地塞米松对人骨髓基质干细胞成脂与成骨分化的影响的初步报告

目的探讨不同浓度的地塞米松对骨髓基质干细胞成脂与成骨分化的影响。方法取人骨髓分离培养骨髓基质干细胞,经传代后分别置入地塞米松1×10-8mol/L(A组)、1×10-7mol/L(B组),应用Rt-PCR技术分别扩增成脂基因mPNA(PPARγmRNA)、成骨基因mRNA(Osteocalcin mRNA)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。通过凝胶成像扫描系统做半定量分析,以PPARγmRNA和Osteocalcin mRNA与β-actin的吸光度比值表示上述产物mRNA的相对含量。结果对A组和B组通过凝胶成像扫描系统作PCR产物半定量分析,显示B组细胞中的Osteocalcin mRNA表达降低,而A组细胞中的表达增加。而且B组中的PPARγmRNA表达升高,A组降低。两者之间的差异均有统计学意义。结论地塞米松可以从分子水平调控骨髓基质干细胞的的分化。地塞米松浓度为1×10-7mol/L时,诱导骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化,同时减少、抑制其向成骨细胞分化,这可能是激素骨坏死发生的机制之一。诱导体外培养的骨髓基质干细胞分化为成骨细胞,地塞米松浓度为1×10-8mol/L是比较适宜的。     

辛伐他汀对老年大鼠骨髓基质干细胞成骨和成脂分化的影响

目的 从细胞和基因水平探讨辛伐他汀对老年大鼠骨髓基质干细胞成骨和成脂分化的影响.方法 18月龄雄性SD大鼠的骨髓基质干细胞进行成骨和成脂诱导培养,培养介质中加入辛伐他汀(10-6、10-7、10-8 mol/L和10-9 mol/L),同时设溶剂对照组.成骨检测:碱性磷酸酶(ALP)染色和定量,茜素红矿化染色和定量,ALP和骨钙素(OC)基因分析;成脂检测:油红脂肪细胞染色和定量,脂蛋白脂酶(LPL)和过氧化物酶增殖活化受体(PPARγ2) 基因分析.结果 在含有低剂量地塞米松的成骨诱导条件下,辛伐他汀随浓度增加促进了细胞基质的矿化,增强了ALP的活性及染色,提高了ALP和OC的基因表达(若无地塞米松,辛伐他汀则无法单独诱导成骨,此结果 未展示);同时,辛伐他汀随浓度增加减弱了脂肪细胞的油红染色,抑制了LPL 和PPARγ2的基因表达.显著性差异皆发生于10-6 mol/L和10-7 mol/L辛伐他汀组.结论 辛伐他汀随浓度增加抑制了老年骨髓基质干细胞的成脂分化,并中等强度地促进了老年骨髓基质干细胞的成骨分化.这表明辛伐他汀具有促进骨合成代谢的作用,可以用于治疗常见的骨代谢疾病,如增龄性的骨质疏松症.     

吡格列酮对肥胖小鼠骨髓间充质干细胞分化的影响

目的通过建立饮食诱导的高脂小鼠的模型,观察过氧化物酶体增生物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)激动剂吡格列酮对肥胖小鼠的骨量变化的影响以及骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)分化的情况,探讨PPARγ与MSCs分化之间的关系及可能的作用机制。方法建立饮食诱导的肥胖鼠模型,吡格列酮(10mg·kg-1.d-1)对肥胖小鼠进行灌胃,一个月后检测肥胖小鼠及灌胃组肥胖小鼠的葡萄糖耐量,骨密度及骨组织形态学,并取小鼠原代MSC进行培养,提取其RNA,利用实时定量PCR,检测在MSCs分化过程中成骨及成脂特异性基因的表达量。结果吡格列酮灌胃的肥胖小鼠胰岛素抵抗改善的同时,骨密度虽无明显改变,但骨组织形态学中成骨细胞周长百分率明显增加,原代MSCs的成骨分化基因的表达量明显增加而成脂基因明显下降。结论PPARγ改善胰岛素抵抗的同时,促使MSCs向成骨细胞分化的能力增强,向脂肪细胞分化的能力下降,PPARγ除直接参与调节MSCs的分化外,还可能通过间接作用在MSCs的分化过程中起重要作用。     

