兔脂肪干细胞体外成骨诱导培养及成骨活性鉴定的实验研究

目的体外分离培养兔脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）,在成骨诱导条件下鉴定其成骨活性。方法取4月龄新西兰大白兔腹股沟区脂肪,Ⅰ型胶原酶消化,分离、培养及传代原细胞,将第3代ADSCs消化后,加入成骨培养液中诱导分化,分别行碱性磷酸酶染色、茜素红染色、VonKoss（a钙结节）染色,以鉴定分化结果。结果体外分离培养的细胞增殖活跃,成骨诱导后碱性磷酸酶染色、茜素红染色及Von Kossa染色均呈阳性表达。结论脂肪干细胞具有成骨分化能力,是一种理想的骨组织工程种子细胞。     

大鼠脂肪基质干细胞的培养及其向成骨细胞分化的研究

目的：研究大鼠脂肪基质干细胞（adipose—derived stem cells，ADSCs）分离培养的方法，探讨大鼠脂肪基质干细胞在体外向成骨细胞分化的能力。方法：取成年Sprague—Dawley大鼠腹股沟处脂肪组织，胶原酶消化分离．接种于自制基础培养基巾分离传代。于基础培养基中传至第二代时改换诱导培养基，诱导向成骨细胞分化，培养2-4周．用碱性磷酸酶染色和Von Kossa染色鉴定成骨细胞分化能力。结果：大鼠脂肪中能够分离培养出生长旺盛的脂肪基质下细胞：经向成骨细胞诱导培养后，碱性磷酸酶染色和Von Kossa染色阳性，证实细胞能够分化为成骨细胞。结论：大鼠脂肪组织可分离培养出脂肪基质干细胞，生物学特性与骨髓基质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）相似，能够向成骨细胞分化，有望成为组织工程的种子细胞来源。     

长期体外培养对人脐血间充质干细胞成骨分化潜能的影响

目的观察体外长期培养对人脐血间充质干细胞（Human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells,UCB-MSCs）成骨分化潜能的影响,探讨其作为组织工程骨种子细胞的可行性。方法流式细胞技术观察长期体外培养的UCB-MSCs细胞表面抗原表达的变化规律,并通过Alizarin Red染色及碱性磷酸酶活性、骨钙蛋白含量和钙离子含量的检测观察长期体外培养对UCB-MSCs成骨特性的影响。结果第10代之前的UCB-MSCs能够高表达间充质干细胞表面标志物,7代之前的细胞体外增殖能力不随传代次数而发生明显变化。Alizarin Red染色及碱性磷酸酶活性、骨钙蛋白含量和钙离子含量的检测显示8代之前的UCB-MSCs仍能保持较强的成骨分化能力。结论7代之前的UCB-MSCs能保持稳定的体外成骨分化特性,有望成为较理想的组织工程骨种子细胞。     

诱导人孤雌胚胎干细胞向类间充质干细胞分化的实验研究

目的探索人孤雌胚胎干细胞在体外向类间充质干细胞诱导分化的方法 ,并鉴定所得细胞的生物学特性。方法人孤雌胚胎干细胞在无血清条件下悬浮培养,形成拟胚体,10d后在含血清条件下使拟胚体贴壁生长,7d后胰酶消化,所得细胞在含血清的培养液中传代、扩增。观察传代、扩增后细胞的形态学变化;用免疫荧光染色和流式细胞技术进行细胞表型分析;取第9代细胞进行成脂、成骨和成软骨诱导,9～28d后行特殊染色及RT-PCR分析。结果人孤雌胚胎干细胞在诱导分化后,形态与骨髓间充质干细胞相似,多次扩增传代后仍保持细胞形态和扩增能力。免疫荧光染色发现,细胞表达中胚层标志波形蛋白(Vimentin)。流式细胞分析显示,细胞表达CD29、CD105、CD166、CD44等间充质干细胞表面标志。特殊染色及RT-PCR分析显示:成骨诱导后,细胞碱性磷酸酶和茜素红染色阳性,碱性磷酸酶和Cbfa-1表达增加;成软骨诱导后,细胞Ⅱ型胶原染色阳性,Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达增强;成脂诱导后,细胞油红染色阴性,脂蛋白酶和Leptin无表达。结论人孤雌胚胎干细胞可以诱导、分化为间充质干细胞,并具有成骨、成软骨分化潜能。     

