布鲁氏菌外膜蛋白的研究进展

布鲁氏菌的外膜包括脂多糖、外膜蛋白和磷脂层。其中外膜蛋白是布鲁氏菌的主要免疫原和保护性抗原。根据分子质量的大小,将外膜蛋白分为3组。第一组有外膜蛋白10 k、18 k、19 k,其中Omp10、Omp16和Omp19为一种脂蛋白。第2组包括36 k～38 k外膜蛋白。第3组包括31 k～34 k外膜蛋白和25 k～27 k外膜蛋白,Omp25和Omp31与布鲁氏菌的毒力和免疫原性有密切关系。本文就这3组外膜蛋白的研究进行了总结。     

布鲁氏菌多重聚合酶链反应鉴定研究

目的　在同一体系中对布鲁氏菌6个种进行鉴定。方法　根据布鲁氏菌6个种的差异基因设计5对引物，应用多重聚合酶链反应（PCR）方法对布鲁氏菌进行鉴定。先用标准菌株建立方法，优化实验条件，然后扩增地方株进行验证。结果　除绵羊附睾种外多重引物PCR方法能将其余5个布鲁氏菌种全部鉴定出来。结论　这种方法快速准确，且对实验操作人员安全，是布鲁氏菌鉴定的辅助方法。     

外膜孔道蛋白38缺失引起鲍曼不动杆菌对β-内酰胺类抗菌药物敏感性降低的实验研究

目的探讨外膜孔道蛋白38(Omp38)在鲍曼不动杆菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药中的作用。方法前期通过体外诱导试验获得1株鲍曼不动杆菌基因Omp38缺失突变株,应用回补试验验证突变基因的作用;采用流式细胞术检测菌株细胞膜电位变化;通过测量菌株的相对生长率评估突变基因的适应性代价。结果Omp38被证实涉及降低鲍曼不动杆菌对β-内酰胺类抗菌药物的敏感性;Omp38降低鲍曼不动杆菌膜电位并具有约3%的适应性代价(P0.05)。结论 Omp38在鲍曼不动杆菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药过程中发挥重要作用;Omp38微弱的适应性代价可能是鲍曼不动杆菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的重要原因。     

新疆维吾尔自治区人间布鲁氏菌多位点可变数目串联重复序列分型研究

目的采用多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA）方法对新疆维吾尔自治区（新疆）分离的人间布鲁氏菌进行基因型分析。方法采用布鲁氏菌MLVA16-多色毛细管电泳分型方法,对2015年和2016年分离自新疆7个地（州、市）的24株人间布鲁氏菌临床分离株和3株布鲁氏菌标准菌株进行分型;利用BioNumerics（Version 7.5）软件构建菌株最小进化树,分析菌株间遗传关系。结果MLVA16分型可将不同种布鲁氏菌予以区分,24株临床分离株panel1、panel2A均为42型和108型,panel2B具有多态性;24株临床分离株被聚类为一个分支,与羊种布鲁氏菌聚类为一个大分支,个别不同地区分离株的亲缘关系较近。结论羊种3型布鲁氏菌是新疆人间布鲁氏菌病（布病）的主要流行菌株,MLVA16-多色毛细管电泳分型作为一种快速、可靠的基因分型方法,可为新疆人间布病传染源的溯源研究提供依据。     

碳青霉烯耐药非产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的敏感性及分子特点分析

目的分析碳青霉烯耐药非产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌(carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae without producing carbapenemase,CRKPPC)的抗菌药物敏感性、β-内酰胺酶基因和外排泵基因的分布及外排泵抑制剂的抑制作用。方法收集2012—2014年我院碳青霉烯不敏感肺炎克雷伯菌108株,用Mastdiscs combi Carba plus纸片系统检测碳青霉烯酶表型。用微量肉汤稀释法测定CRKPPC菌株对抗菌药物的敏感性;用PCR和DNA测序技术检测β-内酰胺酶耐药基因,包括超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamase,ESBL)和质粒介导的头孢菌素酶(Amp C)编码基因及外排泵基因acr AB-tolC、kex D、kde A、kpn EF和kpn GH;外排泵抑制剂羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)和利血平抑制试验分析外排泵在碳青霉烯耐药中的作用;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析细菌外膜孔蛋白Omp K35和Omp K36的表达。结果碳青霉烯不敏感肺炎克雷伯菌菌株中有26株细菌为CRKPPC;这26株细菌对β-内酰胺类药物高度耐药,对阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星和环丙沙星的耐药率均较高,但对替加环素、多黏菌素、头孢他啶/阿维巴坦和氨曲南/阿维巴坦等有很好的敏感性; blaCTX-M和blaSHV检出率依次为76.9%和57.7%;外膜孔蛋白Omp K35和Omp K36均有不同程度的缺失,缺失率分别为57.7%和19.2%;80%以上的细菌中存在acr AB-tolC、kex D、kde A、kpn EF和kpn GH基因; CCCP对碳青霉烯类药物具有显著的抑制作用,而利血平没有明显的抑制作用。结论替加环素、多黏菌素可以作为CRKPPC联合用药的基础药物。CRKPPC菌株中存在Amp C、ESBLs及不同程度的外膜孔蛋白Omp K35和Omp K36缺失,但外排泵对碳青霉烯类药物的外排作用是CRKPPC对碳青霉烯耐药的主要机制,外排泵抑制剂可能在这种细菌引起的感染治疗中有重要价值。     

