血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白7在细胞分化中的协同作用

目的：研究rhVEGF和rhBMP-7对成骨细胞分化能力的影响.方法：取大鼠颅盖骨组织块,采用改良组织块混合酶消化法培养成骨细胞,将不同浓度的rhVEGF和rhBMP-7加入第四代成骨细胞的培养基继续进行细胞培养,用碱性磷酸酶试剂盒检测定细胞在第1、3、5天的磷酸酶的活性,分析不同浓度的rhVEGF和rhBMP-7对成骨细胞分化的影响.结果：rhVEGF和rhBMP-7能促进成骨细胞的分化,其中,3.125ng/mlrhVEGF和50.000ng/ml rhBMP-7单独或者两者联合作用并于第3天时,对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响最明显.结论：一定剂量的rhVEGF和rhBMP-7可明显促进成骨细胞的分化.     

MTT法观察补肾健骨汤对大鼠成骨细胞增殖的影响

目的采用MTT法观察中药补肾健骨汤载药血清对大鼠成骨细胞增殖的影响.方法将补肾健骨汤口饲大鼠,每日1次,连续7 d,于末次给药后2 h采血,分离获得含药血清,加入成骨细胞培养液中,连续培养10 d,从第2天开始用MTT法测定光密度值,探讨该方剂对成骨细胞增殖的影响.结果大鼠成骨细胞体外培养在对数生长期第3天至第9天载药血清组明显高于对照组.结论用MTT法观察补肾健骨汤载药血清对大鼠成骨细胞增殖有明显促进作用.     

淫羊藿苷对人成骨细胞增殖及OPG蛋白表达的实验研究

目的：建立体外培养人成骨细胞系,观察淫羊藿苷对人成骨细胞增殖的影响,以及对人成骨细胞内骨保护素（Osteoprorotegerin,OPG）蛋白表达的影响,探讨淫羊藿苷促进人成骨细胞骨形成的可能作用机制。方法：将手术中取得的人股骨头松质骨骨片,使用酶消化法进行培养,取生长良好的第3代人成骨细胞进行实验。实验分为4组,对照组给予15%NCS-DMEM-F12（1：1）培养液培养;淫羊藿苷组分别于正常培养液内添加终浓度为10-6、10-8、10-10mol/L淫羊藿苷。噻唑蓝比色法（MTT）分别在培养1、3、5、7、9d后观察各组人成骨细胞的增殖情况,用蛋白免疫印迹方法（in-cell western blot）测定各组培养8、10、12d后人成骨细胞内OPG蛋白的表达情况。采用重复测量的方差分析方法,比较各组间在不同时间点的作用差异。结果：MTT结果,淫羊藿苷组具有促进人成骨细胞增殖的作用,并呈明显的量效关系,即随着淫羊藿苷浓度的增高,其促人成骨细胞增殖的能力增强,以10-6mol/L淫羊藿苷组（0.402±0.033）促成骨细胞增殖的作用最显著,与对照组（0.268±0.031）比较差异有统计学意义（P〈0.05）。在时效关系的研究中,随着培养天数的延长,人成骨细胞的量逐渐增加,人成骨细胞于第5天时进入快速生长期,第7天进入平台期;淫羊藿苷组从第5天开始促进人成骨细胞的增殖,第7、9天仍然具有明显的促成骨细胞增殖的作用,以第9天促增殖作用最强。其中,第9天10-6mol/L淫羊藿苷组（0.402±0.033）与对照组（0.268±0.031）比较有统计学意义（P〈0.01）。OPG表达结果,对照组人成骨细胞培养至第8天时检测到OPG蛋白的表达,表达量为1.01±0.08,第12天达到表达高峰为1.80±0.10,两个值比较有统计学差异（P〈0.05）;在观察的不同天数内,不同浓度的淫羊藿苷组人成骨细胞内OPG蛋白表达低于对照组,且随着淫羊藿苷浓度的降低,OPG蛋白的表达量逐渐降低,差异有统计学意义（P〈0.05）;干预12d,10-6mol/L淫羊藿苷组OPG量（1.67±0.13）和10-8mol/L淫羊藿苷组OPG量（1.64±0.05）比较,无统计学差异（P〉0.05）。结论：淫羊藿苷促人成骨细胞骨形成能力的作用途径之一,是通过提高人成骨细胞的增殖能力而实现。     