成人间充质干细胞体外成骨的初步研究

目的 建立一种分离和培养成人骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）的方法,观察成人MSCs体外成骨潜能。方法 用Percoll分离液分离出骨髓中的单个核细胞,并在含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液中培养。通过传代培养扩增MSCs。为促进成人MSCs体外成骨性分化,第5传代培养时加入成骨性添加剂,培养第4、12天分别用流式细胞仪分析成人MSCs表面分子的表达,并用碱性磷酸酶组化染色和Von Kossa染色。结果 成人MSCs是骨髓黏附细胞中有相应细胞表面蛋白表达和形态均的一细胞群。成骨性添加剂可作用于传代培养的成人MSCs,表现为培养皿表面有相互连接的结节状聚合体、碱酶染色阳性细胞数量增多、Von Kossa染色可见钙化的基质沉积。结论 所建立的成人MSCs的分离和培养条件可分选出骨髓黏附细胞中一组独特的细胞群,成人MSCs具有体外成骨潜能。     

人骨膜细胞生物学特性的实验研究

目的 探讨人骨膜细胞体外培养的生物学特性. 方法 以胫骨骨膜组织为材料,采用组织块法分离细胞,完全培养基培养,通过倒置显微镜观察细胞形态学,锥虫蓝染色计数法检侧细胞增殖能力;流式细胞学分析细胞表面抗原.随机分为3组,成骨实验组和成软骨实验组分别加入不同的定向培养剂,对照组加入完全培养基,采用碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色检测各组细胞的成骨和成软骨分化指标. 结果 骨膜细胞在体外培养条件下呈贴壁生长,细胞生长曲线证实骨膜细胞传至第9代仍保持良好的增殖能力,流式细胞仪检测证实细胞表面抗原CD90及CD105呈阳性;组织化学染色检测证实成骨实验组分化后细胞碱性磷酸酶及钙结节呈阳性,成软骨实验组分化后细胞蛋白聚糖及Ⅱ型胶原呈阳性,对照组各项指标均生阴性.结论 骨膜细胞体外培养细胞增殖能力强,具有间充质干细胞的特性和良好的成骨和成软骨分化潜能,其定向诱导分化的成骨细胞和软骨细胞均具有各自明显的细胞功能表达.     

人胎盘间充质干细胞的体外分离纯化及成骨能力的研究

目的通过体外分离纯化人足月胎盘间充质干细胞(hPMSCs),以研究其生物学特征及成骨能力。方法 采用胶原酶消化贴壁培养及人淋巴细胞分离液从人足月胎盘中分离纯化间充质干细胞(MSCs);流式细胞仪检测其细胞表面标志物的表达并运用MTT测定细胞生长曲线;电镜观察细胞超微结构;地塞米松、维生素C与β-甘油磷酸钠联合诱导其向成骨细胞分化,碱性磷酸酶及茜素红染色检测其碱性磷酸酶活性及钙结节。结果培养14天后可见大量贴壁细胞呈成纤维状生长,传代后增殖能力显著增强;强表达CD44,CD29,不表达CD34,CD45;经诱导后具有向成骨细胞分化的潜能,茜素红及碱性磷酸酶染色结果阳性。结论 人足月胎盘中同样含有MSCs,与其他来源的MSCs生物学特性相似,并且具有向中胚层细胞分化的能力,可作为组织工程及细胞替代疗法新的干细胞来源。     

人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞及其鉴定

目的探讨将成人骨髓间充质干细胞(MSCs)定向诱导分化为成骨细胞的方法,并对所诱导细胞的成骨特性进行鉴定. 方法分离人骨髓,梯度离心并结合全骨髓法进行培养,培养基中添加成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸钠及抗坏血酸.贴壁细胞传代,取第3代细胞鉴定其成骨特性;在倒置相差显微镜下观察细胞形态,钙-钴法染色检测碱性磷酸酶(ALP)表达,免疫组织化学检测Ⅰ型胶原表达,原位杂交检测骨连接素(ON)、骨桥素(OP)表达,Von Kossa 染色检测钙结节形成. 结果第3代人MSCs呈典型的成骨细胞形态,可连续传代10次;ALP染色阳性率达85%;Ⅰ型胶原、ON和OP表达阳性;Von Kossa 染色可见钙结节形成. 结论成功地将人MSCs诱导分化为成骨细胞,所诱导的细胞具有典型的成骨细胞特性.     

人小涎腺成纤维样单克隆细胞的成骨分化

目的：探索人小涎腺成纤维样单克隆细胞的体外培养、扩增方法,鉴定其性质,研究向成骨细胞分化的潜能。方法：组织块贴壁法原代培养人小涎腺细胞,收集成纤维样细胞,用96孔板稀释铺板法克隆培养,免疫荧光和RT-PCR检测细胞表型,并进行成骨诱导分化,通过骨钙素、一型胶原免疫细胞化学染色及碱性磷酸酶、茜素红钙结节染色鉴定成骨分化。结果：成功的在体外扩增培养出人小涎腺成纤维样单克隆细胞,免疫荧光证实细胞表达CD13、CD29、CD106和CD44,RT-PCR显示CK18、α-SMA、vimentin、CD106、nestin基因表达与人骨髓间充质干细胞相似。成骨诱导8天后,碱性磷酸酶表达阳性率100%,19天后骨钙素和一型胶原大量表达,并形成钙结节。结论：所建立的分离培养体系能够获得大量人小涎腺成纤维样单克隆细胞,免疫表型类似于间充质干细胞。在成骨诱导培养条件下具有良好的向成骨细胞分化的潜能。     

