素纳米粒在正常肝组织中有明显的磁靶向性 ;在磁场作用下 ,半乳糖化白蛋白磁性阿霉素纳米粒主要分布于肝脏 ,其他脏器含量很少 ;实验组肾、心、肺、小肠、脾及外周血与对照组的放射活性比较明显降低 ,表明磁性物质的存在使这些脏器的相对药物暴露明显减少     

半乳糖化磁性白蛋白阿霉素纳米粒与阿霉素对大鼠的毒性比较

目的　比较研究半乳糖化磁性白蛋白阿霉素纳米粒 (AGMAN)和阿霉素 (ADM )对大鼠的毒性作用。方法　将AGMAN和ADM分为几个不同的剂量组 ,观察静脉给药后的两种药物的急性LD5 0 ,同时将未死亡的动物进行肝肾功能 ,心肌酶学的检查 ,观察其改变。结果　半乳糖化磁性白蛋白阿霉素纳米粒比阿霉素的LD5 0显著的提高。动物的肝肾功能损害明显减轻。结论　AGMAN具有很安全的用药范围 ,对动物的主要器官及全身的毒副作用相对ADM也有明显的减轻     

磁性阿霉素白蛋白纳米粒在移植性肝癌模型中的磁靶向性

目的：观察磁性阿霉素白蛋白纳米粒在移植性肝癌模型中的磁靶向性，并观察磁性白蛋白纳米粒在各脏器中的分布特征。方法：建立大鼠移植性肝癌模型。大鼠正中开腹，胃十二指肠动脉插管固定。实验组，肝肿瘤区外加磁场，肝动脉注射磁性阿霉素白蛋白纳米粒(相当于阿霉素0．5mg／kg)，磁场应用30min，移去磁场后，动物立即处死。对照组肝肿瘤区不加磁场，肝动脉注射同样剂量的纳米粒后30min处死。动物处死后，立即取肿瘤组织、非磁区正常肝组织、心、肾、脾、肺、小肠和胃作了计数，肿瘤组织、肝组织送病理切片检查。结果：肝肿瘤区应用磁场30min后，磁区肿瘤组织的放射活性较非磁区肝组织的放射活性明显增加，磁区肿瘤组织的放射活性为非磁区正常肝组织的放射活性的8．7倍。对照组在没有磁场存在的情况下，肿瘤组织的放射活性为正常肝脏的2．8倍。实验组肺的放射活性较对照组明显降低。肾、心、脾、小肠和胃两组之间无明显差异。另外，实验组脾、肺和胃与肿瘤组织的放射活性之比较对照组大为降低。注入纳米粒800%以上分布于肝脏。结论：在磁场的作用下，磁性阿霉素白蛋白纳米粒在大鼠移植性肝肿瘤中的聚集明显增加。即使肝肿瘤区没有外加磁场，由于肿瘤组织和正常肝组织血管密度的差异，磁性阿霉素白蛋白纳米粒在肿瘤组织中的分布明显高于正常肝组织。实验组脾、肺、胃与肿瘤组织的放射活性比值大大低于对照组，说明磁场的存在使这些脏器的相对药物暴露明显降低。     

半乳糖化磁性阿霉素白蛋白纳米粒对大鼠移植性肝癌模型bcl-2/bax蛋白表达的研究

目的　半乳糖化白蛋白磁性阿霉素纳米粒 (Gal MADM NP)治疗大鼠移植性肝癌对肿瘤细胞凋亡bcl 2及bax蛋白表达的影响。方法　采用SABC法进行免疫组织化学染色观察bcl 2及bax蛋白的表达。结果　注射Gal MADM NP(肿瘤区加磁场 )组免疫组织化学显示bcl 2蛋白表达阳性率 2 3 .5 3 % ,低于ADM组 5 4.5 5 %及NS组 71.43 % (P <0 .0 1) ,bax蛋白表达阳性率88.2 4% ,高于ADM组 45 .45 %及NS组 2 8.5 7%。结论　Gal MADM NP组在适当外加磁场的作用下 ,能够降低bcl 2蛋白表达 ,增加bax蛋白表达 ,促进移植肝癌肿瘤细胞凋亡。     

