吉西他滨耐药人胰腺癌细胞株的建立及其与肿瘤干细胞的相关性研究

目的 建立吉西他滨耐药人胰腺癌细胞株SW1990/GZ,并探讨SW1990/GZ和胰腺癌肿瘤干细胞的相关性.方法 应用间歇浓度梯度倍增法建立吉西他滨耐药人胰腺癌细胞株SW1990/GZ;倒置显微镜下观察细胞形态;MTT法计算耐药指数(RI);荧光定量PCR检测ABCB1、ABCC1及ABCG2基因的表达水平;裸鼠皮下种植瘤试验观察SW1990和SW1990/GZ的成瘤能力;流式细胞仪通过侧群细胞(SP)法和表面特异抗原标记法(CIM4+CD24+)检测肿瘤干细胞含量.结果 在形态学上,SW1990/GZ较SW1990发生明显改变;SW1990/GZ的耐药指数是亲代SW1990的77.2倍;与亲代SW1990相比,耐药株SW1990/GZ中ABCB1、ABCC1及ABCG2的表达水平明显增高(P<0.01),裸鼠皮下成瘤能力增强(P<0.01);耐药株SW1990/GZ中SP细胞比例为(11.0±1.0)%,亲代SW1990中SP细胞比例为(4.6±0.9)%,CD44+CD24+细胞在两者中的比例分别为(8.7±0.8)%和(1.1±0.4)%(P<0.01).结论 吉西他滨耐药胰腺癌细胞株SW1990/GZ能高效富集胰腺癌肿瘤干细胞,CD44与胰腺癌获得性耐药关系密切,可能为克服胰腺癌获得性耐药提供新的治疗靶点.     

葡萄糖神经酰胺合成酶基因在人胰腺癌细胞SW1990及其耐药亚株中的表达和意义

目的探讨葡萄糖神经酰胺合成酶（glucosylceramide synthase,GCS）基因在人胰腺癌细胞SW1990及其耐药亚株中的表达和意义。方法体外培养人胰腺癌细胞SW1990和其耐药亚株SW1990／FU、SW1990／ADM、SW1990／GEM,以细胞活性测定（CCK-8法）检测耐药亚株的耐药指数,相对定量荧光实时PCR（RT—PCR）法检测GCS mRNA的表达,免疫印迹法检测GCS蛋白表达水平。结果与亲本株相比,SW1990／FU、SW1990／ADM、SW1990／GEM的耐药指数分别为339．7、11．9、56．6。RT—PCR和免疫印迹检测结果显示亲本株和耐药亚株均有GCS mRNA和蛋白的表达,GCS mRNA在3株耐药亚株中的表达均比亲本株有增高趋势,且SW1990／ADM、SW1990／GEM的GCS蛋白表达水平较亲本株升高,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论GCS基因在人胰腺癌细胞株SW1990和其3株耐药亚株中表达阳性,GCS蛋白在SW1990／ADM、SW1990／GEM中呈高表达,表明GCS可能参与胰腺癌耐药株细胞对ADM、GEM的耐药。     

白细胞介素6对人胰腺癌细胞上皮间质转换的影响及机制探讨

目的 应用白细胞介素6(IL-6)作用于人胰腺癌细胞株SW1990、Capan-2和沉默STAT3基因的SW1990细胞,观察细胞上皮间质转换相关基因的变化并探讨其机制.方法 使用IL-6作用人胰腺癌细胞株SW1990、Capan-2和沉默STAT3基因的SW1990细胞.MTT法检测细胞增殖.荧光定量PCR、Real-time PCR、Western blot检测STAT3、p-STAT3、Snail、Twist和E-cadherin基因mRNA和蛋白表达.体外侵袭实验检测细胞的侵袭能力.结果 100μg/L IL-6作用人胰腺癌细胞株后,细胞增殖能力增强(P＜0.05).Western blot显示P-STAT3的表达增加;荧光定量PCR、Real-time PCR、Western blot显示Snail mRNA和蛋白表达明显升高(P＜0.05);E-cadherinmRNA和蛋白表达明显降低(P＜0.05);细胞侵袭能力增强.而IL-6作用沉默STAT3基因的SW1990细胞,Snail和E-cadherin mRNA和蛋白表达均无明显改变.结论 IL-6可能通过激活STAT3信号转导通路,上调Snail和下调E-cadherin基因表达,促进胰腺癌细胞上皮间质转换,进而增强侵袭能力.     