鼠颅盖骨成骨细胞体外培养及ALP免疫组化法鉴别纯化

体外培养成骨细胞，是研究力学环境，电磁刺激及药物治疗等理化因素对骨生长代谢影响机制的一种基本方法，如何消除和减少成纤维细胞的污染，鉴别纯化成骨细胞，是该方法应用中的主要困难。本实验中，观察了ＳＤ乳鼠顶骨组织学结构；建立起体外培养乳鼠顶骨成骨细胞模型；应用细胞化学和免疫组织化学技术，对培养成骨细胞进行定性和定位将其纯化达９０％以上，形态学观察证实，成骨细胞在体外培养４０天左右时，在编织骨样组织形成，     

脊髓神经元培养中X线照射的时机筛选研究

目的　通过在脊髓神经元培养中应用X线照射 ,选择最佳时机 ,从而抑制或杀伤非神经元细胞增殖 ,提高神经元存活率 ,促进其生长、分化。方法　对E18大鼠胚胎脊髓神经元培养 ,在培养当天 ,第 1、2、3、4天行X线照射 ,剂量为 2Gy。在培养 2周时 ,采用链霉素抗生素蛋白 过氧化酶连接法 (SP)免疫组织化学方法显示神经元特异性烯醇化酶 (NSE)作为判定照射效果的依据。结果　在培养第 2天时给予 2Gy的X线照射 ,NSE阳性细胞数最高 ,为 (3 5 3± 42 )个 ,第 2天照射组明显多于其他组 (P <0 .0 1)。结论　在培养第 2天时给予 2Gy的X线照射 ,大鼠胚胎脊髓神经元存活细胞数明显高于其他培养时间。     

X-Ray对大鼠皮肤伤口愈合生物力学研究

目的通过不同时间点的X-Ray照射大鼠伤口皮肤,利用生物力学,寻找X-Ray对它们影响的最明显时间点,从而为瘢痕疙瘩和增生性瘢痕切除术后何时开始放射治疗的最佳时间点提供一个理论根据.方法本实验采用纯系SD雌性大鼠为实验动物,在低背部伤口上分别于手术第1、4天,第4、7天,第7、10天,和第10、13天,共4组行X-Ray照射,每次照射6GY,两次共12GY,并分别于手术第7、10、20、40天取材,利用拉力机(Inston)对伤口皮肤进行极限应力强度测试.结果通过对连续X-Ray照射后伤口生物力学研究,观察到X-Ray对皮肤伤口的抑制作用以手术7天内影响最大,第7～13天也明显于对照组.手术后第7天拆线未见伤口裂开现象.结论通过本实验研究提出了瘢痕疙瘩,增生性瘢痕切除后,在行放射治疗时应以1周内开始为宜.     

骨康含药血清对成骨细胞PDGF-AA表达影响的实验研究

目的 观察中药骨康含药血清对新生大鼠成骨细胞血小板衍生生长因子-AA（PDGF—AA）基因表达的调控作用。方法 将实验动物随机分成中药组、罗盖全组和蒸馏水组3组，通过体外分离和培养成骨细胞体系，运用逆转录法测定含药血清对成骨细胞PDGF-AA mRNA表达的影响。结果 用10％的血清培养成骨细胞第7d时，与空白血清组相比，骨康含药血清组和罗盖全含药血清组对成骨细胞PDGF—AA mRNA表达的平均影响率分别为149．4％和177．7％。结论 中药骨康含药血清能明显增强成骨细胞PDGF—AA mRNA的表达。     

三七总甙对成骨细胞增殖、分化及0PG表达影响的研究

目的 观察不同剂量的三七总甙对体外培养大鼠成骨细胞增殖、分化及OPG表达的影响，探索体外作用的机制和最佳剂量。方法 第2代培养的成骨细胞分别加入终浓度为0μg／ml、10μg／ml、50μg／ml、100μg／ml的三七总甙，观察细胞生长、钙结节形成情况，碱性磷酸酶(ALP)染色、分泌量检测，骨钙素(OCN)检测，MTT法观察成骨细胞增殖，免疫组化SP法结合阳性细胞计数法检测成骨细胞OPG表达。结果 成骨细胞在7d可铺满瓶壁，30d可形成钙结节，三七总甙可促进成骨细胞的增殖ALP、OCN的分泌，以50μg／ml时作用明显。三七总甙可促进成骨细胞OPG的表达，在50μg／ml时作用明显。结论 三七总甙可促进大鼠成骨细胞的增殖、分化，促进成骨细胞OPG的表达，以50μg／ml时作用明显。     