骨髓基质干细胞成脂分化的调控及其对骨质疏松的影响

研究发现随着年龄的增长和绝经期后骨质疏松,骨髓腔内的脂肪细胞逐渐增多,取代了成骨细胞,因此抑制骨髓基质干细胞成脂分化是目前治疗骨质疏松的新途径。应用各种成脂诱导剂建立体外定向诱导骨髓基质干细胞成脂分化模型是研究新途径的基础。除了通过光学显微镜观察成脂分化的能力,还可运用分子生物学的方法定性、定量检测成脂分化的程度。过氧化物酶增殖子激活受体(PPARγ)是脂肪细胞的分化过程中起关键性作用的调节因子,组蛋白去乙酰化酶(SIRT1)被激活后能抑制PPARγ的表达,减少脂肪细胞的生成,起到预防和治疗骨质疏松的作用。笔者就以上方面和对减少骨髓脂肪分化的策略作了综述。     

5-氮杂胞苷和地塞米松对大鼠骨髓间充质干细胞分化作用的实验研究

[目的]探究5-氮杂胞苷和地塞米松对大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化能力的影响。[方法]SD大鼠骨髓间充质干细胞体外扩增和传代培养,流式细胞术鉴定细胞表面标志,取3代细胞随机分为空白组、激素组、激素+5-氮杂胞苷组,相应药物干预3 d后成骨诱导分化14 d,RT-PCR和Western blot检测Runx2和PPARγ的表达。[结果]所取得骨髓间充质干细胞纯度和均一性好,细胞表面标记CD90高表达,CD34、CD45低表达。第3代细胞经药物干预和成骨诱导后,与空白组相比,激素组Runx2基因表达降低,PPARγ基因升高,5-氮杂胞苷+激素组结果与激素组相反(P<0.05)。[结论]激素能抑制骨髓间充质干细胞成骨分化,促进成脂分化,5-氮杂胞苷能干预激素的这种作用,提高骨髓间充质干细胞分化潜能。     

联合转染人VEGF165和ANG-1双基因对大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

[目的]研究联合转染入血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管紧张素-1(ANG-1)双基因对大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化潜能的影响.[方法]将本室构建的编码人VEGF165和ANG-1双基因腺病毒质粒pAd-VIA在QBI-293A细胞内进行包装和扩增,获得腺病毒载体pAd-VIA,将其体外转染大鼠BMSCs,应用诱导培养液定向诱导向成骨细胞分化.实验分为4组:A.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs并诱导组;B.BMSCs诱导组;C.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs组;D.单纯BMSCs组.通过碱性磷酸酶(ALP)染色和活性的测定、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色来评价联合转染双基因对BMSCs成骨分化潜能的影响.[结果]重组腺病毒质粒pAdVIA在QBI-293A细胞内成功包装和扩增,有大量的绿色荧光蛋白表达,体外转染大鼠BMSCs后,A、B组的ALP染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色为阳性,而C组和D组为阴性.ALP活性表达具有时间相关性,3 d开始表达,7 d到达高峰,在7、14 d,A、B组与C、D组之间ALP表达均具有统计学差异(P＜0.01),A组和B组之间,在各个时间点均无统计学差异(P＞0.05).[结论]腺病毒载体pAd-VIA转染大鼠BMSCs后,未明显影响其体外成骨分化潜能.     

酒精对人骨髓间充质干细胞成脂与成骨分化的影响初步报告

目的观察酒精对人骨髓间充质干细胞中成脂转录因子PPARγmRNA和成骨基因osteocalcin(骨钙素)mRNA表达的影响。方法取人骨髓分离培养间充质干细胞,经传代后以0.09mol/L的酒精浓度作为诱导剂处理细胞,应用Rt-PCR技术检测实验组和对照组细胞中PPARγmRNA和骨钙素的表达。结果对实验组和对照组通过凝胶成像扫描系统作PCR产物半定量分析,显示实验组细胞中的osteocalcin(骨钙素)mRNA表达降低,而对照组细胞中的表达增加。而且实验组中的PPARγmRNA表达增加,对照组降低,两者之间的差异均有统计学意义。结论酒精能诱导人骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化,而减少骨髓间充质干细胞向成骨分化,这可能与酒精性坏死的发生机制有关。     

RNA干扰Axin2对大鼠骨髓基质干细胞的成骨分化及Wnt信号途径相关因子mRNA表达的影响

我们利用已建立的大鼠BMSCs体外培养模型,在诱导其成骨分化同时对Axin2进行RNA干扰(RNAi),从而探讨Axin2基因沉默对骨髓基质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化过程以及Wnt信号途径的影响.     