胰腺癌细胞株耐药与凋亡相关基因的改变

目的探讨凋亡相关基因的改变与胰腺癌细胞耐药的关系。方法利用含有18000条人类基因的cDNA基因芯片对人胰腺癌细胞株SW1990及其耐药细胞亚株SW1990/FU和SW1990/ADM间的差异表达基因进行筛选。结果人胰腺癌细胞株SW1990与耐药细胞亚株SW1990/FU和SW1990/ADM间的共同差异表达基因有170条,其中6条与细胞凋亡相关。结论凋亡相关基因hSiah2、TIA1、CDC2、PDCD2、MAPK6及MAP4K3可能参与了胰腺癌耐药过程的发生,可能成为新的胰腺癌耐药相关基因。     

Hedgehog信号通路对胰腺癌细胞增殖的影响

目的 研究特异性阻断hedgehog信号通路对人胰腺癌Mia PaCa-2细胞增殖的影响.方法 用Western blot方法检测7种胰腺癌细胞系中hedgehog信号蛋白表达情况,筛选出hedgehog通路活化明显的Mia PaCa-2细胞系进行研究;应用特异性hedgehog通路阻断剂KAAD-cyclopamine阻断Mia PaCa-2细胞的hedgehog信号通路,Western blot方法检测Gli1蛋白表达变化;MTT法检测阻断hedgehog信号通路对胰腺癌细胞增殖的影响;RT-PCR方法检测胰岛素样生长因子2(IGF2)mRNA表达的变化.结果 KAAD-cyclopamine处理后hedgehog信号通路中关键效应蛋白Gli1表达水平明显下调(P=0.032);KAAD-cyclopamine明显抑制胰腺癌Mia PaCa-2细胞增殖,其作用呈剂量及时间依赖性;阻断hedgehog信号通路后,胰腺癌细胞中胰岛素样生长因子2(IGF2)mRNA表达水平下调(P=0.037).结论 Hedghog信号通路异常活化参与促进胰腺癌细胞增殖;特异性阻断hedgehog信号通路后胰腺癌细胞增殖明显受抑制,其部分机制可能通过下调IGF2表达水平实现.     

维拉帕米逆转胰腺癌化疗耐药的研究

目的　探讨多药耐药蛋白P 170拮抗剂维拉帕米对胰腺癌细胞株化疗耐药的逆转作用。方法　采用RT PCR法对胰腺癌细胞株SW 1990和CAPAN 1中多药耐药基因MDR1mRNA的表达进行半定量分析 ;罗丹明外排试验检测胰腺癌细胞株中P 170的功能 ;MTT比色法评估胰腺癌细胞株对化疗药物的敏感性 ,并比较单纯化疗与化疗联合维拉帕米对其的疗效差异。结果　RT PCR检测结果显示MDR1mRNA在SW 1990中的表达丰度为 0 5 75 0± 0 0 76 4 ,在CAPAN 1中的表达丰度为 0 186 4± 0 0 5 36 ,两者具有显著差异 (P <0 0 1)。罗丹明外排试验表明 :SW1990阳性细胞百分数明显低于CAPAN 1(P <0 0 1) ;维拉帕米可使SW 1990阳性细胞百分数明显增加 (P <0 0 1)。MTT结果表明 :SW1990较CAPAN 1对ADM、MMC耐药 ;维拉帕米可部分逆转其对ADM和MMC的耐药性。结论　MDR1可能参与胰腺癌细胞株化疗耐药 ;中等剂量的维拉帕米联合化疗可逆转具有MDR1表型的人胰腺癌细胞株对ADM和MMC的耐药现象。     