碳青霉烯耐药非产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的药物敏感性及分子特征分析

目的分析碳青霉烯耐药非产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌(carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae without producing carbapenemase,CRKPPC)的抗菌药物敏感性、β-内酰胺酶基因和外排泵基因的分布及外排泵抑制剂的抑制作用。方法收集2012—2014年我院碳青霉烯不敏感肺炎克雷伯菌108株,用Mastdiscs combi Carba plus纸片系统检测碳青霉烯酶表型。用微量肉汤稀释法测定CRKPPC菌株对抗菌药物的敏感性;用PCR和DNA测序技术检测β-内酰胺酶耐药基因,包括超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamase,ESBL)和质粒介导的头孢菌素酶(Amp C)编码基因及外排泵基因acr AB-tolC、kex D、kde A、kpn EF和kpn GH;外排泵抑制剂羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)和利血平抑制试验分析外排泵在碳青霉烯耐药中的作用;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析细菌外膜孔蛋白Omp K35和Omp K36的表达。结果碳青霉烯不敏感肺炎克雷伯菌菌株中有26株细菌为CRKPPC;这26株细菌对β-内酰胺类药物高度耐药,对阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星和环丙沙星的耐药率均较高,但对替加环素、多黏菌素、头孢他啶/阿维巴坦和氨曲南/阿维巴坦等有很好的敏感性; blaCTX-M和blaSHV检出率依次为76.9%和57.7%;外膜孔蛋白Omp K35和Omp K36均有不同程度的缺失,缺失率分别为57.7%和19.2%;80%以上的细菌中存在acr AB-tolC、kex D、kde A、kpn EF和kpn GH基因; CCCP对碳青霉烯类药物具有显著的抑制作用,而利血平没有明显的抑制作用。结论替加环素、多黏菌素可以作为CRKPPC联合用药的基础药物。CRKPPC菌株中存在Amp C、ESBLs及不同程度的外膜孔蛋白Omp K35和Omp K36缺失,但外排泵对碳青霉烯类药物的外排作用是CRKPPC对碳青霉烯耐药的主要机制,外排泵抑制剂可能在这种细菌引起的感染治疗中有重要价值。     

应用多位点串联重复序列分析方法鉴定布鲁氏菌变异株

目的 对常规的生物学鉴定方法无法准确分类的布鲁氏菌变异菌,采用多位点串联重复序列分析（MLVA）方法进行种型分类。 方法 39株经常规生物学方法鉴定为布鲁氏菌变异株,应用MLVA方法进行种型分类。 结果 39株菌株与粗糙型血清R凝集,可被Bk₂噬菌体裂解,Wb、Tb噬菌体不裂解,其生物型别不确定;9株菌株与血清A和M弱凝集,2株菌株与血清M弱凝集,其他28株菌株与血清A和M都不凝集;33株菌株可被粗糙型Iz噬菌体裂解,确定39株菌株为布鲁氏菌变异株。 应用16个位点串联重复序列分析,结合布鲁氏菌参考标准菌株,经聚类分析,39株菌中2株菌与牛种布鲁氏菌生物2和4型高度相似,37菌株与羊种布鲁氏菌生物3型高度相似。 结论 常规生物学鉴定方法与分子生物学分型方法的联合运用,可以更好地解决布鲁氏菌分离菌株的分类,尤其是适合布鲁氏菌变异菌株的鉴定。     

淮北地区耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药机制

目的探讨淮北地区铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa,Pa）对亚胺培南的耐药机制。方法采用K-B法和MIC法检测25株临床分离亚胺培南耐药铜绿假单胞菌对12种临床常用抗生素的敏感性;采用PCR法检测外膜蛋白OprD2和金属β-内酰胺酶（MBLs）耐药相关基因（IMP、VIM、SPM、GIM）。结果 25株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌中15株外膜通道蛋白OprD2基因缺失,缺失率60%;5株产金属酶,检出率20%（4株产VIM-2,1株产IMP-1）;未检出SPM-2、GIM基因。结论淮北地区铜绿假单胞菌亚胺培南耐药,外膜通道蛋白OprD2缺失与产金属酶均起重要作用。     