含药血清对体外培养成骨细胞的影响

目的 研究中药骨康吸收后不同浓度血清对离体大鼠成骨细胞增殖的影响及其对成骨细胞分泌IL-6的影响。方法 采用胶原-胰蛋白酶消化法获得新生大鼠的成骨细胞，然后以中药骨康吸收后血清，加入体外培养成骨细胞中进行培养，MTT法测成骨细胞增殖，ELISA法测培养上清中IL-6含量。结果 发现中药吸收后血清能促进成骨细胞的增殖和分化，各种浓度中以正常剂量药物灌胃后5h取血清含10％药物浓度最佳。同时，新生大鼠体外培养成骨细胞能够分泌IL-6，体外培养成骨细胞在培养后9d左右，IL-6的分泌达到高峰值，随后分泌IL-6的能力逐步下降，中药骨康含药血清可作用于成骨细胞，使其分泌IL-6的能力下降。结论 中药骨康含药血清能够促进成骨细胞的增殖与分化，从而促进骨形成同时可抑制成骨细胞分泌IL-6，这可能是中药骨康抑理骨吸收的机制之一。     

X-线对大鼠皮肤伤口愈合过程中成纤维细胞影响的组织学研究

本实验采用纯系 SD 雌性大鼠为实验动物通过对连续 X-线照射后伤口皮肤组织学研究,观察到 X-线对成纤维细胞的分裂、增殖的抑制作用以手术7天内影响最大。7天～13天也明显于对照组。因此,提出了瘢痕疙瘩、增生性瘢痕切除后,在行放射线照射时应以第4天～7天,并适当前移为宜。     

X-Ray对大鼠皮肤伤口愈合生物力学研究

目的　通过不同时间点的X -Ray照射大鼠伤口皮肤 ,利用生物力学 ,寻找X -Ray对它们影响的最明显时间点 ,从而为瘢痕疙瘩和增生性瘢痕切除术后何时开始放射治疗的最佳时间点提供一个理论根据。方法　本实验采用纯系SD雌性大鼠为实验动物 ,在低背部伤口上分别于手术第 1、4天 ,第 4、7天 ,第 7、10天 ,和第 10、13天 ,共4组行X -Ray照射 ,每次照射 6GY ,两次共 12GY ,并分别于手术第 7、10、2 0、40天取材 ,利用拉力机 (Inston)对伤口皮肤进行极限应力强度测试。结果　通过对连续X -Ray照射后伤口生物力学研究 ,观察到X -Ray对皮肤伤口的抑制作用以手术 7天内影响最大 ,第 7～ 13天也明显于对照组。手术后第 7天拆线未见伤口裂开现象。结论　通过本实验研究提出了瘢痕疙瘩 ,增生性瘢痕切除后 ,在行放射治疗时应以 1周内开始为宜     

X线对大鼠皮肤伤口愈合过程胶原纤维影响的组织学研究

本实验采用纯系ＳＤ雌性大鼠为实验动物，在背下部伤口上分别于手术后第１，４天，第４，７天，第７，１０天和第１０，１３天，共４组行Ｘ线照射，每次照射６ＧＹ，两次共１２ＧＹ，并分别于手术后第７，１０，２０，４０天取材，在光镜下观察伤口胶原形态学变化。以ＩＢＡＳ－２０００（Ｏｐｔｏｎ）计算机图像分析系统分析胶原密度变化。光镜下观察：胶原纤维排列紊乱，并较细；照射组的胶原平均光密度明显小于对照组。本实验研究提示：通过连续Ｘ线照射后伤口皮肤胶原纤维合成和代谢的抑制作用以手术后第７天内影响最大，第７～１３天的作用也明显高于对照组。通过本实验研究提出了瘢痕疙瘩、增生性瘢痕切除后，在行放射线照射时应以第４，７天为中心，指出早期照射的重要性     

