负载人骨形态发生蛋白-7基因的兔脂肪干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的 探讨人骨形态发生蛋白-7(hBMP-7)基因修饰对兔脂肪干细胞(ADSCs)成骨能力的影响. 方法 原代培养兔脂肪干细胞,免疫组织化学方法检测细胞表面抗原CD44、CD49d、CD106的表达,对细胞进行鉴定;阳离子脂质体介导hBMP-7基因转染ADSCs,绿色荧光蛋白表达观察转染效率、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测目的基因hBMP-7的表达;ALP定量测定,Western blot检测Ⅰ型胶原、骨钙素的表达,以评价转基因ADSCs向成骨细胞分化的情况. 结果 从兔脂肪组织中分离出来的ADSCs CD44、CD49d表达呈阳性,CD106表达呈阴性.RT-PCR检测筛选后的ADSCs稳定表达hBMP-7.转染后7、10、14 d ALP定量测定转染组明显高于未转染组,差异有统计学意义(P<0.05);成骨标志物Ⅰ型胶原、骨钙素的表达转染组明显高于未转染组.结论 从脂肪组织中分离出的ADSCs是一种较好的组织工程种子细胞.hBMP-7重组质粒转染ADSCs后表达目的蛋白,并诱导ADSCs向成骨细胞分化.     

重组腺病毒介导BMP-9及促红细胞生成素双基因共转染促进脂肪来源干细胞体外成骨的研究

目的探讨重组腺病毒介导BMP-9及促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)双基因共转染对脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)体外成骨分化的影响。方法取4月龄新西兰兔腹股沟脂肪组织,采用酶消化法与贴壁法分离培养ADSCs并鉴定其多向分化能力。将第3代ADSCs分为5组:A组为正常细胞,B组为空质粒转染细胞作为对照,C、D组分别采用BMP-9、EPO重组腺病毒转染细胞,E组采用BMP-9、EPO重组腺病毒共转染细胞。转染培养7 d后倒置相差显微镜观察各组细胞生长变化;计算48 h时病毒转染效率,14 d荧光显微镜下观察各组细胞荧光表达情况;14 d时Western blot检测各组细胞BMP-9及EPO蛋白表达。取转染培养14 d的5组细胞进行成骨诱导培养,于诱导培养3、7、14 d检测各组细胞ALP活性;3周时茜素红染色观察钙结节形成情况,实时荧光定量PCR检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)基因表达。结果转染培养7 d后倒置相差显微镜下见A、B组部分细胞变为椭圆形、圆形和不规则形;C、D组可见少量长梭形细胞;E组长梭形细胞明显增多,仅见少量圆形细胞。荧光显微镜下观察BMP-9、EPO及BMP-9/EPO重组腺病毒均能稳定转染ADSCs,转染效率为80%~93%。Western blot检测示E组BMP-9及EPO蛋白相对表达量显著高于其他组,差异有统计学意义(P0.05)。成骨诱导培养3、7、14 d时各组细胞ALP活性明显升高,E组优于其余各组(P0.05);3周时茜素红染色示E组钙结节数亦显著高于其余各组(P0.05),实时荧光定量PCR示E组OPN和OCN基因相对表达量明显高于其他组,C、D组高于A、B组,比较差异有统计学意义(P0.05)。结论重组腺病毒介导BMP-9及EPO基因均可转染ADSCs并稳定表达,双基因共转染后能显著促进成骨相关基因和蛋白的表达。     

BMP-2重组质粒转染人骨髓基质干细胞及表达蛋白的诱导活性观察

目的 构建骨形态发生蛋白-2(BMP-2)真核表达质粒，使其在人骨髓基质干细胞(hBMSCs)中表达，并观察表达产物的诱导成骨活性。方法在脂质体介导下将BMP-2基因导入hBMSCs，流式细胞仪、ALP检测和VEGF探针原位杂交分析其对细胞增殖、ALP活性和VEGF表达的影响。并利用转染后的培养液上清诱导小鼠成纤维细胞(L929)，检测其骨钙素、Ⅱ型胶原表达。结果 转染后细胞稳定表达BMIP-2基因，S期细胞比例增多，ALP活性和VEGF的表达明显增加。且诱导L929细胞骨钙素、Ⅱ型胶原阳性表达。结论 BMP-2重组质粒转染hBMSCs后表达目的蛋白，促进自身增殖、分化和上调VEGF的表达，并诱导成纤维细胞向成骨细胞转化，为BMP-2基因治疗奠定了实验基础。     

hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的表达及生物学效应的观察

目的:观察人骨形态发生蛋白-2(humanbonemorphogeneticprotein-2,hBMP-2)基因转染兔骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)后的表达及表达产物对BMSCs增殖和向成骨细胞分化的影响。方法:利用腺病毒表达载体Adeno-XTM将hBMP-2基因转染兔BMSCs,用免疫组化染色。检测细胞内BMP-2的表达。然后通过MTT法分析其对细胞增殖的影响,并分别通过体外检测Ⅰ型胶原合成和表达情况、碱性磷酸酶染色和钙结节VonKossa染色,观察腺病毒介导hBMP-2基因转染兔BMSCs的成骨分化能力。结果:转基因细胞6周时仍能表达外源性基因。基因表达产物hBMP-2能明显促进BMSCs的增殖以及I型胶原的合成,转染后第14天碱性磷酸酶染色多数细胞为阳性,第21天出现钙结节。结论:hBMP-2基因转染BMSCs后可获得稳定表达,且基因表达产物能促进BMSCs增殖,并诱导其向成骨细胞分化。     

腺病毒骨形态发生蛋白2绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓基质干细胞成骨及示踪作用

目的 观察腺病毒介导的人骨形态发生蛋白绿色荧光蛋白基因(Ad-GFP-hBMP-2)转染对骨髓间质干细胞(bMSCs)成骨能力的影响.方法 取日本大耳白兔4只自双侧股骨远端抽取骨髓培养bMSCs.以Ad-GFP-hBMP-2基因(实验组)及Ad-GFP(对照组)基因转染bMSCs后,用ALP检测试剂盒检测两组细胞的ALP活性;原位杂交检测两组细胞I型胶原的表达;Western blot 检测细胞中BMP-2的表达.将转染后24 h的bMSCs接种到裸鼠体内,术后第4、8、12周观察成骨情况.结果 转Ad-GFP-hBMP-2基因组和Ad-GFP组各时间段ALP分泌量差异分别有统计学意义(P<0.01);实验组I型胶原原位杂交实验组为阳性.实验组成骨阳性率为90%,对照组为40%.结论 bMSCs经Ad-GFP-hBMP-2基因转染后能高效表达BMP-2并诱导成骨.腺病毒介导人BMP-2转基因可以提高bMSCs的成骨能力.     

腺病毒介导入BMP-2对骨髓间质干细胞成骨能力的影响

目的　探讨腺病毒介导的人骨形态发生蛋白 (BMP 2 )转染对体外培养骨髓间质干细胞(MSCs)成骨能力的影响。　方法　取日本大耳白兔 2 0只自双侧股骨大转子取材培养MSCs ,左侧来源细胞为实验组 ,右侧为对照组。以复制缺陷重组腺病毒介导人BMP 2基因转染MSCs后 ,用ALP检测两组细胞的ALP活性 ;骨钙素RT PCR检测两组细胞Ⅰ型胶原的表达 ;BGP放免分析检测两组细胞的骨钙素含量。　结果　转基因组和对照组ALP分泌量 (U/L)分别为 7 0 1± 0 5 9、5 2 3± 0 5 5 ;RT PCRⅠ型胶原的表达为 1 3 5± 0 12、3 65± 0 3 7;骨钙素 (ng/ml)为 2 4 5 0± 0 93和 15 45± 1 81。两组间差异均有显著性 (P <0 0 5 )。　结论　用腺病毒介导人BMP 2蛋白作用后的MSCs具有成骨细胞的生物学特性。腺病毒介导人BMP 2转基因可以提高MSCs的体外成骨能力。     

人骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及分化的影响

目的:研究人骨形态发生蛋白-2腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染人骨髓基质干细胞(hBMSC)对其增殖及分化的影响.方法:利用免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达.流式细胞仪和ALP活性测定分析BMP-2基因转染对细胞增殖、分化的影响.结果:转染后,hBMP-2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达.蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白阳性表达,S期细胞比例和ALP活性明显增高.结论:Ad-BMP-2可高效转染hBMSC,且促进细胞增殖和成骨转化.     