Shh及Gli-1蛋白在人增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞中的表达及意义

目的研究Hedgehog信号通路中分子Shh及Gli-1蛋白在人增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞中的表达,探讨此通路在增生性瘢痕形成中的作用和意义。方法应用免疫蛋白印记法(western blot)及免疫细胞化学检测15例人增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞中Shh、Gli-1蛋白的表达情况。结果(1)Western blot检测结果显示,Shh和Gli-1蛋白在增生性瘢痕及正常皮肤成纤维细胞中均有表达,二者在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达量(0.640±0.093和0.560±0.120)均比正常成纤维细胞的表达量(0.330±0.023和0.340±0.050)高,其差异具有统计学意义(P0.05);(2)免疫细胞化学染色结果显示,Shh及Gli-1蛋白在增生性瘢痕及正常皮肤成纤维细胞均有阳性表达,但在增生性瘢痕成纤维细胞组织中的表达明显高于止常皮肤成纤维细胞,其差异均有统计学意义(P0.05)。结论增生性瘢痕成纤维细胞中,Shh及Gli-1蛋白呈现高表达,提示Shh信号通路异常激活可能在增生性瘢痕发生过程中起到了重要作用。     

多药耐药相关基因及其蛋白在介导胰腺癌细胞原发性耐药中的作用及调控

目的 检测多药耐药相关基因（MDR1）及其蛋白（P-gP）在胰腺癌细胞株的表达,初步探讨胰腺癌发生先天性耐药的机理。方法 选择8株人胰腺癌细胞株,采用RT-PCR方法检测MDR1mRNA在胰腺癌细胞中的表达;通过免疫细胞化学方法检测P-gP的表达;以流式细胞仪检测胰腺癌细胞对罗丹明的外排情况,评价P-gP泵功能;最后通过P-gP抑制物维拉帕米与化疗药物联合应用,检测其对胰腺癌细胞的杀伤作用。结果 MDR1mRNA在胰腺癌细胞株SW1990中的表达最高,除PCT-2未检测到MDR1的表达外,其余6株细胞均有MDR1的微弱表达;免疫细胞化学染色结果证实P-gP在SW1990中的表达明显高于其他细胞株。57．9％±5．4％的SW1990细胞内有罗丹明蓄积,而在P-gP阴性对照细胞中,99．5％±3．3％的细胞内存在罗丹明的积聚,两者差异有统计学意义（P〈0．05）。P-gP抑制物维拉帕米与阿霉素或表阿霉素联合应用时可以部分逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。结论 MDR1及P-gP在人胰腺癌细胞中存在一定量的表达;维拉帕米联合阿霉素可以明显抑制P-gP阳性细胞的生长。     

microRNA-34a增加奥沙利铂对结肠癌细胞敏感性的实验研究

目的:构建奥沙利铂耐药结肠癌细胞株(SW480/ADR),观察miRNA-34a对SW480/ADR细胞奥沙利铂敏感性的影响。方法:使用浓度梯度法构建奥沙利铂耐药细胞株(SW480/ADR)。miR-34a慢病毒转染SW480/ADR细胞,MTT法检测细胞增殖,Real-time PCR定量检测miR-34a表达,Western blot检测蛋白表达。结果:SW480、SW480/ADR和过表达miR-34a-SW480/ADR细胞miR-34a的2-△△Ct值为0.15±0.03、0.12±0.02和0.74±0.13,各组间差异有统计学意义(P<0.01)。奥沙利铂对SW480、SW480/ADR和过表达miR-34a-SW480/ADR细胞的IC50值分别为8.64±1.54、24.16±3.72和11.52±1.22μmol/L,各组间差异有统计学意义(P<0.01)。SW480、SW480/ADR和过表达miR-34a-SW480/ADR细胞OCT-4蛋白的相对灰度值为0.096±0.014、0.352±0.053和0.136±0.017,各组间差异有统计学意义(P<0.01)。结论:miR-34a可以显著降低结肠癌奥沙利铂耐药细胞OCT-4蛋白表达,逆转结肠癌细胞对奥沙利铂的耐药。     