磁性纳米介导的pcDNA3.1(+)-p53对HepG2细胞的作用

目的:探讨氨基硅烷化Fe3O4磁性纳米介导的pcDNA3.1(+)-p53质粒（-p53质粒）对人肝癌HepG2细胞的作用。方法:（1）以-p53质粒作为表达基因，用氨基硅烷化Fe3O4磁性纳米粒进行细胞转染，计算转染率，并与脂质体转染组，空白载体组及空白对照组进行比较。（2）观察在外加磁场条件下的氨基硅烷化Fe3O4磁性纳米粒的转染效率和速度。（3）观察-p53磁性纳米粒对HepG2细胞生长增殖的抑制作用。结果:（1）RT-PCR及Western blot 检测证实，载有氨基硅烷化Fe3O4的磁性纳米粒能成功的在人肝癌HepG2细胞中导入了外源性的野生型p53基因，其转运效率（39%）略高于相同条件下脂质体的转染效率（36%）（P>0.05）。（2）在外加磁场条件下氨基硅烷化Fe3O4磁性纳米粒的转染效率明显增强。（3）转染的外源性p53基因可明显抑制人肝癌HepG2细胞的生长速度及集落形成能力，使细胞阻滞于G1期，抑制率为46%。结论:（1）氨基硅烷化Fe3O4纳米颗粒是良好的基因转运载体，可将外源性基因成功的转入靶细胞。（2）转入外源性野生型p53能有效抑制HepG2细胞的生长增殖。该研究为基因治疗恶性肿瘤的在体实验奠定了基础。     

阿霉素磁性蛋白微球靶向治疗鼠种植性胃肿瘤

目的 探讨阿霉素磁性蛋白微球联合外磁场体内外抑制肿瘤生长的机制。方法 Ｗｉｓｔａｒ大白鼠３２只,用ＭＴ法检测阿霉素磁性蛋白微球对Ｗａｌｋｅｒ－２５６细胞的抑制率及半数抑制剂量;观察其体仙靶向治疗敏感细胞鼠种植性胃肿瘤的疗效。结果 阿霉素磁性蛋白微球与游离阿霉素体外对肿瘤细胞的生长抑制率相似,联合外磁场后其抑制率作用明显增强。靶向组对种植瘤的抑制率达８２．５２％,荷瘤动物生成时间明显延长,延长率达２     

半乳糖化白蛋白磁性阿霉素纳米粒制备工艺的优化及缓释性的研究

目的 制备具有稳定磁性、能够携带化疗药物的半乳糖化白蛋白磁性纳米粒,并对纳米粒的磁性、药物含量、包封率、粒径大小等物理性质进行检测。方法 运用正交试验设计方法设计实验,以粒径大小、纳米药物的载药量和包封率3个指标考察固化温度、固化时间、搅拌速度及糖化比率4个因素的4个水平,从中选出最优化组合,并以最优化组合重复实验,验证试验条件的稳定性以及实验的可重复性。先行制备半乳糖化白蛋白,将阿霉素、半乳糖化白蛋白、磁粉按一定比例混合,通过在精制棉籽油中超声乳化、加热变性固化、乙醚洗涤等工艺制作出载药纳米粒,用乙醇提取法提取纳米粒中的阿霉素,并用紫外分光光度计测定含量,激光粒度分析仪分析粒径大小。结果 运用最优化条件制备的纳米粒,其平均粒径为(197±32)mm,载药量(48.79±4.47)mg/L,包封率(94.34±3.32)％。结论 上述优化条件稳定,试验的可重复性高。     

半乳糖白蛋白磁性阿霉素纳米粒在正常大鼠体内的靶向性分布的研究

目的 观察半乳糖白蛋白磁性阿霉素纳米粒(Gal-MADM)在正常肝脏中的靶向性,并观察Gal-MADM在全身各脏器的分布特征。方法 使用放射示踪技术,用125I标记纳米粒。肝动脉注射,分别于注药后5、15、30、60、120min处死,立即取肝、肾、心、肺、小肠、脾、及周围血作γ计数。用同样的方法进行白蛋白磁性阿霉素纳米粒(MADM)在大鼠体内分布实验。结果 Gal-MADM和MADM肝摄取分别在注射后5 min后最高,分别为15 054.4 CPM／g和6 186.7 CPM／g,各时相前者的肝摄取率均为同时刻后者的2-3倍。在肝、肾、心、肺、小肠、脾、及周围血的分布两药差异有高度显著性(P<0.05)。结论Gal-MADM在正常肝组织中有明显的主动靶向性,Gal-MADM主要分布肝脏,其它的脏器含量少。     

