张应力加载下PLGA-胶原类细胞外基质三维支架复合培养大鼠成肌细胞“整合素β1”的表达

目的:利用PLGA(poly lactide-co-glycolide)-胶原类细胞外基质复合支架构建大鼠成肌细胞体外三维力学加载模型并研究周期性机械张应力对不同方式培养的大鼠成肌细胞"整合素β1"基因表达的影响。方法:静电纺丝法制备PLGA-胶原类细胞外基质复合生物支架并将其粘接于加力板上,与体外培养的大鼠成肌细胞进行复合培养;使用"Forcel"四点弯曲细胞应变加载装置分别对三维培养和二维培养的大鼠成肌细胞进行生理限度内的力学加载;利用RT-PCR技术检测不同时间点细胞整合素β1 mRNA的表达;比较张应力作用下,三维PLGA-胶原复合支架上和二维平面培养细胞整合素β1基因表达水平的差异。结果:除加载15min外,相同强度张应力作用的各个时间点,三维支架上细胞整合素β1的表达均明显高于二维平层培养细胞;且三维支架上细胞整合素β1的表达水平更快达到峰值,而且峰值持续时间也显著增加。结论:周期性张应力刺激下,三维复合培养大鼠成肌细胞整合素β1mRNA表达水平明显高于二维培养细胞,这表明培养方式及细胞外基质的三维空间结构对加载早期细胞的力学信号转导有着十分重要的作用。     

机械张应力对PLGA-胶原复合支架上大鼠成肌细胞桩蛋白表达变化的影响

目的：研究不同时间、不同强度的张应力对三维支架复合培养的大鼠成肌细胞桩蛋白paxillin表达的影响,探讨机械张应力刺激作用下复合培养成肌细胞早期力学信号转导机制。方法：首先,利用电纺法制备PLGA（polylactide-co-glycolide）-胶原复合生物支架,并与大鼠成肌细胞复合培养;然后,应用四点弯曲细胞力学加载装置对其进行力学加载,收集细胞,采用免疫印迹（Western Bloting）法,研究周期性单轴机械张应力刺激下PLGA-胶原复合支架上大鼠成肌细胞磷酸化桩蛋白p-paxillin（Tyr 118）/paxillin的表达变化。结果：无论1000μstrain或2000μstrain的张应力刺激,均可诱导paxillin的磷酸化过程,且随加载时间延长,磷酸化程度上调;2000μst rai n的张应力较1000μstrain激活paxillin磷酸化过程的效应更明显、迅速。结论：①周期性单轴牵张应变可以在加载早期通过Tyr118位点的磷酸化而激活桩蛋白paxillin;②周期性牵张应变对复合培养成肌细胞paxillin蛋白表达的影响,与应力刺激的力值有关。     

动态力学加载下MC3T3-E1细胞在3D打印三维仿生复合支架上的成骨效应研究

目的观察动态力学加载对低温3D打印联合冷冻干燥法制备的三维仿生复合支架材料内MC3T3-E1细胞增殖、分化、成骨特异性基因表达的影响。方法将丝素蛋白、Ⅰ型胶原、羟基磷灰石按质量比3∶9∶2混合后,采用低温3D打印联合冷冻干燥技术制备三维仿生复合支架;大体观察支架外形,Micro-CT观察支架孔径及孔隙率,测定吸水膨胀率以及应力、应变、弹性模量。取MC3T3-E1细胞接种至三维仿生复合支架,随机分成两组:实验组培养期间行动态力学加载,每天1次、每次15 min、频率1 Hz、应变3 500με;对照组不作力学加载。培养7、14 d,分别对细胞-支架复合物行HE染色及扫描电镜观察细胞在支架上生长情况;Western blot以及实时荧光定量PCR检测Ⅰ型胶原、BMP-2、骨钙素(osteocalcin,OCN)蛋白及m RNA表达。结果制备的三维仿生复合支架为白色立方体网格,Micro-CT检测见支架材料内部呈孔隙网状结构,孔隙连通性良好;大孔径直径为(506.37±18.63)μm,微孔径直径为(62.14±17.35)μm,孔隙率为97.70%±1.37%,吸水膨胀率为1 341.97%±64.41%。力学测试示,支架压缩至10%时,支架压缩位移为(0.376±0.004)mm、压缩应力为(0.016±0.002)MPa、弹性模量为(162.418±18.754)k Pa。复合培养7、14 d,两组HE染色及扫描电镜均见细胞在支架内部生长,主要分布在支架孔壁周围,其中实验组细胞较对照组增多,且细胞由梭形变为扁平状。除200倍镜下14 d时两组细胞计数差异无统计学意义(t=–2.024,P=0.080)外,其余不同放大倍数(40、100、400倍)下各时间点实验组细胞数均显著高于对照组(P0.05)。实时荧光定量PCR检测示:实验组培养7、14 d时Ⅰ型胶原、OCN m RNA相对表达量显著高于对照组(P0.05),但BMP-2 m RNA相对表达量与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。Western blot检测示,实验组培养7、14 d时Ⅰ型胶原、BMP-2、OCN蛋白相对表达量均显著高于对照组(P0.05)。结论动态力学加载后,接种于三维仿生复合支架的MC3T3-E1细胞BMP-2、Ⅰ型胶原、OCN表达明显上调,表明适当力学载荷有利于MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化。     