吉西他滨诱导胰腺癌细胞ABCG2表达其化疗耐药的关系研究

目的：探讨吉西他滨诱导胰腺癌细胞ABCG2的表达及与其化疗耐药的关系。 方法：吉西他滨不同浓度、不同时间作用胰腺癌SW1990细胞后,用CCK-8法检测细胞的增殖抑制率,并计算吉西他滨不同作用时间的半数抑制浓度（IC50）;根据IC50值选择合适浓度的吉西他滨,作用SW1990细胞24、48、72 h后,用流式细胞仪检测细胞凋亡率,并用Western blot和RT-PCR法检测ABCG2蛋白与mRNA的表达。 结果：吉西他滨作用后,SW1990细胞增殖明显抑制,并呈浓度与时间依赖性,但IC50值呈时间依赖性增加（均P<0.05）;3.9 mg/mL吉西他滨作用24、48、72 h后,SW1990细胞总凋亡率逐渐增加,但晚期凋亡率呈降低趋势,ABCG2蛋白与mRNA的表达明显升高,并呈时间依赖性（均P<0.05）。 结论：吉西他滨能抑制胰腺癌细胞SW1990的增殖,但作用呈时间依赖性减弱,这可能与其诱导ABCG2上调表达有关。     

自噬在吉西他滨诱导胰腺癌细胞凋亡中的作用

目的:研究自噬在吉西他滨(gemcitabine,Gem)诱导胰腺癌细胞SW1990凋亡中的作用,并以氯喹特异性抑制自噬,以探讨其可能机制。方法:采用CCK8法检测Gem对胰腺癌细胞增殖的影响,并用实时定量PCR检测自噬相关基因LC3的表达,以p62免疫荧光染色检测细胞内自噬泡,通过Western印迹法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin 1的表达,并用AnnexinⅤ/PI流式细胞方法检测Gem诱导后细胞凋亡的变化。进一步通过氯喹抑制自噬,检测自噬抑制前后细胞增殖、自噬及凋亡的变化。结果:Gem对胰腺癌细胞SW1990增殖具有部分抑制作用,Gem作用能迅速激活细胞自噬从而产生耐药。LC3的mRNA表达升高1.4~2.2倍(P<0.05),LC3-Ⅱ蛋白水平升高1.5~2.7倍(P<0.05)。Gem和氯喹联合用药组较Gem单药组细胞凋亡蛋白Caspase-3表达升高,细胞存活率从64.3%±3.1%降低为35.2%±3.4%(P<0.05)。结论:自噬在Gem诱导胰腺癌细胞凋亡的过程中可能起到保护作用,氯喹抑制自噬后可增强Gem的促凋亡作用。     

丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1与胰腺癌细胞获得性耐药的关系

目的 探讨丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸酶1（MKP-1）在介导胰腺癌耐药细胞株SWl990／Fu产生获得性耐药过程中的可能机制。方法 采用Northern印迹杂交和Western蛋白免疫印迹杂交方法,检测MKP-1在体外诱导建立的人胰腺癌耐药细胞株SWl990／Fu、亲本细胞株SWl990和胰腺癌细胞株MiaPaCa-2中的表达,分析MKP-1在SW1990／Fu产生获得性耐药前后的变化。结果 Northern印迹杂交结果显示,在SWl990／Fu、SWl990和MiaPaCa~细胞株中均检测到2400bp的MKP-1mRNA,MKP-1在SWl990／Fu的表达水平明显低于SWl990和MiaPaCa-2。在蛋白水平上,Western蛋白免疫印迹杂交结果也表明,与SWl990和MiaPaCa4相比,MKP-1蛋白在SWl990／Fu细胞中的表达水平明显降低。结论 MAPK家族的关键调节酶MKP-1可能参与SWl990／Fu获得性耐药的产生,推测细胞信号转导系统的改变可能是导致胰腺癌细胞产生获得性耐药的机制之一。     