壮筋养血汤介导MAPK/P38-ERK通路调控成骨成脂分化的作用机制

目的 探讨壮筋养血汤（Zhuangjin Yangxue Decoction,ZJYXD）通过LncRNA ANRIL介导的MAPK/ P38-ERK 通路调控成骨成脂分化的作用机制。方法 提取骨髓间充质干细胞（BMSCs）,并采用ANRIL慢病毒转染BMSCs;制备ZJYXD含药血清用于培养转染后的BMSCs。通过CCK-8检测BMSCs增殖活力;运用碱性磷酸酶、茜素红及油红O染色检测各组细胞成骨成脂分化情况;通过qRT-PCR、Western Blot法检测成骨、成脂、MAPK/ P38-ERK信号通路相关基因及蛋白的表达。选取24只SPF级C57BL/6雄性小鼠用于制作股骨横断骨折模型,造模后给予不同转染的BMSCs治疗并给予ZJYXD。通过X-ray与Micro-CT检测对照组、对照组+ZJYXD组、ANRIL过表达组、ANRIL过表达+ZJYXD组小鼠骨愈合情况。结果 与0 %含药血清相比,6 % ZJYXD含药血清对BMSCs细胞增殖能力最强（P<0.01）。ZJYXD干预后成骨染色加深,成骨相关基因OPN、RUNX2 mRNA及蛋白表达显著升高（P<0.01）;成脂染色减弱,相关基因PPARγ、C/EBPα mRNA及蛋白表达显著降低（P<0.01）。同时ZJYXD促进了P-ERK、P38蛋白表达（P<0.01）。X-ray及Micro-CT显示ZJYXD促进了小鼠骨折后愈合。当ANRIL过表达后,ZJYXD调节成骨成脂细胞分化作用消失,无法有效的促进骨折愈合。结论 壮筋养血汤具有促进成骨分化、抑制成脂分化的作用,而这种作用通过LncRNA ANRIL调控MAPK/ P38-ERK信号通路实现。     

核心结合因子α1过表达促进脂肪组织来源干细胞向成骨细胞分化

目的 检测核心结合因子α1(Cbfα1)的特异性成骨作用以及脂肪组织来源干细胞的成骨分化潜能.方法 采用Cbfα1重组的腺病毒载体感染脂肪来源干细胞,通过间接免疫荧光的方法检测脂肪来源干细胞中Cbfα1的表达.Cbfα1转染脂肪组织来源干细胞后1、3、7 d利用RT-PCR检测成骨特异性基因和成脂特异性基因的表达变化.同时通过检测Cbfα1转染后7、10 d脂肪来源干细胞碱性磷酸酶活性的变化,观察Cbfα1过表达后诱导脂肪组织来源干细胞向成骨细胞分化.结果 转染后脂肪组织来源干细胞细胞数目增长一倍.在特定诱导条件下,可向成脂细胞、成骨细胞分化.Cbfα1重组的腺病毒载体对脂肪组织来源干细胞的转染效率为82.4%.转染后第1、3、7天脂肪组织来源干细胞中骨钙素、骨桥素、Ⅰ型胶原的表达增强;脂蛋白脂酶的表达逐渐下降.转染Cbfα1后,脂肪组织来源干细胞中碱性磷酸酶活性显著增加.结论 核心结合因子过表达促进脂肪组织来源干细胞向成骨细胞分化、抑制成脂分化.     

pcDNA_(3.1)-OGP基因转染兔骨髓基质干细胞的表达及生物学效应的观察

[目的]观察成骨生长肽(osteogenic growth peptid,OGP)基因转染兔骨髓基质干细胞后的表达及表达产物对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响.[方法]构建重组真核表达载体pcDNA_(3.1)-OGP,并在脂质体介导下,将其导入兔骨髓基质干细胞.通过G418筛选获得阳性克隆.用RT-PCR方法榆测OGP基因在骨髓基质干细胞内的表达.Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶的检测观察转染pcDNA_(3.1)-OGP后骨髓基质干细胞向成骨细胞分化情况.[结果]成功构建真核表达载体pcDNA_(3.1)-OGP,用RT-PCR方法及碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原检测证实OGP基因能在骨髓基质干细胞中表达并促进其向成骨细胞分化.[结论]经pcDNA_(3.1)-OGP转染的兔骨髓基质干细胞不仅可以表达OGP,而且具有向成骨细胞系分化的特性.     