转化生长因子β1缓释载体诱导骨髓基质干细胞成软骨分化

目的探讨转化生长因子β1（TGF—β1）缓释对骨髓基质干细胞诱导成软骨分化的影响。方法乳化交联法制备TGF—β1壳聚糖缓释微球并将其与壳聚糖支架复合，将骨髓基质干细胞置于复合载体中立体培养，通过HE染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、扫描电镜观察复合载体对细胞的增殖、分化及功能的影响。结果骨髓基质干细胞于复合载体中培养，细胞形态类似软骨细胞，并可见细胞增殖及细胞外基质分泌，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示基质中有Ⅱ型胶原表达，其细胞增殖率及Ⅱ型胶原分泌功能均较对照组明显增强。结论复合载体能够控制TGF-β1的释放并保持其活性，可促进骨髓基质干细胞的增殖并诱导其向软骨细胞分化。     

载基因仿生基质材料调控骨髓基质干细胞成骨定向分化

目的 探讨载基因仿生基质材料能否调控骨髓基质于细胞（BMSCs）向成骨细胞定向分化。方法 将非病毒载体K16GRGDSPC共价接枝于新型骨基质材料聚丙交酯／乙交酯／天冬氨酸／聚乙二醇（PICA-[ASP-PEG]）构建非病毒基因转染体系。该体系与转化生长因子（TGF）-β1基因复合制备成载基因仿生基质材料pcDNA3-TGF-β1／K16GRGDSPc／PLGA-[ASP-PEG]，并将兔BMSCs与其复合培养，以pcDNA3／K16GRGDSPC／PLGA-[ASP-PEG]作为对照。通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测TGF-β1基因的表达；应用碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测BMSCs的ALP活性，并通过RT-FCR检测细胞ALP、骨钙素（OCN）、骨桥蛋白（GPN）和Ⅰ型胶原的表达，通过免疫荧光染色检测核心结合因子a1（Cbfal）表达，观察BMSCs向成骨细胞方向分化的情况。结果 XFS图谱证实K16GRGDSPC被成功地接枝到PLGA-[ASP—PEG]表面。载基因仿生基质材料复合BMSCs培养结果表明，TGF-β1基因被成功地导入细胞内并表达，而且其成骨标志物（ALP、OCN、CPN、Ⅰ型胶原和Cfbal）的表达均显著高于对照组（P〈0．05）。结论 这种载基因基质材料既可以作为骨组织工程支架材料，又可介导外源TGF—β1基因转染BMSCs并定向调控BMSCs成骨分化。     