凋亡抑制蛋白2在胰腺癌中的表达及其与化疗耐药的关系

目的 观察细胞凋亡抑制蛋白2(c-IAP2)在胰腺癌组织中的表达,探讨c-IAP2表达与胰腺癌细胞对化疗药物耐药性的关系.方法 收集胰腺癌标本32例,应用免疫组织化学染色法观察c-IAP2在胰腺癌及癌旁正常胰腺组织中的表达;体外培养胰腺癌细胞PANC-1,间歇浓度递增法诱导胰腺癌细胞株PANC-1对吉西他滨(Gem)的耐药,噻唑蓝(MTT)检测处理前后细胞对Gem的药物敏感性,免疫荧光和免疫印迹检测c-IAP2蛋白表达水平.结果 c-IAP2在胰腺癌组织均有表达(32/32,100.0%)、癌旁正常胰腺组织(8/18,44.4%)中有表达,胰腺癌表达水平显著强于癌旁正常胰腺组织.c-IAP2的表达强度在不同分化程度的肿瘤组织中的差异有统计学意义(P<0.05).药物培养3个月后,PANC-1对Gem的半数有效浓度(IC50)由(6.03±0.27)mg/L升高至(41.60±1.14)mg/L(P<0.05),免疫荧光和免疫印迹结果显示耐药亚株c-LAP2蛋白表达水平较亲本株升高,差异有统计学意义(P<0.05).结论 C-IAP2在胰腺癌分化程度和对吉西他滨耐药过程中有一定作用.     

胰腺癌阿霉素耐药细胞株SW1990/ADM的建立及其耐药机理研究

目的　建立人胰腺癌阿霉素 (ADM )耐药细胞株SW 1990 /ADM ,探讨其耐药机理。方法　采用ADM体外浓度梯度倍增法诱导培养人胰腺癌细胞株SW 1990 10个月 ,获得耐药细胞株SW 1990 /ADM ,脱药培养 2个月后检测其生物学性状、药物敏感性及多药耐药基因mdr1的功能及表达情况。结果　与亲本细胞株SW 1990相比 ,SW1990 /ADM在形态学上发生了一系列变化 ;对包括ADM在内的多种化疗药物均表现出一定的耐药性 ,其对ADM、丝裂霉素、氟尿嘧啶和健择的耐药指数分别达到 4 9.6 0、7.2 5、3.80和 1.2 5 ;其mdr1mRNA的表达亦明显高于亲本细胞株SW 1990 (P<0 .0 1)。结论　体外浓度梯度倍增法可建立稳定传代的人胰腺癌耐药细胞株SW1990 /ADM。其耐药性与mdr1的表达呈正相关。     

白细胞介素6促进人胰腺癌细胞的侵袭及机制探讨

目的 应用白细胞介素6(IL-6)作用于人胰腺癌细胞株SW1990和Capan-2,观察侵袭能力的变化并探讨其机制.方法 使用IL-6处理人胰腺癌细胞株SW1990和Capan-2,MTT法检测细胞增殖,免疫细胞化学和Western印迹检测P-STAT3的表达,荧光定量PCR、Western印迹检测VEGF、MMP-2 mRNA和蛋白表达,体外侵袭检测细胞的侵袭能力.结果 IL-6 100 μg/L作用人胰腺癌细胞株后,细胞增殖能力增强(P＜0.05);Western印迹和免疫细胞化学显示P-STAT3的表达增加;荧光定量PCR、Western印迹显示VEGF、MMP-2的mRNA和蛋白表达明显升高(P＜0.05);细胞侵袭能力增强.结论 IL-6通过激活STAT3信号转导通路,上调MMP-2和VEGF表达,增强胰腺癌细胞侵袭能力.