BMP-14联合Noggin shRNA共转染对脂肪来源干细胞成骨分化能力的影响

目的在体外环境下同时下调细胞中Noggin基因和增加BMP-14基因,观察对脂肪来源干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)成骨分化能力的影响。方法取健康成年SD大鼠5只,体质量250~300 g,采用Ⅰ型胶原酶消化法获取原代ADSCs,体外培养、扩增。使用慢病毒载体将目的基因转染大鼠ADSCs,根据目的基因不同将实验分为3组,A组为空载体病毒Lv-增强型绿色荧光蛋白转染对照组,B组为Lv-BMP-14转染组,C组为BMP-14+Noggin sh RNA转染组。分别于转染后3、7、14 d,采用实时荧光定量PCR检测BMP-14及成骨相关基因[Ⅰ型胶原、ALP、骨钙素(osteocalcin,OCN)]的表达,转染后14 d采用茜素红染色鉴定其成骨分化能力。结果转染后3 d,各组BMP-14 m RNA相对表达量比较差异无统计学意义(P0.05);7、14 d,C组BMP-14 m RNA相对表达量高于A、B组,B组高于A组,比较差异均有统计学意义(P0.05)。转染后3 d,C组各成骨相关基因m RNA相对表达量显著高于A、B组(P0.05);A、B组间比较差异无统计学意义(P0.05)。转染后7、14 d,C组各成骨相关基因m RNA相对表达量显著高于A、B组,B组高于A组,除转染后7 d A、B组间Ⅰ型胶原m RNA相对表达量比较差异无统计学意义(P0.05)外,其余各组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。转染后14 d茜素红染色示,A、B、C组钙结节量呈递增趋势。结论 BMP-14具有增强大鼠ADSCs向成骨细胞分化的能力;沉默细胞中的Noggin基因、联合BMP-14基因共同作用于大鼠ADSCs,其体外成骨分化能力明显强于BMP-14单基因转染,两者有显著的协同作用。     

骨形态发生蛋白2和富血小板血浆凝胶对兔骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的影响

目的观察富血小板血浆(PRP)凝胶及腺病毒介导的骨形态发生蛋白2(BMP-2)基因转染对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外成软骨分化的影响。方法取新西兰大白兔骨髓培养BMSCs,抽取静脉血制备PRP,以Ad-GFP-hBMP-2(BMP-2-BMSCs组)及Ad-GFP(对照组)转染的BMSCs分别与PRP凝胶复合,继续培养。用扫描电镜、MTT检测PRP凝胶的生物相容性,RT-PCR检测各组的Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、蛋白聚糖、SOX-9表达。结果扫描电镜及MTT检测证实PRP凝胶具有良好的生物相容性。RT-PCR分析表明,单层培养的BMP-2-BMSCs组的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖和SOX-9的表达水平均高于对照组(P0.05),但Ⅰ型胶原表达水平较对照组明显下降(P0.05),同时Ⅹ型胶原表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P0.05);与PRP复合后,BMP-2-BMSCs组的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖和SOX-9表达水平较对照组升高(P0.05),而Ⅰ型胶原和Ⅹ型胶原表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论转染BMP-2的BMSCs在PRP凝胶中生长良好,BMP-2基因转染能促进BMSCs的体外成软骨分化。     

人骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及分化的影响

目的：研究人骨形态发生蛋白-2腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染人骨髓基质干细胞(hBMSC)对其增殖及分化的影响。方法：利用免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞。BMP-2的表达。流式细胞仪和ALP活性测定分析BMP-2基因转染对细胞增殖、分化的影响。结果：转染后，hBMP-2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达。蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白阳性表达，S期细胞比例和ALP活性明显增高。结论：Ad-BMP-2可高效转染hBMSC，且促进细胞增殖和成骨转化。     