1950－2018年山西省布鲁氏菌病病原学特征分析

目的系统分析1950 — 2018年山西省布鲁氏菌病病原学特征,为深入分析布鲁氏菌病的流行病学特征提供参考信息。方法对全省69年间检出布鲁氏菌资料按照1950 — 1981、1982 — 1991和1992 — 2018年3个阶段特别对分离到布鲁氏菌按照时间、地区、宿主材料分离情况及优势菌株进行统计分析。结果1950 — 2018年山西省从5种宿主的不同材料中分离到牛、羊、猪种3种共417株布鲁氏菌,其中羊种布鲁氏菌331株、牛种1株、猪种1株、布鲁氏菌非典型菌株1株、未定种83株。结论山西省是羊种为主的羊、牛、猪种布鲁氏菌混合疫区,1950 — 1981、1982 — 1991年以羊1型、羊2型为优势菌种演变为当前以羊种3型为优势菌种,羊种布鲁氏菌可能有宿主转移现象。     

布鲁氏菌的Rep-PCR分型研究

目的探索对布鲁氏菌属的分子生物学分类方法。方法应用Rep-PCR进行分型研究,以布鲁氏菌属各种型代表菌株为参考,将该方法对国内分离的典型、非典型布鲁氏菌菌株、疫苗菌株进行分类研究。结果使用Rep-PCR方法,不仅在属的水平上可以检测、鉴定布鲁氏菌属,而且能够将107株国内外布鲁氏菌的参考菌株和地方流行菌株分为8个组。结论使用Rep-PCR方法可以对布鲁氏菌株进行分型,将典型和非典型布鲁氏菌进行鉴定和分型,弥补传统分类方法的不足。     

脉冲场电泳分析布鲁菌标准菌株

目的探索一种布鲁菌分型的快速、准确、可靠的分子生物学方法。方法建立脉冲场凝胶电泳(PF-GE)的分子生物学分型方法,比较染色体限制性内切酶图谱,确定菌株的亲缘关系。结果在分析的19株布鲁菌标准菌株中,6种布鲁菌的PFGE图谱各不相同,但猪种菌和犬种菌的PFGE图谱只有1条带不同。羊种菌和猪种菌内各生物型均可在各自种内被区别,但牛种菌各生物型被区分为3类。从系统发生的观点来看,羊、牛、猪种菌是从共同祖先进化来的,犬种菌可认为是猪种菌的主要株或是刚从该种布鲁菌进化而来的株。沙林鼠种菌与牛种菌关系密切,而绵羊附睾种菌与猪种5型菌遗传距离也较近。结论PFGE方法可用于布鲁菌的基因分型的研究,是对传统分型方法一种较好的补充。     

中国羊种布鲁氏菌<I>omp2</I>基因PstⅠ酶切多态性特征分析

目的拟发现中国羊种布鲁氏菌Iomp2/I基因PstⅠ酶切多态性特征。方法用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）对羊种标准菌株、疫苗株M5、国内分离的羊种布鲁氏菌野毒株及非典型株共46株进行分析。结果Iomp2/I基因扩增产物经PstⅠ酶切后呈现两种酶切图谱,43/46有238 bp和44 bp 2个条带;仅羊1型标准株16M和两株青海非典型羊种1型菌有282 bp、238 bp和44 bp 3个条带。结论Iomp2/I基因PstⅠ酶切可为区分部分野生动物中的羊种菌和家畜羊种菌,为揭示布鲁氏菌的遗传衍化关系提供线索。     

A repA-based ELISA for discriminating cattle vaccinated with Brucella suis 2 from those naturally infected with Brucella abortus and Brucella melitensis

The commonest ways of diagnosing brucellosis in animals include the Rose-Bengal plate agglutination test, the buffered plate agglutination test (BPA), the slide agglutination test, the complement fixation test, and the indirect enzyme linked immunosorbent assay (I-ELISA). However, these methods cannot discriminate the Brucella vaccine strain (Brucella suis strain 2; B. suis S2) from naturally acquired virulent strains. Of the six common Brucella species, Brucella melitensis, Brucella abortus, and B. suis are the commonest species occurring in China. To develop an ELISA assay that can differentiate between cows inoculated with B. suis S2 and naturally infected with B. abortus and B. melitensis, genomic sequences from six Brucella spp. (B. melitensis, B. abortus, B. suis, Brucella canis, Brucella neotomae and Brucella ovis) were compared using Basic Local Alignment Search Tool software. One particular gene, the repA-related gene, was found to be a marker that can differentiate B. suis from B. abortus and B. melitensis. The repA-related gene of B. suis was PCR amplified and subcloned into the pET-32a vector. Expressed repA-related protein was purified and used as an antigen. The repA-based ELISA was optimized and used as specific tests. In the present study, serum from animals inoculated with the B. suis S2 vaccine strain had positive repA-based ELISA results. In contrast, the test-positive reference sera against B. abortus and B. melitensis had negative repA-based ELISA results. The concordance rate between B. abortus antibody-negative (based on the repA-based ELISA) and the Brucella gene-positive (based on the ‘Bruce ladder’ multiplex PCR) was 100%. Therefore, the findings suggest that the repA-based ELISA is a useful tool for differentiating cows vaccinated with the B. suis S2 and naturally infected with B. abortus and B. melitensis.     