Abstract：

Objective To investigate the effects and mechanism of IL-6 on invasion and metastasis of human pancreatic cancer cells. Methods IL-6 was added into the culture media of human pancreatic cancer cells Capan-2 and SW1990. Cell growth was measured by MTT assay. Western blot and immunocytochemistry were performed to detect Phosphorylated STAT3 (P-STAT3) protein. VEGF and MMP-2 mRNA and protein expression were examined using fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot, respectively. The invasion ability of SW1990 and Capan2 cells was determined by cell invasion assay in vitro. Results 100 ng/mL IL-6 significantly promoted growth and invasion ability of Capan-2 and SW1990 cells (P＜0.05). The use of IL-6 not only markedly increased the protein expression of P-STAT3, VEGF and MMP-2, but also greatly increased the mRNA expression of MMP-2 and VEGF. Conclusions STAT3 signal transducer pathway activation with IL-6 can promote the invasion ability of pancreatic cancer cells in vitro through up-regulation of MMP-2 and VEGF expression. STAT3 signal transducer may provide a novel therapeutic target for the treatment of pancreatic cancer.     

RNA干扰抑制胰腺癌细胞XIAP表达对化疗敏感性的影响

目的 ：探讨运用载体介导的RNA干扰技术对X-连锁的凋亡抑制蛋白的抑制效率，以及观察抑制XIAP后胰腺癌细胞对化疗药物敏感性的变化。方法 ：应用PBSHHI质粒构建针对XIAP的RNA干扰载体，转染胰腺癌细胞系SW1990;用RT-PCR和Western blot检测XIAP的抑制效率，以gemcitabine处理细胞，流式细胞仪和荧光显微镜观察细胞凋亡的变化;分析XIAP的表达与细胞凋亡之间的关系。结果 ：成功构建4个XIAP的RNA干扰载体，其中2个载体对XIAP的瞬时抑制效率达50％以上。XIAP被抑制后，细胞对化疗药物诱导的凋亡敏感性增强 ( P <0.05),XIAP的表达水平与细胞的凋亡指数之间呈负相关性( r =-0.809, P <0.05)。结论 ：运用针对XIAP的RNA干扰载体可以有效地抑制XIAP的表达，提高胰腺癌细胞对化疗药物的敏感性。     

大黄素提高胰腺癌细胞化疗敏感性的机制研究

目的 探讨大黄素能否提高胰腺癌细胞化疗敏感性及其作用机制.方法 设立对照组(正常人皮肤成纤维细胞/胰腺癌BXPC-3细胞),顺铂组(5 mg/L),吉西他滨组(0.5 μmol/L),大黄素与顺铂联合组(50 μmol/L、5 mg/L),大黄素与吉西他滨联合组(50 μmol/L、0.5 μmol/L).应用MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,RT-PCR法检测不同细胞株中多药耐药相关蛋白1(MRP1)、多药耐药相关蛋白2(MRP2)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)和P-糖蛋白(P-gp)mRNA的表达.采用t检验比较两组差异.结果 顺铂组胰腺癌BXPC-3细胞的存活率和凋亡率分别为62.44%±3.42%和27.10%±4.24%,大黄素与顺铂联合组胰腺癌BXPC-3细胞的存活率和凋亡率分别为30.53%±0.05%和66.33%±9.37%,两组比较,差异有统计学意义(t=13.20,5.35,P<0.05).吉西他滨组胰腺癌BXPC-3细胞的存活率和凋亡率分别为79.82%±2.83%和13.48%±1.65%,大黄素与吉西他滨联合组胰腺癌BXPC-3细胞的存活率和凋亡率分别为45.65%±2.46%和62.74%±10.18%,两组比较,差异有统计学意义(t=12.89,8.28,P<0.05).顺铂组和大黄素与顺铂联合组正常人皮肤成纤维细胞存活率比较,差异无统计学意义(t=2.08,P>0.05).吉西他滨组和大黄素与吉西他滨联合组正常人皮肤成纤维细胞存活率比较,差异无统计学意义(t=0.64,P>0.05).在胰腺癌BXPC-3细胞中,只能检测到MRP1 mRNA的表达,未能检测到MRP2、BCRP、P-gp mRNA的表达.顺铂组胰腺癌BXPC-3细胞的MRP1 mRNA表达水平显著降低,而大黄素与顺铂联合组胰腺癌BXPC-3细胞的MRP1 mRNA表达水平则进一步下调.结论 大黄素能够提高胰腺癌细胞对顺铂的敏感性,其机制与下调的MRP1 mRNA表达有关.