人体不同部位正常皮肤成纤维细胞对机械张力反应的研究

目的探讨人体不同部位正常皮肤成纤维细胞对机械张力反应的差异。方法取色素痣切除患者自愿捐赠的背部和上臂内侧正常皮肤,应用组织块法体外培养成纤维细胞,取第5~8代细胞进行实验。将背部和上臂内侧正常成纤维细胞分别设实验组和对照组,实验组细胞采用多通道细胞应力加载仪加载周期性机械张力24、36、48 h;对照组细胞正常培养。各时间点加载结束后,倒置显微镜下观察细胞形态变化;CCK-8法检测细胞增殖活性;RT-PCR法检测细胞内整合素β1、P130Ca s(p130Crk-associated substance)、TGF-β1、Ⅰ型胶原a1链(collagen type Iα1 chain,COL1A1)m RNA水平;ELISA法检测Ⅰ型胶原和TGF-β1含量。对照组于培养对应时间取细胞进行以上观察。结果实验组加载后细胞均增殖旺盛,分布密集,排列呈一定方向性。加载24 h后,实验组背部及上臂内侧细胞增殖,整合素β1、P130Cas、TGF-β1 m RNA表达水平和TGF-β1含量比较,差异均无统计学意义(P0.05);加载36、48 h时,背部细胞以上检测指标均显著高于上臂内侧细胞,差异有统计学意义(P0.05)。实验组各时间点背部及上臂内侧细胞的COL1A1 m RNA表达水平和Ⅰ型胶原含量比较,差异均无统计学意义(P0.05)。对照组各时间点背部及上臂内侧细胞以上指标比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结论背部和上臂内侧皮肤成纤维细胞对机械张力的反应不同,提示人体皮肤成纤维细胞的力学特征存在部位差异,可能导致不同部位增生性瘢痕的发生率不同。     

脂肪干细胞/Ⅰ型胶原凝胶/聚乳酸聚乙醇酸-β-磷酸三钙骨组织工程复合体的构建及其异位成骨研究

目的 构建基于脂肪干细胞、Ⅰ型胶原凝胶以及聚乳酸聚乙醇酸-β-磷酸三钙支架(PLGA-β-TCP)的骨组织工程复合体并对其异位成骨进行研究.方法 设计构建脂肪干细胞-Ⅰ型胶原凝胶/PLGA-β-TCP复合体(A组),同时设立单纯细胞/PLGA-β-TCP材料复合体(B组)、单纯Ⅰ型胶原凝胶/PLGA-β-TCP复合体(C组)以及单纯PLGA-β-TCP支架材料(D组)作为对照.扫描电镜、相差显微镜观察细胞材料复合情况并对脂肪干细胞增殖以及成骨分化进行分析.体外成骨诱导培养2周后移植于自体股部肌袋,8周后取出,依次行放射学、组织学定性及半定量分析.结果 (1)体外成骨诱导2周,A组细胞增殖率慢于B组(P<0.05,n=4),但其细胞总数远高于后者(P<0.01,n=4).A组碱性磷酸酶(ALPase)活性、细胞外基质矿化程度均显著高于B组(P<0.01,n=4).A组细胞悬浮于Ⅰ型胶原凝胶并均匀分布于材料孔隙中而B组细胞仅见黏附于材料表面.(2)移植8周,X线片示A组高密度钙化影形成,B、C、D组未见有阳性结果.A组材料孔隙中均匀充满新生骨组织,可观察到骨小梁样结构.B组仅在少数孔隙中有类骨组织形成,同时伴有结缔组织长入.A组新生骨面积百分比显著高于B组(P<0.01,n=4).结论 通过应用Ⅰ型胶原凝胶来实现脂肪干细胞与PLGA-β-TCP多孔支架材料的均匀复合,能够有效促进脂肪干细胞在材料孔隙中的成骨分化及均质骨组织形成.     

兔骨髓间充质干细胞在壳聚糖支架上的诱导培养

目的观察存壳聚糖(Chitosan)三维支架上诱导兔骨髓间充质干细胞(rMSCs)向髓核样细胞分化的情况,探讨应用其制作组织工程髓核的可能性.方法将体外培养的第3代rMSCs接种于经冷冻干燥法构建的壳聚糖三维支架上,在主要含有转化生长因子β1(TGF-β1)、胰岛素 转铁蛋白 亚硒酸钠(ITS)、地塞米松、丙酮酸钠的培养液中培养(实验组),同时设立对照组(非诱导组).在培养7d、14d、21d时取标本行组织学检测,观察三维支架上rMSCs的生长及分化情况,对支架细胞复合物行Ⅱ型胶原免疫组化检测,测定培养液中糖胺聚糖(GAG)含量及Ⅱ型胶原的表达量,计算细胞外基质GAG含量.结果rMSCs在壳聚糖三维支架上生长状态良好,体外培养7d、14d、21d时,实验组培养液中细胞外基质GAG含量分别为55.8±4.6、86.7±5.8、83.2±3.41μg/cm2,对照组培养液中细胞外基质GAG含量分别为34.2±5.6、42.6±4.8、40.8±4.4μg/cm2,两组间相同时间点比较有显著性差异(P＜0.05);Ⅱ型胶原蚩白电泳及Western-blot检测实验组在培养14d与21d时可见到Ⅱ型胶原电泳条带,21d时Ⅱ型胶原蛋白含量多于14d时;对照组未见Ⅱ型胶原表达.结论rMSCs在壳聚糖三维支架上培养生长良好,在特定的诱导培养液诱导下可以向髓核样细胞分化.     