辛伐他汀体外促进骨形成作用的初步研究

目的 研究辛伐他汀(Simvastatin)对成骨细胞分化、增殖及骨形成的作用。方法 用RPMI 1640培养液分别对水囊引产胎儿及新生大鼠颅顶骨进行组织培养,并将等量的胎儿或大鼠的颅顶骨骨组织分为实验组(辛伐他汀1μmol/L)和对照组,除动态观察比较不同培养液中成骨细胞的增殖状况外,将培养7d后的颅顶骨组织块制成半薄或超薄病理切片,于光镜下和电镜下进行形态学观察,并用测微尺测量新生骨组织厚度,记录成骨细胞数;同时,对留取的培养液测定其中的碱性磷酸酶(AKP)及骨钙素(BGP)的含量。结果 在培养过程中,可见实验组胎儿和新生大鼠颅骨成骨细胞生长活跃,数量多;对照组成骨细胞生长缓慢,数量少,可见大量成纤维细胞。培养7d后可见实验组胎儿及大鼠颅骨新生骨组织的厚度均明显高于对照组(P<0.01);其单位长度(0.3 mm)新生骨组织内成骨细胞数均明显高于对照组(P<0.01)。透射电镜下可见实验组成骨细胞处于活化状态,胞浆内有丰富的细胞器,少见破骨细胞,而对照组成骨细胞处于衰老状态,细胞器少见,可见大量破骨细胞。实验组培养液中AKP及BGP均明显高于对照组(P<0.01)。结论 辛伐他汀在体外实验中具有促进成骨细胞分化、增殖和促进新骨形成的作用;他汀类药物可作为预防、治疗骨质疏松症的有价值的候选药物。     

辐射对成骨细胞系MC3T3-E1细胞增殖和功能基因表达的影响

目的为了深入了解辐射对成骨细胞的影响,探讨成骨细胞系MC3T3-E1细胞受到辐射后的功能变化。方法将MC3T3-E1细胞体外培养,诱导成骨前体细胞和成骨细胞,经137Csγ射线照射后,用MTT法分析细胞的存活率,用实时定量PCR方法分析ALP、Run X2和M-CSF基因的mRNA表达。结果 MTT实验表明,随照射剂量增加,正常MC3T3-E1细胞生长率明显下降,而经过诱导分化的MC3T3-E1细胞生长率变化越来越不明显。实时定量PCR实验结果表明,经过137Csγ射线照射后,MC3T3-E1细胞的ALP,Run X2和M-CSF基因的mRNA表达出现明显的降低;经过诱导分化为成骨前体细胞的,ALP,Run X2和M-CSF基因的mRNA表达与相应的正常组相比没有明显的规律变化;经过诱导进一步分化成为成骨细胞的,ALP和Run X2表达下降,M-CSF表达呈现升高趋势。结论辐射抑制早期成骨细胞的增殖、发育和分化。随着成骨细胞的分化,辐射对成骨细胞的增殖和生长发育影响减小,但是对成骨细胞发挥调节破骨细胞功能的作用并没有减少。     

成骨因子BMP7在骨膜细胞体外培养中的作用

目的 探讨成骨因子骨形态发生蛋白(BMP7)在骨膜细胞体外培养中的诱导分化作用.方法取材于成人胫骨骨膜,常规细胞培养法行骨膜细胞体外培养,分为实验组和对照组,分别加入BMP7加成骨细胞培养辅助剂和单纯成骨细胞培养辅助剂,相差显微镜观察骨膜细胞形态特征.每组分别在第5、10、15、20天设3个样本,采用ALP试剂盒法及钙结节Von Kossa染色法分别检测成骨细胞特异性标志物ALP和钙结节的表达情况.结果 骨膜细胞在体外生长良好,实验组和对照组形成的成骨细胞增殖良好,形态一致.细胞早期呈梭形,饱满透明,立体感强;分裂期呈立方形或短柱状;后期由长梭形逐渐变成宽梭和不规则形.由BMP7诱导的骨膜细胞的成骨标志物ALP和钙结节染色阳性率明显高于对照组,有统计学意义(P＜0.01).结论 骨膜细胞具有良好的成骨和再生能力,BMP7在体外培养中具有明显增强骨膜细胞分化为成骨细胞的作用.     

青少年特发性脊柱侧凸患者褪黑素信号传导通路的初步研究

目的:了解青少年特发性脊柱侧凸(adolescentid iopathic scoliosis,AIS)患者褪黑素信号传导通路是否存在异常。方法:7例女性AIS患者,年龄13～17岁,平均14.7岁;最大Cobb角40°～80°,平均59.3°,行后路手术时取髂骨组织进行成骨细胞培养,并用碱性磷酸酶染色、骨钙素免疫荧光检测方法对培养细胞进行成骨细胞鉴定。取原代培养的成骨细胞,先采用福斯可林刺激成骨细胞内cAMP升高,然后用不同浓度褪黑素刺激细胞,检测细胞内cAMP水平。结果:碱性磷酸酶染色、骨钙素免疫荧光检测结果均证实所培养细胞表现为成骨细胞特性,所有AIS患者成骨细胞的cAMP的基础水平都很低,在给予福斯可林刺激以后cAMP的水平明显升高,此后再给予生理剂量的褪黑素后,cAMP的水平未见明显下降;给予药理剂量的褪黑素后同样没有观察到cAMP水平明显的下降。结论:AIS患者的褪黑素信号传导通路存在异常。     