脂肪组织来源干细胞的成骨诱导和外源性基因转染表达研究

目的：探讨脂肪组织来源的干细胞（ADSCs）表达外源性基因的可能性。方法：取小香猪腹部皮下脂肪组织，通过Ⅰ型胶原酶消化、离心等方法分离培养ADSCs，再经原代培养和传代培养。利用成骨诱导剂（10^-7mol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠和50mg/L左旋抗坏血酸）诱导ADSCs向成骨方向分化，观察其生长形态，并通过Gomori改良钙钴法和von Kossa染色对其成骨表型进行鉴定。另设一对照组，培养基中不加入成骨诱导剂。脂质体介导人内皮细胞生长因子（hVEGF）和骨形态发生蛋白-2（hBMP-2）转染ADSCs细胞，观察转染后细胞形态和生长情况，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫细胞化学方法分别检测hVEGF mRNA、BMP-2 mRNA及其蛋白质表达。结果：成骨诱导剂能显著诱导体外培养的ADSCs向成骨细胞分化，诱导19d的ADSCs体积增大，细胞由梭形变为多边形，Gomori改良钙钴法染色显示其胞浆内富含碱性磷酸酶颗粒，诱导15d和19d，碱性磷酸酶阳性细胞分别为（25.0±7.5）%和（49.7±6.9）%。von Kossa染色表明聚集的细胞团中央有钙化结节形成。RT-PCR检测证实，经质粒转染的ADSCs中hVEGF和hBMP-2基因表达明显增强，对照组呈弱表达。免疫组织化学检测证实转染ADSCs内有棕色的阳性颗粒出现，未转染细胞则呈现阴性。结论：ADSCs能被成功诱导为成骨细胞，hVEGF和hBMP-2基因能成功地转入ADSCs并表达，这为促进骨组织工程的血管化和成骨活性奠定了基础。     

大鼠脂肪组织来源干细胞的分离、培养和生物学特性的研究

目的:建立一种分离和培养大鼠脂肪干细胞的方法,并探讨获得的脂肪干细胞的部分生物学特性。方法:取SD大鼠腹股沟处的皮下脂肪,I型胶原酶消化法获取原代脂肪干细胞,接种至含10%胎牛血清的DMEM培养液,培养并适时传代,每日在倒置显微镜下观察记录细胞形态和增殖特征,测定其生长曲线,进行冻存复苏实验。第3代细胞使用成骨诱导液诱导其向成骨细胞分化,进行VonKossa染色;使用成脂诱导液诱导其向成脂细胞分化,进行油红O染色。结果:从大鼠脂肪组织中分离出脂肪干细胞,其在体外生长增殖迅速,呈成纤维样细胞生长。生长曲线表明第3代脂肪干细胞增殖能力最强,可以在地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠的诱导下,表现出成骨细胞特性,VonKossa染色出现矿化结节;在IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)、吲哚美辛、胰岛素的诱导下,表现出脂肪细胞特性,油红O染色后发现胞浆内有脂肪滴。脂肪干细胞在液氮中冻存1个月后,其生长增殖活性和多向分化能力没有明显降低。结论:成功建立了一种简单有效的分离和培养大鼠脂肪干细胞的方法,获得的脂肪干细胞生长增殖旺盛,具有多向分化能力,可以方便地保存,有望作为细胞治疗和组织工程的种子细胞。在分离大鼠的脂肪干细胞时,NH4Cl裂解红细胞这一步可以省略,地塞米松在成脂诱导过程中不是必需的。     

大鼠脂肪干细胞体外诱导成平滑肌样细胞的研究

目的:研究大鼠脂肪干细胞(ADSCs)体外单层培养条件下诱导分化为平滑肌样细胞的可行性。方法:从SD大鼠的腹股沟脂肪垫分离获取脂肪干细胞,测定其生长曲线。取第4代细胞用成脂诱导液诱导分化,并用油红O染色鉴定。取第4代细胞用成骨诱导液诱导分化,并用Von Kossa染色鉴定。取第4代细胞用含有β-巯基乙醇的成平滑肌诱导液诱导,并用免疫组化的方法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果:脂肪干细胞成梭形和多角形,体外生长迅速,生长曲线表明传代2 d后细胞进入对数生长期。第4代细胞成脂诱导后,油红O染色证实细胞内存在脂滴;成骨诱导后,Von Kossa染色证实有矿化结节。脂肪干细胞诱导平滑肌样细胞免疫组化结果,β-巯基乙醇诱导组和未诱导组细胞α-SMA的表达阳性率分别为(29.80±6.89)%、(2.89±1.24)%。诱导组细胞α-SMA的表达阳性率高于未诱导组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:脂肪干细胞经诱导后出现明显的平滑肌细胞特征,可成为平滑肌相关疾病在组织工程研究上新的种子细胞来源。     