转化生长因子β1诱导永生化人前软骨干细胞向髓核样细胞分化的实验研究

  目的 研究转化生长因子β1 (TGF-β1) 诱导永生化人前软骨干细胞 (IPSCs) 向髓核样细胞分化的可行性。方法 将体外培养的IPSCs 接种于温敏型壳聚糖水凝胶 (C/GP) 三维支架上,加入含TGF-β1的诱导培养基,低氧条件下进行诱导培养,观察三维支架上IPSCs的生长及分化情况。7 d后行Alcian Blue染色,分析细胞外基质糖胺聚糖（GAG）合成情况,并收集细胞,提取RNA。RT-PCR检测诱导前后髓核样细胞标志基因Ⅱ型胶原（Collagen Ⅱ）和蛋白聚糖（Aggrecan）的表达情况,Western Blot 检测诱导前后细胞内β-catenin蛋白表达水平的变化。结果 IPSCs在三维支架上生长状态良好,诱导7 d 后,Alcian Blue染色表明,细胞外基质GAG的合成明显增多,实验组（诱导培养基）明显多于对照组（普通培养基）。RT-PCR证实Ⅱ型胶原和Aggrecan的基因表达水平明显增高,实验组明显高于对照组;Western Blot证实细胞内β-catenin蛋白表达水平明显上调,实验组明显高于对照组。结论 IPSCs经TGF-β1诱导可在体外定向分化为髓核样细胞,诱导分化后的细胞具有良好的分泌功能,能够有效地分泌细胞外基质成分。TGF-β1可能通过上调细胞内β-catenin的表达诱导IPSCs向髓核样细胞分化。     

Ⅰ型胶原凝胶包埋脂肪干细胞复合PLGA-β-TCP支架修复兔自体桡骨缺损

目的 采用Ⅰ型胶原凝胶悬浮包埋兔脂肪干细胞并复合PLGA-β-TCP支架修复自体桡骨缺损。方法 使用Ⅰ型胶原凝胶悬浮兔脂肪干细胞并与PLGA-β-TCP复合构建脂肪干细胞-Ⅰ型胶原凝胶/PLGA-β-TCP复合体(ASCs-COL/PLGA-β-TCP)(A组),同时设立单纯细胞/PLGA-β-TCP材料复合体(ASCs/PLGA-β-TCP)(B组)、单纯Ⅰ型胶原凝胶/PLGA-β-TCP复合体(COL/PLGA-β-TCP)(C组)、单纯PLGA-β-TCP支架材料(D组)以及空白缺损(E组)作为对照,体外成骨诱导培养2周后植入桡骨1.5cm缺损部位。30只兔(60侧)采用两因素随机区组设计每只兔两侧骨缺损植入组别。分别于术后8、16、24周处死兔,取材,进行相关分析。结果 术后8周,大体观察、放射学、组织学检测示A组桡骨断端连续性基本恢复。术后16周,A组骨断端连续性完全恢复,髓腔未通。术后24周,A组髓腔再通,改建塑形趋于完成,材料基本降解。自术后16～24周,A组残存材料比例低于其他3组(P＜0.05,n=4);与A组比较,在整个观察周期内,B、C、D组均无明显成骨现象,E组保持骨缺损状态(P ＜0.05,n=4)。结论 通过应用Ⅰ型胶原凝胶悬浮包埋脂肪干细胞进而与PLGA-3-TCP多孔支架材料复合构建新型仿生骨组织工程复合体,可修复兔桡骨1.5 cm缺损。     