hBMP-7基因在脂肪源性干细胞中的表达及对其向成骨细胞分化的影响

目的构建hBMP-7基因真核表达载体,观察其在兔脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的表达,并观察其对ADSCs向成骨细胞分化的影响。方法 3月龄清洁级健康日本大耳白兔,雌雄不限,体重3～4 kg。取兔皮下脂肪约5 mL,采用胶原酶消化离心贴壁培养法培养ADSCs,取第3代细胞进行实验;CD44、CD49d、CD106免疫荧光染色鉴定ADSCs。构建真核表达载体pcDNA3.1-hBMP-7,经鉴定后利用LipofectamineTM 2000介导转染ADSCs,免疫组织化学染色检测hBMP-7在ADSCs中的表达;ALP定量测定、Ⅰ型胶原免疫荧光检测hBMP-7基因转染对ADSCs向成骨细胞分化的影响。结果倒置相差显微镜观察示ADSCs呈梭形、多角形分布;表面抗原标志CD44、CD49d呈阳性表达,CD106呈阴性表达。成功构建pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体,并利用脂质体介导的方法成功导入ADSCs中,免疫组织化学染色提示hBMP-7能在ADSCs中表达。ALP定量测定示,转染后7、10、14 d pcDNA3.1-hBMP-7转染组(实验组)ALP活性明显高于pcDNA3.1空载体转染组(对照组),差异有统计意义(P<0.05);转染后7、14 d,实验组Ⅰ型胶原表达量均高于对照组(P<0.05)。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1-hBMP-7可在兔ADSCs中表达,且转染后的ADSCs ALP定量测定、成骨标志物Ⅰ型胶原的表达均高于pcDNA3.1空载体转染细胞,为开展以干细胞为载体的局部基因治疗奠定了基础。     

rhBMP-2、VEGF165双基因转染脂肪干细胞复合支架对体外成骨分化的影响

目的观察重组人骨形态发生蛋白-2(rh BMP-2)、血管内皮生长因子165(VEGF165)双基因转染脂肪干细胞(ADSCs)复合支架对体外成骨分化的影响。方法培养体外犬脂肪干细胞,构建携带rh BMP-2和VEGF165基因的重组慢病毒表达载体,将转染细胞接种到TCP支架,检测转染后细胞附着生长与增殖活性,并以实时定量PCR实验测定rh BMP-2和VEGF165m RNA表达水平,以ELISA试剂盒测定成骨分化标记物骨碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)水平。结果与对照组相比,其余3组的rh BMP-2 m RNA表达水平明显升高,且双基因组和rh BMP-2组高于VEGF165组;其余3组的VEGF165 m RNA表达水平也均明显升高,且双基因组和VEGF165组高于rh BMP-2组,其组间差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,其余3组ALT、OCN、OPN水平均升高,且双基因组高于rh BMP-2组和VEGF165组,rh BMP-2组高于VEGF165组,各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 rh BMP-2、VEGF165双基因转染ADSCs复合支架能够有效提高体外ADSCs成骨分化相关因子ALP、OCN、OPN的合成与分泌,利于促进成骨分化。     

骨形成蛋白2基因修饰的老年大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的研究

目的观察年龄因素对骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs)成骨分化能力的影响;了解基因治疗对老年大鼠MSCs成骨分化能力的影响. 方法 1月龄(幼年组)、9月龄(成年组)及24月龄(老年组)雄性Wistar大鼠各6只,取MSCs经体外分离、培养及携带骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)基因的腺病毒载体(Ad-BMP-2)转染后,定量检测BMP-2、碱性磷酸酶(alkaline phosphate,ALP)表达,以及成骨细胞标志性蛋白:Ⅰ型胶原、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)和骨桥素(osteopontin, OPN)的表达.将转染的各组MSCs分别与磷酸三钙(tricalcium phosphate, TCP)复合后植入裸鼠体内,3周后取材,比较各组诱导异位成骨能力. 结果 ELISA检测表明BMP-2基因修饰的MSCs可以有效表达BMP-2,且表达量在各年龄组间差异无统计学意义(P>0.05);各组ALP于诱导后第9天达高峰,但组间差异均无统计学意义(P＞0.05);诱导后第7天,RT-PCR半定量检测示各组均有成骨细胞特征性蛋白,即:Ⅰ型胶原、OPN及BSP的明显表达,表达量在各组间差异无统计学意义(P>0.05);BMP-2基因转染的MSCs与TCP复合后可诱导裸鼠体内异位成骨,各组成骨量差异无统计学意义(P>0.05). 结论 BMP-2基因修饰的老年大鼠MSCs可以恢复成骨分化能力,基因治疗可能为老年性骨骼疾病提供一种新的治疗途径.     