布鲁菌PCR快速检测方法的建立及应用

目的建立布鲁菌聚合酶链反应(PCR)方法,对其进行应用评价。方法针对布鲁菌外膜蛋白编码基因(omp-2)设计PCR引物,建立PCR方法,利用19种常见细菌和布鲁菌株DNA分别对其进行特异性和敏感度评价,对3株疑似布鲁菌株进行核酸检测,并与分离培养法进行结果比对。结果本研究建立的布鲁菌PCR检测方法仅能检出布鲁菌阳性菌株,对照菌DNA未出现目的条带;敏感度为100拷贝/反应;PCR方法对3株疑似布鲁菌株检出omp-2基因条带,鉴定结果为布鲁菌,与分离培养法结果相同。结论本研究建立了一种布鲁菌PCR检测方法,与分离培养法相比,布鲁菌PCR方法准确、快速,适合布鲁菌病疫情的快速检测。     

Role of beta-lactamases and porins in resistance to ertapenem and other beta-lactams in Klebsiella pneumoniae

High-level resistance to ertapenem was produced by beta-lactamases of groups 1, 2f, and 3 in a strain of Klebsiella pneumoniae deficient in Omp35 and Omp36. From a wild-type strain producing ACT-1 beta-lactamase, ertapenem-resistant mutants for which the ertapenem MICs were up to 128 microg/ml and expression of outer membrane proteins was diminished could be selected.     

布鲁氏菌病患者血液中布鲁氏菌与临床症状和抗体水平关联性研究

目的 应用巢式聚合酶链式反应（PCR）方法检测布鲁氏菌病（布病）患者血液中布鲁氏菌DNA,分析其与临床症状和抗体水平之间的关系。方法 对门诊就诊患者进行个案调查,包括临床症状、既往史、接触史、用药史等。布病可疑患者,采集血液,分离血清,进行血清试管凝集试验（SAT）,检测布鲁氏菌抗体,按照《布鲁氏菌病诊断》（WS 269—2019）进行布病临床诊断。同时对患者抗凝全血进行细菌DNA提取,应用巢式PCR方法检测血液中布鲁氏菌DNA。对不同症状、抗体水平血液中布鲁氏菌细菌数之间的关系进行统计学分析。结果 118例布病患者中,男性78例,女性40例。患者的临床症状主要有发热、乏力、头痛、胸背酸痛、腰痛、四肢酸痛、关节肌肉疼痛、出汗、失眠和睾丸痛等。118例布病患者血液标本中,布鲁氏菌DNA阳性率为63.56%(75/118),布鲁氏菌细菌数中位数(MED)为7拷贝/mL血液,四分位数(IQR)为2～17拷贝/mL血液。118例布病患者中,SAT检测阳性率为38.14%(45/118)。118例布病患者中,新发病例和复诊病例分别占55.08%(65/118)和44.92%(53/118),新发...     

不同方法提取血培养瓶培养的抗凝血中布鲁氏菌核酸的比较

  目的   比较不同提取方法对血培养瓶培养的抗凝血中布鲁氏菌检出率的影响。  方法   将定量检测的灭活菌液/基因组DNA梯度添加至含抗凝血的血培养瓶中,选择不同的方法提取核酸,利用荧光定量检测其含量。  结果   磁珠法和裂解法最低能检测添加102 CFU/mL的灭活菌液以及10?3 ng/μL的基因组DNA;离心柱法无法检测未经红细胞裂解液处理的添加106 CFU/mL的灭活菌液以及10 ng/μL的基因组DNA,经红细胞裂解液处理后也只能检测到添加104 CFU/mL的灭活菌液以及1 ng/μL的基因组DNA的模拟样品。  结论  红细胞裂解液处理模拟样品能够增加核酸的提取量,裂解法提取效果最好,其次是磁珠法,再次是离心柱法。 本研究为疑似布鲁氏菌病样品血培养物的核酸检测提供了方法参考,为提高布鲁氏菌病的诊断率提供了新的思路。