Ⅰ型胶原在PLGA-[ASP-PEG]表面修饰对兔骨髓基质干细胞生物力学的影响

目的探讨Ⅰ型胶原修饰聚乳酸-羟基乙酸/天冬氨酸-聚乙醇(PLGA-[ASP-PEG])支架材料对骨髓基质干细胞(BMSCs)在其表面粘附、增殖及成骨分化的影响。方法采用化学方法将Ⅰ型胶原接枝到PLGA-[ASP-PEG]表面,同时在材料表面物理涂层胶原溶液。将改性PLGA-[ASP-PEG]复合兔BMSCs培养,检测BMSCs粘附、增殖性能的变化及成骨标志物碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、核心结合因子al等的表达情况。结果X射线光电子能谱法证实Ⅰ型胶原成功接枝到PLGA-[ASP-PEG]表面。经化学接枝-物理涂层技术改性后PLGA-[ASP-PEG]膜表面的Ⅰ型胶原含量大大提高,明显高于经单纯化学接枝或单纯物理涂层技术改性后膜表面的胶原含量,且远高于二者之和。改性PLGA-[ASP-PEG]表面BMSCs的粘附、增殖能力显著提高,其成骨标志物的表达均显著高于对照组,差异有显著性意义(P＜0．05)。结论Ⅰ型胶原能显著改善PLGA-[ASP-PEG]的细胞生物相容性,为组织工程支架材料的优化提供了一种新途径。     

梯度降解软骨支架材料应力刺激下与骨髓基质干细胞复合三维培养的实验研究

[目的]探讨梯度降解软骨支架材料（GDABM）的细胞生物相容性及诱导后的骨髓基质干细胞（MSCs）在三维支架上培养的生物学行为.[方法]将MSCs与复合转化生长因子-β（TGF-β）的胶原共同混合后培养于三维软骨支架材料上,离心管内培养,10次/d,以600 r/min离心10 min.8 h、24 h、72 h、4 d、7 d进行倒置显微镜形态学观察、扫描电镜观察.1～8 d采用MTT法检测细胞增殖活性,描绘生长曲线.通过3H-Proline掺入实验了解材料对MSCs胶原合成的影响.[结果]8 h后MSCs在支架材料上呈球型黏附生长,4 d后MSCs在支架材料上呈菱形或多角型复层生长,包裹于大量细胞外基质内.GDABM组细胞第3 d进入对数增长期,倍增时间为4.75 d,而单纯软骨细胞培养对照组倍增时间为5.25 d.GDABM组与单纯软骨细胞培养对照组比较胶原合成略低,3H-Proline掺入值有显著性差异（P＜0.05）,说明经诱导MSCs的细胞胶原分泌功能仍低于软骨细胞.[结论]经TGF-β诱导和低转速离心应力刺激后的MSCs向软骨细胞功能分化,复合细胞因子梯度降解软骨支架材料具有良好的生物相容性,可作为MSCs的有效载体应用于组织工程化软骨的构建.     

大鼠脂肪干细胞复合胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三维支架构建组织工程软骨

目的 探讨大鼠脂肪干细胞复合胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三维支架的优越性.方法 选用6周龄健康Wistar大鼠,分离出脂肪干细胞后行体外培养.将Ⅰ型胶原溶液与壳聚糖溶液混合后冷冻干燥,交联硫酸软骨素后再冷冻干燥得到复合三维支架,检测支架的孔径值、含水量及孔隙率.将接种的脂肪干细胞消化后分别接种到平面、微球和支架,软骨方向诱导培养.MTT检测细胞增殖情况,3周后倒置显微镜及扫描电镜观察细胞形态及在支架上的生长及黏附情况,并分析成软骨分化的情况.结果 5 d后MTT检测显示三维支架组及微球组细胞增殖速度较平面组快;三维支架组14 d后仍有细胞增殖.组织学分析显示细胞在支架上密集重叠生长,内层仍有残留支架结构.Ⅱ型胶原免疫组化检测结果显示,三维支架组及微球组表达呈强阳性,而平面组表达呈弱阳性.RT-PCR结果显示各组均有软骨特异性mRNA的表达.但平面组一直表达X型胶原,微球组培养至21 d时也表达X型胶原,而三维支架组则一直未表达.结论 复合胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三维支架能促进细胞的增殖、分化,并能更好地维持软骨细胞的表型,可以作为组织工程构建软骨的最佳选择.     