敲减SOX9基因对骨髓间充质干细胞表达的影响

目的:构建小鼠S0X9基因干扰的慢病毒载体,体外转染小鼠骨髓间充质干细胞,观察小鼠SOX9基因在小鼠间充质干细胞中的表达影响。方法:针对小鼠SOX9基因序列,设计RNA干扰靶点序列,合成含干扰序列的双链DNAoligo连入酶切后的RNA干扰载体上,构建Lenti-SOX9-siRNA-EGFP载体,鉴定扩增。利用SOX9基因沉默载体体外转染小鼠骨髓间充质细胞,利用倒置荧光显微镜观察转染是否成功,并通过流式细胞仪测定转染效率。同时利用RT-PCR和Western Blot检测小鼠SOX9基因的表达。结果:成功构建了Lenti-SOX9-siRNA-EGFP,SOX9基因沉默慢病毒载体,能高效转染小鼠骨髓间充质细胞。RT-PCR和Western Blot检测显示经SOX9基因转染的小鼠骨髓间充质细胞基因表达沉默。结论:利用慢病毒结合RNA干扰技术敲减小鼠SOX9基因成功地转染小鼠骨髓间充质干细胞,且SOX9基因在小鼠骨髓间充质干细胞中发生了沉默,这为SOX9修复软骨损伤的进一步研究奠定了基础。     

静水压力刺激对人骨髓间充质干细胞成骨、成脂双向分化的影响

目的 研究短期和较长期的静水压力负荷对人骨髓间充质干细胞(BMSC)成骨或成脂的影响,并探讨细胞外信号调节激酶(ERK)1/2信号通路在其中作用.方法 对BMSC施加40或80 kPa的静水压强,分别持续1 h或4 h,然后加入10 mmol/L U0126阻断ERK1/2信号通路,通过半定量RTPCR和实时定量PCR方法检测成骨标志基因Cbfa1和骨钙素(OC)以及成脂标志性基因PPARγ2和Adipsin的mRNA表达水平.对BMSC施加40 kPa的静水压刺激,每天作用4 h,7 d和14 d后检测Cbfa1、OC、PPARγ2和Adipsin的mRNA表达水平,在3、7、14 d通过组织化学染色和定量测定方法检测碱性磷酸酶的活性和表达量.结果 40 kPa压强的静水压连续刺激4 h可以促进Cbfa1、OC的mRNA表达和抑制PPARγ2、Adipsin的mRNA表达.40 kPa的静水压连续作用7 d,仍表现为对BMSC的促成骨分化作用,然而连续作用14 d后,则表现为促成脂分化作用.成骨诱导条件并不协同静水压的促BMSC成骨分化作用.而U0126并不能完全抑制BMSC对静水压刺激的反应.结论 一定强度和作用时间的静水压刺激可以促进BMSC的成骨分化,但较长期的作用可能会促进成脂分化.成骨诱导培养条件与静水压的促BMSC成骨分化作用无协同作用.     

成骨细胞特异性钙黏蛋白基因转染对人骨髓基质干细胞成骨分化影响的研究

目的 观测成骨细胞特异性钙黏蛋白(Cad-Ⅱ)基因转染对人骨髓基质干细胞(hBMSCs)成骨分化的影响. 方法把脂质体介导的Cad-Ⅱ cDNA转染体外分离培养的hBMSCs,检测Cad-Ⅱ蛋白表达变化,并对比观测转染组和单纯成骨诱导组在培养3,7、14、21 d时,hBMSCs碱性磷酸酶(ALP)和骨钙索的表达变化. 结果 转染组和成骨诱导组3 d后开始有ALP的阳性染色,呈棕黑色,7 d开始有骨钙索的阳性染色并随培养时间延长逐渐增多,但各时间点转染组ALP浓度(P=0.008)和骨钙素染色阳性数(P=0.023)均显著高于单纯成骨诱导组.转染组和成骨诱导组从14 d后开始有红色的刚件染色矿化结节出现,结节数目随时间推移而增多. 结论 Cad-Ⅱ基因转染可促进hBMSCs向成骨细胞的分化.     