转染BMP-2基因的兔BMSCs种植PLA/PCL支架体外构建组织工程骨

目的:用腺病毒载体将人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因导入兔骨髓基质干细胞(BMSCs),种植PLA/PCL(聚乳酸/聚己内酯)支架体外构建组织工程骨.方法:蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达,流式细胞仪和ALP活性检测分析基因转染对细胞增殖分化的影响.然后将转染后细胞接种到PLA/PCL支架上,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况.结果:转染后,BMSCs表达BMP-2,S期细胞比例和ALP活性明显增高.扫描电镜见转染细胞分布均匀,伸展良好.结论:BMP-2基因转染BMSCs,可促进细胞增殖分化.转染后细胞在PLA/PCL支架上生长良好,BMP-2基因治疗的组织工程骨构建成功.     

转基因人骨髓间质干细胞在支架中增殖及矿化的研究

目的:观察携带骨形态发生蛋白2基因(BMP-2)的人骨髓间质干细胞(hMSCs)在生物衍生骨支架环境中的增殖及矿化.方法:利用BMP-2腺病毒载体转染hMSCs后种植生物衍生骨支架中,扫描电镜观察细胞生长增殖,能量谱仪测定钙质分泌,RT-PCR检测培养液上清中BMP-2表达.结果:转染后,hBMSC呈ALP、Ⅰ和Ⅱ型胶原阳性表达;细胞在支架中伸展良好,生长旺盛,并产生钙盐沉积;RT-PCR显示培养液上清中存在BMP-2基因表达.结论:转染BMP-2基因的hMSCs在生物衍生骨支架中能够立体生长、增殖,并继续表达目的基因,为基因修饰的组织工程骨修复骨缺损奠定了基础.     

转染人骨形态发生蛋白-2基因的羊骨髓间充质干细胞的异位成骨研究

目的评价腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)基因转染羊骨髓间充质干细胞(MSCs)后的成骨活性。方法实验分为3组:(1)hBMP-2转染细胞组,(2)半乳糖苷酶基因(βgal)转染细胞组,(3)未转染细胞组。从羊骨髓中分离培养MSCs,基因转染后利用免疫沉淀和Westernblot方法检测BMP-2的表达,并在体外进行碱性磷酸酶(ALP)和VonKossa染色、ALP定量测定、透射电镜观察。分别将细胞悬液注入裸鼠股后部肌内,分期进行X线和组织学检查。结果Westernblot检测发现只有hBMP-2转染细胞组的MSCs表达并分泌hBMP-2。该组于转染后第12d,ALP活性达高峰,与其它两组比较,差异有显著性意义;于16d后出现钙结节,而其它两组未见。透射电镜观察见hBMP-2转染细胞组的细胞内粗面内质网、线粒体和溶酶体增多。裸鼠肌内注射细胞悬液后3周,hBMP-2转染细胞组即有异位成骨,6周时明显增多,其它两组仅见纤维组织形成或微量成骨。结论hBMP-2基因转染能诱导羊MSCs分化为成骨细胞,并在裸鼠体内诱导成骨。     

转基因干细胞构建组织工程骨的初步实验研究

目的 用转基因干细胞在体外构建组织工程骨.方法 用携带有人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒感染骨髓基质干细胞(BMSCs)后接种于纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸(nHAC/PLA)支架.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断感染效率;RT-PCR、ELISA和Western-blot用于基因转染的表达检测;流式细胞仪检测细胞增殖;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况;ALP活性检测成骨能力.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%;RT-PCR检测到BMP-2阳性表达,与实际值1191 bp基本一致;ELIISA检测24 h BMP-2蛋白含量为(148.2±21.6)pg/ml;流式细胞仪检测到细胞S期比例增加;ALP活性检测基因转染组明显强于对照组(P＜0.05);扫描电镜见细胞在nHAC/PLA支架上粘附生长良好;第8周时Western-blot仍可检测到BMP-2在相对分子质量26×103处出现阳性条带.结论 BMP-2基因可在BMSCs稳定表达并诱导其向成骨分化,与nHAC/PLA复合培养可用于组织工程骨构建.     