乙型肝炎病毒x蛋白对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨乙型肝炎病毒x蛋白 (hepatitisBvirusxprotein ,HBx)在体内外对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法将携带HBx基因的表达质粒 pHA HBx转染HepG2细胞 ,通过检测细胞生长曲线、倍增时间和3 H TdR掺入率观察HBx对细胞增殖活性的影响 ;将整合HBx基因的HepG2细胞接种裸鼠 ,建立表达HBx的人肝癌裸鼠模型 ,用阿霉素进行裸鼠腹腔化学药物治疗 ,观察肝癌组织的生长状况 ;用TUNEL方法检测切除的裸鼠癌标本中凋亡细胞的比例。结果转染HBx基因的HepG2细胞倍增时间为 2 8 5h ,对照组为 32 5h ;3 H TdR掺入率 :转染HBx基因组为 (10 2 1± 78)cpm ,对照组为 (85 9± 6 9)cpm ,转染组细胞明显高于对照组细胞 (t =2 5 4 ,P <0 0 1) ;转染HBx基因的细胞在裸鼠体内形成的癌重量为 (3 10± 0 39) g ,对照组癌重量为 (2 6 1± 0 2 8) g ,两组之间差异有显著意义 (t=2 0 3,P <0 0 5 ) ;裸鼠腹腔化学药物治疗后 ,转染组的癌细胞凋亡为 3 5±0 75 ,对照组为 2 2 5± 6 5 ,转染HBx基因的细胞凋亡明显减少 (χ2 =6 6 9,P <0 0 1)。结论HBx可以提高HepG2细胞的增殖活性 ,促进裸鼠体内肝癌生长 ,对阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡具有抑制作用。     

阿霉素诱导人胆囊癌细胞凋亡的研究

目的　观察阿霉素 (ADM )对胆囊癌细胞凋亡的影响。方法　在体外培养的胆囊癌细胞中加入不同浓度的阿霉素 ,应用光镜、电镜、DNA凝胶电泳及流式细胞仪检测胆囊癌细胞凋亡的形态学特征、生化学特征、细胞凋亡百分率及细胞周期的变化。结果　在阿霉素作用下 ,凋亡的胆囊癌细胞出现膜小泡、凋亡小体等特征性改变 ;DNA电泳呈现典型的“梯状”条带 ;流式细胞仪测定 ,出现典型的凋亡峰 ,其凋亡百分率随着药物浓度的提高而明显升高 ,分别与对照组比较 ,差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ;同时 ,S期细胞含量下降 ,而G2 /M期细胞含量上升。非凋亡细胞则无此表现。结论　ADM可诱导胆囊癌细胞发生凋亡 ,并可使胆囊癌细胞生长受阻于G2 /M期 ,这可能是其杀伤肿瘤的一种重要机制     

5-氟尿嘧啶磁性白蛋白微球联合恒定外磁场对人胰腺癌细胞生长的抑制作用

目的 探讨5-氟尿嘧啶磁性白蛋白微球(5-Fu-MAMS)联合恒定外磁场体外对人胰腺癌PC-3细胞生长的抑制作用及其机制.方法 将体外培养人胰腺癌PC-3细胞分为5-Fu-MAMS联合磁场组;5-Fu-MAMS组;游离5-Fu组,倒置显微镜下观察肿瘤细胞的生长状态,噻唑蓝(MTT)比色分析法检测各组细胞的抑制率.结果 5-Fu浓度为20.0 mg/L时,5-Fu-MAMS组与游离5-Fu组抑制率分别为57.7％和59.6％,IR＞ 50％,药物敏感,差异无统计学意义(P＞0.05);5-Fu浓度为10.0 mg/L时,5-Fu-MAMS联合磁场能明显提高化疗药物的抑瘤效果,IR为60％,IR与其他两组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 5-Fu-MAMS和游离5-Fu有相似的药理作用;联合恒定外磁场能显著增强5-Fu-MAMS的抑瘤效应.     

纳米金对表阿霉素的增敏作用

目的 观察纳米金对表阿霉素在抑制HepG2细胞增殖中如何发挥增敏作用.方法 实验组分为纳米金预处理组和单纯表阿霉素组.常规消化HepG2细胞后种板,各组分别加入2 μg/L的纳米金溶液和无血清培养液100μl,于设定的时间点(30、60、120和240 min)加入1 mg/L的表阿霉素溶液100μl,继续培养24 h后噻唑蓝(MTT)比色法检测两组药物对HepG2细胞的增殖抑制作用;紫外-可见分光光度计(UV-Vis)检测各组HepG2细胞内积聚的表阿霉素量;原子力显微镜(AFM)观察HepG2细胞表面形态及超微结构变化.结果　纳米金预处理组各时间点HepG2细胞增殖抑制率[(50.53±1.38)%、(51.83±0.47)%、(48.66±2.21)%、(43.55±1.01)%]均明显高于对应的单纯表阿霉素组[(37.24±3.49)%、(39.42±2.28)%、(34.98±2.27)%、(28.92±3.80)%],P值＜0.01;纳米金预处理组(60min)表阿霉索在HepG2细胞内积聚的量最多,为(4.01±0.14)μg;AFM检测到纳米金预处理组HepG2细胞膜内陷,粗糙度增加,表面孔径增大,细胞核的饱满程度减少.结论　纳米金可通过增加表阿霉素在HepG2细胞内的积聚量来发挥增敏作用,纳米金预处理60 min对表阿霉素的增敏作用最大.