聚乙二醇转化生长因子-β1缓释微球去细胞瓣复合支架生物学性能

目的 制备聚乙二醇(PEG)转化生长因子(TGF)-β1缓释微球左细胞瓣复合支架,观察生物学性能.方法 制备聚乙二醇微球,电镜观察粒径.去细胞瓣与PEG微球耦联,吸附TGF-β1,行酶联免疫吸附试验(ELISA)检测,形态学与分子生物学检测.种植大鼠肌成纤维细胞,体外培养7 d,构建组织工程心脏瓣膜(TEHV),行形态学与分子生物学检测.结果 PEG微球粒径(42.72±3.48)nm.ELISA检测示TGF-β1包封率82.01%,7 d TGF-β1释放率67.22%.与去细胞瓣支架比较,复合支架组细胞紧密联合且细胞外基质丰富,羟脯氨酸含量和DNA含量增高.结论 PEG-TGF-β1缓释微球去细胞瓣复合支架,利于细胞生长,胶原的分泌及TEHV的构建.     

保肾片对系膜细胞机械性伸展诱导的增殖因子和细胞外基质成分的影响

目的：在肾小球硬化的进展中，肾小球内压升高是一种主要的启动因子，小球内压升高能增加系膜细胞的伸展强度。本研究探讨培养的大鼠系膜细胞中，机械性伸展对TGF－β和细胞外基质成分mRNA表达的影响，以及中药保肾片的抑制作用。方法：用机械性伸展装置刺激培养的肾系膜细胞，并在培养液中加入喂服中药保肾片大鼠的血清，用Northern blot分析TGF－β1、3及I型、Ⅳ型胶原mRNA的表达。结果：机械性伸展以时间依赖性方式刺激TGF－β1和TGF－β3的mRNA表达，同时也发现机械性伸展能诱导系膜细胞外基质的主要成分I型、Ⅳ型胶原及纤维结合素的mRNA表达亢进，中药保肾片对系膜细胞机械性伸展诱导的细胞增殖因子TGF－β1和细胞外基质主要成分I型、Ⅳ型胶原的mRNA表达具有明显的抑制作用。结果：机械性伸展刺激能够诱导产生TGF－β1、3及I型、Ⅳ型胶原mRNA表达。中药保肾片延缓慢性肾衰竭的作用机理与抑制细胞增殖因子和细胞外基质成分mRNA的表达有关。     

脂肪间充质干细胞复合壳聚糖-胶原-硫酸软骨素多孔支架体外成软骨能力的实验研究

目的 制备壳聚糖-胶原-硫酸软骨素三维支架,并与大鼠脂肪间充质干细胞复合培养,探讨其作为软骨组织工程支架的可行性.方法 冷冻干燥法制备壳聚糖-胶原-硫酸软骨素复合多孔海绵支架材料,采用体积法和称重法测定支架的孔隙率和吸水性,扫描电镜观察支架材料的形态结构.分离培养大鼠脂肪间充质干细胞,流式细胞学检测大鼠脂肪间充质干细胞的表面标志CD29、CD34、CD44、CD45,将传至3代的细胞,以2×106/ml的密度接种于自制的壳聚糖-胶原-硫酸软骨素三维支架上.实验组为含TGF-β1的培养基,对照组无TGF-β1,培养3周后,通过免疫组织化学,RT-PCR及westenblot方法对诱导后的细胞进行鉴定.结果 制备的壳聚糖-胶原-硫酸软骨素三维支架具有合适的三维多孔结构,孔隙率为(92.23±1.68)%,孔径为100～130 μm.复合培养3周后,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色成阳性,RT-PCR结果表明有蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA的表达,westenblot检测出Ⅱ型胶原蛋白的表达.结论 壳聚糖-胶原-硫酸软骨素复合支架材料可为脂肪间充质干细胞生长分化及组织形成提供一个良好的环境, 在软骨组织工程的支架材料领域有较广泛的应用前景.     

