NK 细胞上清液提高CTL 细胞对肝癌细胞杀伤力的研究

目的：研究用白细胞介素2（IL‐2）联合IL‐12、IL‐18以及三者共同活化NK细胞所提取的上清液与肝癌细胞共培养是否能提高AFP特异性的细胞毒性T细胞（CTL）对小鼠肝癌细胞的杀伤性。方法提取NK 细胞,分别用IL‐26000 IU／mL、IL‐26000 IU／mL＋ IL‐1210 ng／mL、IL‐26000 IU／mL＋IL‐l8100 ng／mL、IL‐26000 IU／mL＋IL‐1210 ng／mL＋IL‐18100 ng／mL活化NK细胞,3 d后提取上清液,ELISA检测上清液IFNγ表达量,然后将上清液与Hepa1‐6细胞培养过夜,流式细胞仪检测肿瘤细胞表面I类组织相容性抗原（M HC I）表达,以其为靶细胞检测AFP特异性的CTL细胞对 Hepa1‐6细胞杀伤率。结果NK＋IL‐2＋IL‐12、NK＋IL‐2＋IL‐18、NK＋IL‐2＋IL‐12＋IL‐18上清液的IFNγ含量高于NK＋IL‐2上清液的IFNγ含量（P＜0．05）,并且上述三组能有效提高小鼠 Hepa1‐6细胞表面M HC I的表达（P＜0．05）,从而显著提高了AFP特异性的CTL细胞对靶细胞的杀伤活性,然而阻断IFNγ分泌,AFP特异性的CTL细胞对靶细胞的杀伤活性降低。结论 NK 细胞上清液能够增强AFP特异性的CTL对肝癌细胞的杀伤作用。     

NK细胞的免疫生物学特性

人类NK细胞是机体抗肿瘤和抗病毒感染的天然免疫细胞，有自发的细胞毒功能，近10年来人们发现NK细胞的识别也具有特异性。NK细胞表达多种受体，按受体识别的分子可分为HLAI类分子特异性受体、非HLAI类分子特异性受体和共受体三大类，功能上划分为活化性受体和抑制性受体两类，这些受体对NK细胞的功能有重要的调节作用。本文就NK细胞受体的特点和功能作一综述，并探讨开发NK细胞新型潜在细胞免疫治疗的价值。     

克癌临对荷肝癌(H22)小鼠IL-2和NK细胞活性的影响

目的:研究和探讨中药复方克癌临对荷肝癌(H22)小鼠的免疫调节作用.方法:建立荷实体型肝癌(H22)小鼠模型,观察经克癌临治疗对其IL-2和NK细胞活性的影响.结果:克癌临能显著提高荷瘤小鼠IL-2和NK细胞活性,且其IL-2活性及NK细胞活性和模型组或阳性对照组(5-Fu组)比较有非常显著性差异(p＜0.001).结论:克癌临方药可显著提高荷瘤机体的抗肿瘤免疫功能.     

人参皂苷对烫伤脓毒症大鼠CD19细胞和NK细胞的影响

目的：探讨人参皂苷对烫伤后脓毒症大鼠CD19细胞（B淋巴细胞）和自然杀伤细胞（NK细胞）的影响及其作用机制。方法：健康雄性SD大鼠66只被随机分为脓毒症组（n-24）、人参皂苷组（n-24）和对照组（n-18）；将大鼠用沸水致背部30％总体表面积Ⅲ度烫伤，烫伤后12h经腹腔注射内毒素（5mg／kg）予以“二次打击”，制成烫伤脓毒症模型。各组分别于“二次打击”后12、24和72h活杀大鼠，用流式细胞仪检测大鼠外周血中CD19细胞和NK细胞占淋巴细胞的百分比。结果：“二次打击”后大鼠外周血中CD19细胞和NK细胞活性均显著下降，此过程随时间延长而加重，各时间点与对照组比较差异均有显著性（P均〈O．01）；内毒素打击后24h和72h人参皂苷组CD19细胞和NK细胞占淋巴细胞百分比均显著高于脓毒症组（P均〈O．01）。结论：烫伤和内毒素“二次打击”后外周血中CD19细胞和NK细胞活性显著下降，人参皂苷可有效恢复其功能，显著改善烫伤脓毒症时细胞免疫功能受抑状态。     