Choukroun’SPRF对体外培养人脂肪干细胞增殖及成骨分化的影响

目的：观察自体富血小板纤维蛋白Choukroun＇s PRF（Choukroun＇s platelct-rich fibrin）对体外培养人脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）增殖及成骨分化能力的影响。方法：取吸脂术者自愿捐献的脂肪组织分离培养ADSCs,采用Choukroun法制备自体PRF备用,观察细胞生长情况。取第3代ADSCs分别向骨细胞、脂肪细胞、神经球细胞定向诱导分化鉴定,并行细胞表面抗原CD29、CD45、CD90流式检测鉴定。将第3代ADSCs分别采用含PRF的普通培养基（PRF组Ⅰ）和不含PRF的普通培养基（对照组Ⅰ）进行培养,观察细胞生长情况,培养1天、3天、5天、7天后采用CCK-8试剂检测细胞增殖活性。另外分别采用含PRF的成骨诱导培养基（PRF组Ⅱ）、不含PRF的成骨诱导培养基（对照组Ⅱ）及不合PRF的普通培养基（空白组）进行培养,第7天、14天、21天、28天行碱性磷酸酶活性（ALP活性）检测;诱导细胞培养后第7天、14天天各组分别行von Kossa染色观察钙结节形成情况。结果：第3代ADSCs倒置显微镜下观察大多呈梭形,向骨细胞、脂肪细胞、神经干细胞定向诱导鉴定均为阳性,流式检测鉴定CD29、CD90为阳性,CD45为阴性。CCK-8法示PRF组Ⅰ的0D值均大于对照组Ⅰ,两组比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。ALP活性检测示PRF组Ⅱ第7天、14天、21天、28天细胞活性较对照组Ⅱ均大,两组比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。PRF组Ⅱ成骨诱导7天后vonKossa染色阳性;14天后阳性细胞增多,对照组Ⅱ诱导7天未见钙结节,14天见少量阳性钙结节,空白组培养14天未见黑色钙结节。结论：Choukroun’sPRF明显促进脂肪干细胞增殖及成骨分化,为骨组织工程提供了新的技术。PRF与干细胞共同培养可能还有许多潜在的临床及生物工程应用价值,值得进一步研究。     

负载人骨形态发生蛋白-7基因的兔脂肪干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的 探讨人骨形态发生蛋白-7(hBMP-7)基因修饰对兔脂肪干细胞(ADSCs)成骨能力的影响. 方法 原代培养兔脂肪干细胞,免疫组织化学方法检测细胞表面抗原CD44、CD49d、CD106的表达,对细胞进行鉴定;阳离子脂质体介导hBMP-7基因转染ADSCs,绿色荧光蛋白表达观察转染效率、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测目的基因hBMP-7的表达;ALP定量测定,Western blot检测Ⅰ型胶原、骨钙素的表达,以评价转基因ADSCs向成骨细胞分化的情况. 结果 从兔脂肪组织中分离出来的ADSCs CD44、CD49d表达呈阳性,CD106表达呈阴性.RT-PCR检测筛选后的ADSCs稳定表达hBMP-7.转染后7、10、14 d ALP定量测定转染组明显高于未转染组,差异有统计学意义(P<0.05);成骨标志物Ⅰ型胶原、骨钙素的表达转染组明显高于未转染组.结论 从脂肪组织中分离出的ADSCs是一种较好的组织工程种子细胞.hBMP-7重组质粒转染ADSCs后表达目的蛋白,并诱导ADSCs向成骨细胞分化.     

体外培养对骨髓间充质干细胞凋亡的影响

目的 :研究成人骨髓间充质干细胞在体外培养条件下 ,传代次数与细胞凋亡的关系。方法 :采用An nexinV/PI双染色法 ,在流式细胞仪上检测不同传代数的成人骨髓间充质干细胞的凋亡情况。结果 :传代次数越多 ,骨髓间充质干细胞的凋亡率及死亡率越高 ,存活的正常细胞越少。结论 :第 4代以内的细胞增殖能力强 ,凋亡率低 ,适宜于组织工程研究     

脂肪干细胞在骨组织工程中的研究进展

脂肪干细胞上一类存在于脂肪组织中,能够自我更新、具有多向分化潜能的成体干细胞,在一定的条件下可以分化成许多具有特定功能的细胞系,具有一般干细胞的特点,可作为组织工程的种子细胞。本文就脂肪干细胞的生物学特性及其在骨组织工程中的研究进展进行综述。