粘附分子β_1整合素在伤口愈合中表达的研究

目的　研究伤口愈合过程中 ,粘附分子整合素家族在介导细胞与细胞外基质间的主要作用。　方法　运用原位杂交技术对 12例中厚取皮区创面成纤维细胞表面整合素α5、β1亚基mRNA表达进行了检测。　结果　中厚取皮供区整合素α5、β1染色阳性的真皮成纤维细胞密度较正常皮肤显著增高。　结论　上述结果提示创面成纤维细胞整合素α5、β1表达增高可能参与伤口愈合时高产量胶原成纤维细胞亚群的激活     

力学刺激对体外立体培养软骨细胞基质代谢的影响

目的 分析周期性动态压缩刺激对体外海藻酸钠立体培养关节软骨细胞基质合成代谢的影响。方法 取2月龄新西兰白兔10只,酶解消化获取膝关节全层软骨细胞,以海藻酸钠凝胶立体培养,分为实验组和对照组两组,对照组行静态培养,未施加任何压力;实验组利用Flexcell-5000力学加载系统对体外培养软骨细胞进行周期性压缩应力加载,1 h/d。于加载第7、14、21天留取软骨细胞,采用实时定量聚合酶联反应对软骨细胞蛋白聚糖(aggrecan,AGG)、Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原及基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)mRNA进行定量分析。结果实验组在第7天AGG及Ⅱ型胶原mRNA的表达明显增高(P0.05),随加载时间延长,其表达量逐渐下降,在第14、21天两组比较均无明显差异。同时,实验组在第7天时,Ⅹ型胶原及MMP-13的表达无明显差异。第14天,实验组Ⅹ型胶原及MMP-13 mRNA的表达与对照组比较明显增高(P0.05)。结论 立体培养软骨细胞在生理力学刺激7 d时可明显促进其基质合成能力,但随刺激时间的延长,其基质合成能力逐渐减弱,软骨细胞趋于肥大分化。     

成纤维细胞表面粘附分子β_1整合素在伤口愈合中的表达

目的研究伤口愈合过程中,细胞外基质(Extracelluar matrix,ECM)中粘附分子整合素β_1的表达与胶原合成之间的密切关系。方法运用间接免疫胶体金标记技术,在电镜下观察了12例中厚取皮供区创面成纤维细胞表面粘附分子β_1整合素的表达及细胞超微结构的变化,并作了流式细胞仪检测。结果中厚取皮供区创面成纤维细胞表面粘附分子整合素α_5及β_1亚单位的表达与对照组相比有显著差异;同时,前者细胞内富含有核糖体积聚的内质网,微管、微丝等细胞器的含量也较高。结论上述结果揭示了在伤口愈合过程中,粘附分子整合素β_1的表达与胶原合成之间有重要的关系,为进一步探索粘附分子在伤口愈合中的作用打下了基础。     

乳腺癌肿瘤干细胞体外培养体系的建立

目的建立一种适合乳腺癌肿瘤干细胞体外培养的三维培养体系。方法根据不同的培养方法分为两组:二维细胞培养组,采用传统二维细胞培养方法培养乳腺癌MCF-7细胞;三维细胞培养组,将乳腺癌MCF-7细胞接种于三维胶原支架材料上,在摇床上动态培养5d,在光学显微镜和激光共聚焦显微镜下观察乳腺癌肿瘤细胞在胶原材料上的形态学特征。采用CCK-8细胞增殖检测的方法,比较三维培养组和二维培养组细胞增殖能力,通过流式细胞术检测两组乳腺癌肿瘤干细胞标志CD44~+/CD24~-/low的表达差异。结果光学显微镜下观察结果显示:二维培养组MCF-7细胞为单层生长平展的粘附生长,呈多边形、铺路石样的上皮细胞形态;三维培养组MCF-7来源的细胞再次二维培养后,细胞展现出三角形或者长梭形及较多细胞呈不规则形,部分细胞还伸展出长浸润性伪足。激光共聚焦显微镜观察显示,MCF-7细胞均匀地生长在三维支架材料上,局部放大后清晰可见长伪足,且细胞大小不均一,细胞形态多样。三维培养组细胞增殖速度与二维培养组相似。与二维培养组相比较,三维培养组CD44~+/CD24~-细胞比例显著增加,由38.9%增加至60.3%。结论基于三维胶原支架材料的三维培养体系能够有效维持乳腺癌肿瘤干细胞干性。