淫羊藿在MSCs成脂分化过程中对PPARγ基因表达影响的实验研究进展

骨髓基质干细胞具有多向分化的能力,研究发现其成脂分化与骨质疏松症存在着不可忽视的关系.PPAR γ是脂肪分化的主要调控因子,已有研究发现其对MSCs分化方向起关键性调控作用.淫羊藿对MSCs成骨分化具有促进作用,但其在MSCs成脂分化过程中对PPAR γ基因表达影响目前尚无研究报道.     

siRNA慢病毒载体介导DKK-1基因沉默对骨髓间充质干细胞分化影响的实验研究

背景:激素性股骨头坏死(SONFH)发病机制尚不完全明确,可能与骨髓间充质干细胞(BMSC)的异常分化密切相关。目的:研究si RNA慢病毒载体介导的DKK-1基因沉默,通过调控Wnt/β-catenin信号通路对超生理剂量糖皮质激素作用下大鼠BMSC分化的影响,探索治疗SONFH的新途径。方法:提取、培养SD大鼠BMSC,并构建DKK-1基因慢病毒干扰载体。大鼠第3代BMSC分4组:对照组(A组)、激素组(B组)、激素+无序序列慢病毒载体组(C组)、激素+DKK-1基因慢病毒干扰载体组(D组)。A组用基础培养基培养,B组加入浓度为1×10^(-6)mol/L的地塞米松,C、D组除加入地塞米松外,各自加入相应的慢病毒载体转染BMSC。14 d后提取各组细胞RNA及蛋白,对DKK-1、成脂相关基因PPAR-γ2和成骨相关基因RUNX2进行Real-time PCR及Western-blot检测,并对各组进行油红O、茜素红染色,观察各组BMSC分化情况,对结果进行统计学分析。结果:Real-time PCR及Western-blot检测结果示B、C组与A、D组相比,成骨相关基因RUNX2的表达明显较低(P<0.05),而DKK-1及成脂相关基因PPAR-γ2的表达明显较高(P<0.05)。油红O染色结果显示B、C组呈阳性,A、D组呈阴性;茜素红染色结果显示A、D组呈阳性,B、C组呈阴性。结论:DKK-1基因沉默通过特异性抑制DKK-1过表达而重新激活Wnt/β-catenin信号通路,减少成脂基因PPAR-γ2的表达、增加成骨基因RUNX2的表达,抑制BMSC成脂分化,促进BMSC成骨分化。     

DKK1在大鼠骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化早期的差异性表达

目的：分析DKK1在大鼠骨髓间充质干细胞成脂、成骨分化早期的表达,探讨其调节机制。方法 Real－time PCR检测骨髓间充质干细胞在成脂、成骨诱导培养早期DKK1基因表达的水平;检测激素处理骨髓间充质干细胞DKK1基因的表达水平。结果成脂组与正常对照组,在成脂诱导6、12、24、48时DKK1基因表达水平较对照组增高,差异有统计学意义, P＜0．01。成骨组与正常对照组,0．5、6两个时间点DKK1基因表达量较对照组明显降低,差异有统计学意义,P＜0．05。骨髓间充质干细胞激素处理3、6、12、24时检测,结果显示激素作用下,骨髓间充质干细胞DKK1表达明显增加,差异有统计学意义,P＜0．05。结论 DKK1在骨髓间充质干细胞成脂、成骨分化早期可能起重要的调节作用,激素可能通过调节DKK1的表达而发挥调节成脂、成骨分化的作用。     

大鼠骨髓基质细胞体外成脂、成骨分化的研究

目的　观察体外定向诱导大鼠骨髓基质细胞分化为脂肪细胞和成骨细胞。方法　全骨髓法分离大鼠骨髓基质细胞 ,传 3代后分别在成脂、成骨诱导条件下继续培养 ,油红O染色、碱性磷酸酶染色和VonKossa染色判定其分化结果。结果　传 3代大鼠骨髓基质细胞成脂诱导 2 1d后 ,分化为脂肪细胞的阳性率为 (83. 6± 2 . 8) % ,成骨诱导 12d后碱性磷酸酶染色阳性率达 (87. 6± 2. 8) % ,连续诱导35d可见矿化结节形成。结论　随着诱导条件的不同 ,大鼠骨髓基质细胞在体外可定向分化为脂肪细胞或成骨细胞。     

骨形态发生蛋白-7的过表达载体对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的 探讨骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的过表达载体对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响.方法 取10例健康志愿者的骨髓组织,培养原代BMSCs.采用流式细胞仪检测BMSCs的表面蛋白,对BM-SCs进行鉴定.利用基因编辑技术,构建BMP-7的过表达载体,通过慢病毒转染BMSCs,将BMSCs分成转染组和未...