三维连通多孔钛表面成骨能力的实验研究

目的：通过体外成骨细胞培养实验,评估单纯连通多孔钛材料和复合类骨磷灰石的连通多孔钛材料表面的成骨能力。方法：先将纯钛粉应用热等静压法制备出单纯连通多孔钛并分成2组（每组50件）,将其中一组按1.5倍模拟体液浸泡法制备出复合连通多孔钛。将两组多孔钛制成标准试件（5mm×5mm×4mm）并均置于24孔板内。取新生SD鼠颅骨的成骨细胞进行原代培养及传代,然后将传代后的成骨细胞接种于24孔板内的两组多孔钛试件中并继续培养。在培养期间进行细胞增殖性测定（MTT法,在培养第1、3、5、7、9天测定）以及碱性磷酸酶活性检测（在培养第7、14、21天测定）。培养7d后对2组多孔钛内的成骨细胞进行扫描电镜观察。结果：2组的MTT吸光值和ALP值均随着时间的延长而增加,但复合多孔钛组在MTT吸光值的增加幅度和速度以及ALP活性均优于单纯多孔钛组（P〈0.05）。培养7d后扫描电镜显示复合连通多孔钛试件内成骨细胞生长活跃,黏附牢靠。结论：三维连通多孔钛表面具备成骨活性,在多孔钛内壁复合类骨磷灰石后,这种成骨活性明显增强,更有利于成骨细胞在材料表面的黏附和增殖。     

人成骨细胞与外周血单核细胞共同培养诱导破骨细胞样细胞

目的 探讨人外周血单核细胞与原代人成骨细胞共同培养体外转化为破骨细胞样细胞的条件，并观察其体外生长，功能情况。方法 分别分离培养人成骨细胞，外周血单核细胞，并在含1，25（OH）2D3（10^-7mol/L），地塞米松（10^-8mol/L)及巨噬细胞集落刺激因子（M－CSF）（25ng/ml)的条件液中共同培养，用相差显微,抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）观察破骨细胞样细胞生长情况，应用扫描电镜（SEM）观察骨片隐窝以反映其功能。结果 共同培养中的单核细胞逐渐融合；TRAP染色阳性多核细胞在第7天明显增多；骨片隐窝呈现多种形态。结论 人原代成骨细胞与人外周血单核细胞共同培养可以诱导出破骨细胞样细胞，但应该选择分化程度较低的细胞以及控制接种密度。     

补肾密骨液对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞增殖的影响

目的 观察补肾密骨液对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞增殖的影响。方法 实验药物与新生大鼠颅骨成骨细胞共同培养３天后，分别采用噻唑蓝比色分析法和＾３Ｈ－胸腺嘧啶苷掺入法两种手段，检测成骨细胞的增殖情况。结果 补肾密骨液呈剂量依赖的方式促进成骨细胞的增殖，１０ｍｇ／Ｌ的补肾密骨液便可明显地促进成骨细胞的增殖，在１０￣１０００ｍｇ／Ｌ的浓度范围内，其促进作用随浓度的升高而增加，并于１０００ｍｇ／Ｌ时达到最     

X—Ray对大鼠皮肤伤口愈合生物力学研究

目的 通过不同时间点的Ｘ－Ｒａｙ照射大鼠伤口皮肤，利用生物力学，寻找Ｘ－Ｒａｙ对它们影响的最明显时间点，从而为瘢痕疙瘩和增生性瘢痕切除术后何时开始放射治疗的最佳时间点提供一个理论根据。方法 本实验采用纯系ＳＤ雌性大鼠为实验动物，在低背部伤口上分别于手术第１、４天，第４、７天，第７、１０天，和第１０、１３天，共４组行Ｘ－Ｒａｙ照射，每次照射６ＧＹ，两次共１２ＧＹ，并分别于手术第７、１０、２０、４０天取材，利用拉力机（Ｉｎｓｔｏｎ）对伤口皮肤进行极限应力强度测试。结果 通过对连续Ｘ－Ｒａｙ照射后伤口生物力学研究，观察到Ｘ－Ｒａｙ对皮肤伤口的抑制作用以手术７天内影响最大，第７～１３天也明显于对照组。手术后第７天拆线未见伤口裂开现象。结论 通过本实验研究提出了瘢痕疙瘩，增生性瘢痕切除后，在行放射治疗时应以１周内开始为宜