Abstract：

Objectiye To observe the sensitization of gold nanoparticles on the epirubicin therapy of hepatocellular carcinoma cells (HepG2) and action mechanism. Methods The HepG2 cells were divided into 2 experimental groups: gold nanoparticles pretreatment group and simple epirubicin group. After seeded in a 96-well plate and cultured for 24 h, HepG2 cells were treated with 100 μl of gold nanoparticles (2 μg/L) and serum-free medium respectively. Then 100 μl of epirubicin ( 1 mg/L) was added to both groups at different time points: 30, 60, 120 and 240 min. The inhibition effect of epirubicin on the HepG2cells was assessed by methyl thiazol tetrazolium (MTT) assay. Ultraviolet-visible spectrophotometer (UV-Vis) was applied to detect the epirubicin accumulation in HepG2 cells at different time points, and atomic force microscope (AFM) was used to examine the ultrastructural changes of HepG2 cell surface. Results The inhibition rate of HepG2 cells in gold nanoparticles pretreatment group [(50. 53 ± 1.38 ) %,(51.83 ± 0. 47 ) %, (48. 66 ± 2.21 ) %, (43.55 ± 1.01 ) %] at different time points was higher than the simple epirubicin group remarkably [( 37.24 ± 3.49 ) %, ( 39. 42 ± 2. 28 ) %, ( 34. 98 ± 2. 27 ) %,(28.92 ±3. 80)%] ,P ＜0. 01. The gold nanoparticles pretreatment group (60 rain) had the maximal epirubicin accumulation: (4. 01 ±0. 14) μg. AFM revealed that when treated with gold nanoparticles, the morphologic changes of HepG2 cells were significantly different: there appeared invagination, obvious shrinked cell membrane and much rougher surface. Conclusion Gold nanoparticles can sensitize epirubicin through the enhancement of epirubicin accumulation in HepG2 cells. The pretreatment of gold nanoparticles for 60 min has the maximum sensitization.     

TRAIL联合阿霉素诱导肝癌耐药株凋亡的实验研究

目的研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumornecrosisfactorrelatedapoptosisinducingligand,TRAIL)及TRAIL和阿霉素(ADM)联用对肝癌耐药株诱导凋亡的作用。方法通过浓度递增法用阿霉素处理人肝癌细胞株HepG2获得肝癌耐药株HepG2/ADM。并通过MTT方法鉴定耐药株的耐药性。构建可溶型TRAIL真核表达质粒真核表达质粒pIRES-EGFP-TRAIL。通过脂质体(Lipofectamine)2000介导转染质粒入HepG2/ADM。通过RT-PCR和Westernblot证实转染的HepG2/ADM有sTRAIL的mRNA和蛋白的表达后,用MTT方法和AnnexinVFITCPI染色流式细胞仪检测单纯TRAIL处理和联合阿霉素处理HepG2/ADM的生长抑制率和凋亡率。并用共聚焦显微镜观察处理后细胞凋亡的形态。结果肝癌耐药株筛选成功,sTRAIL质粒构建、转染成功。用MTT测HepG2/ADM抑制率阿霉素处理组40.9%;TRAIL处理组29%;合用组58.4%;联合后抑制率有显著差异。凋亡检测为阿霉素处理组18.37%;TRAIL处理组14.8%;合用组52.71%。但TRAIL处理HepG28.9%和HepG2/ADM8.54%的凋亡率无显著差异。结论TRAIL联合阿霉素能明显增加HepG2/ADM的凋亡从而逆转耐药。同时单纯TRAIL治疗对耐药株作用与亲代细胞作用相仿,说明TRAIL可能有另外的诱发凋亡的途径,受HepG2/ADM耐药性的影响小。     

磁性阿霉素维拉帕米清蛋白纳米粒的制备及性能检测

目的 制备磁性阿霉素维拉帕米清蛋白纳米粒并检测其磁性、载药量、粒径大小等物理性能,为进一步进行动物实验和临床应用奠定基础.方法 先将市售棉籽油精制,再将盐酸阿霉素、盐酸维拉帕米、人血清蛋白及Fe3O4磁粉按一定比例混合,采用加热固化法制备磁性阿霉素维拉帕米清蛋白纳米粒.用透射电子显微镜检测颗粒形态和粒径大小.倒置显微镜下观察载药纳米粒的磁响应性和结构.绘制标准曲线,高效液相色谱仪检测纳米粒中维拉帕米的载药量,荧光分光光度仪检测阿霉素的载药量.结果 纳米粒大小均一,形态规则,呈圆球形,磁响应性好.平均粒径约0.5 μm,维拉帕米载药量为0.8%,阿霉素载药量为1.25%.结论 加热固化法可以制备出同时包载两种药物的纳米粒,物理性能良好,制备方法简便,实验条件容易控制.