载基因脂多糖胺纳米囊泡诱导BMSCs定向成骨分化

目的制备并优化阳离子载体脂多糖胺纳米囊泡(lipopolysaccharide-amine nanopolymersomes,LNPs)性能,探讨其负载靶基因后体外诱导BMSCs定向成骨分化能力。方法采用接枝共聚的方法合成LNPs,探讨合成时不同pH(7.5、8.0、8.5、9.0)对LNPs及LNPs/pBMP-2-绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)复合物理化性能的影响;通过体外大鼠BMSCs细胞毒性及转染实验,筛选出具低毒高转染效能的LNPs,再用其负载pBMP-2-GFP基因转染大鼠BMSCs,通过定期观察细胞形态、测定细胞表达BMP-2蛋白水平和ALP活性、钙结节生成情况来评价LNPs/pBMP-2-GFP对BMSCs成骨分化的影响。结果 pH为8.5时合成的LNPs含氮量、粒径及zeta电位均低于其余pH值组,其细胞毒性最低(细胞成活率96.5%±1.4%)、转染效率最高(98.8%±0.1%)。BMSCs经LNPs/pBMP-2-GFP转染诱导处理后,在前4 d内,其BMP-2蛋白表达量均明显高于Lipofectamine2000(Lipo)/pBMP-2-GFP组、支链型聚乙烯亚胺25K/pBMP-2-GFP组和空白对照组(P0.05)。诱导后14 d其ALP活性高于Lipo/pBMP-2-GFP组和空白对照组(P0.05),与成骨诱导液处理组相当(P0.05);茜素红染色显示其和成骨诱导液处理组细胞出现明显钙结节,而Lipo/pBMP-2-GFP组和空白对照组细胞出现凋亡、未见明显钙结节;诱导后21 d镜下观察见细胞中出现透明块状结节,呈成骨细胞形态特点。结论 pH为8.5时合成的LNPs具有低细胞毒性、高转染效率,能高效介导BMP-2基因转染大鼠BMSCs,并成功诱导BMSCs成骨定向分化,其成骨诱导效果与成骨诱导液处理相当。LNPs介导的基因转染可能是诱导干细胞定向分化的一种简便有效的手段。     

重组PcDNA3.1-hBMP-2转染骨髓基质干细胞及复合异种骨支架体外构建组织工程骨

目的：构建人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein,，hBMP-2)真核表达载体PcDNA3．1-hBMP-2，转染兔骨髓基质干细胞(bane marrow stromal cells，BMSCs)，种植去抗原牛松质骨(bovine cancellous bone，BCB)支架体外构建组织工程骨。方法：蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达，碱性磷酸酶(ALPase)活性检测分析基因转染对细胞分化的影响。然后将转染后细胞接种到BCB支架上，扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果：转染后，BMSCs表达BMP-2，ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀，伸展良好。结论：在脂质体介导下，BMP-2基因可导入细胞且稳定表达基因产物促进自身增殖分化，转染后细胞在支架材料上贴附生长良好，为进一步应用携带BMP-2基因的人工骨修复骨缺损奠定了实验基础。     

负载碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白-12基因的兔脂肪干细胞向成纤维细胞分化的实验研究

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、骨形态发生蛋白(BMP)-12基因序贯转染兔脂肪干细胞向成纤维细胞分化的可能性。方法2017年1月至2018年12月,原代培养兔脂肪干细胞(取自新西兰大耳兔颈背部皮下脂肪),细胞表面抗原CD44、CD49d、CD106检测结合成骨细胞诱导分化对培养的细胞进行鉴定,脂质体介导的方法序贯转染BMP-12和bFGF基因,蛋白质印迹法(Western blot)检测目的基因BMP-12和bFGF蛋白的表达;实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测转染细胞Ⅰ型胶原和弹性蛋白RNA的表达情况。符合正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示,应用单因素方差分析比较组间差异。结果兔脂肪组织中分离出来的脂肪间充质干细胞(ADSCs)CD44、CD49d表达阳性,CD106表达呈阴性。Western blot检测筛选后的ADSCs稳定表达BMP-12(0.229±0.005)和bFGF(0.208±0.019)蛋白(F=120.221,P<0.05),差异有统计学意义。双基因转染的ADSCsⅠ型胶原(2.250±0.007,F=340.103,P<0.05)和弹性蛋白(1.807±0.008,F=107.314,P<0.05)的mRNA表达最高,差异均有统计学意义。结论pcDNA3.1+绿色荧光蛋白(GFP)-BMP-12和pcDNA3.1+红色荧光蛋白(RFP)-bFGF可以促进ADSCs向成纤维细胞分化,可能在组织工程技术修复韧带损伤中具有重要作用。