不同遗传背景NK细胞对转化细胞的杀伤效应

目的:细胞免疫治疗的着眼点不仅是杀伤局部异常生长的肿瘤细胞,还要应对潜在转化细胞的影响,为此观察3种不同遗传背景NK细胞对转化细胞杀伤效应的差异.方法:实验于2007-03/09在南方医科大学珠江医院血液科完成.①材料:SPF级8～10周龄的C57BL/6(H-2b)小鼠10只、Balb/C(H-2d)d,鼠10只、Balb/C(H-2d)×C57BL/6(H-2b)杂交F1代(H-2d/b)小鼠10只,均购于南方医科大学实验动物中心,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.YAC-1细胞株由本室冻存;C57BL/6鼠源性红白血病细胞株FBL-3由周健博士惠赠.②实验方法:脱臼处死3种不同遗传背景小鼠,无菌取脾,密度梯度离心法常规分离脾单个核细胞,免疫磁珠细胞阳性分选得到3种不同遗传背景小鼠的NK细胞,即全相合C57BL/6组、不相合Balb/C组、半相合F1代组,以其作为效应细胞.将培养至对数生长期的YAC-1、FBL-3细胞株以及ConA刺激的C57BL/6小鼠脾细胞作为靶细胞.相对于靶细胞,不相合Balb/C组与半相合F1代组为同种异体反应性NK细胞,全相合C57BL/6组为自体NK细胞.③实验评估:通过流式细胞术检测CD49b 的表达鉴定NK细胞纯度.调整靶细胞YAC-1密度为2×108 L-1,按效靶比5:1,10:1,20:1,40:1以乳酸脱氧酶释放法测定NK细胞的杀伤活性.调整靶细胞FBL-3和ConA刺激的C57BL/6小鼠脾细胞密度均为2×108 L-1,按效靶比20:1,40:1同法测定NK细胞的杀伤活性.结果:①NK细胞的纯度鉴定:CIM9b 细胞率全相合C57BL/6组为(90.93±2.46)%,不相合Balb/C组为(89.50 1.04)%,半相合F1代组为(91.93±2.01)%,分选所得NK细胞的纯度满足实验要求.②NK细胞对YAC-1细胞的杀伤活性:3组NK细胞的杀伤活性均随效靶比5:1,10:1,20:1.40:1的升高而增强:同一效靶比时3组NK细胞对YAC-1的杀伤活性差异无显著性意义(F=0.557.P=0.600.F=0.550,P=0.604:F=0.503,P=0.628.F=0.946,P=0.439)③NK细胞对FBL-3和ConA刺激的C57BL/6小鼠脾细胞的杀伤效应:效靶比为20:1,40:1时,半相合F1代组与不相合Balb/C组对FBIL-3和ConA刺激的C57BL/6小鼠脾细胞的杀伤效应均明显高于全相合C57BL/6组(P均=0.000).结论:NK细胞的遗传背景能够影响其对靶细胞的杀伤活性,同种异体反应性NK细胞的杀伤效应强于自体NK细胞,为NK细胞介导的细胞免疫治疗提供实验依据.     

NK细胞的免疫生物学特性

人类NK细胞是机体抗肿瘤和抗病毒感染的天然免疫细胞,有自发的细胞毒功能,近10年来人们发现NK细胞的识别也具有特异性。NK细胞表达多种受体,按受体识别的分子可分为HLA I类分子特异性受体、非HLA I类分子特异性受体和共受体三大类,功能上划分为活化性受体和抑制性受体两类,这些受体对NK细胞的功能有重要的调节作用。本文就NK细胞受体的特点和功能作一综述,并探讨开发NK细胞新型潜在细胞免疫治疗的价值。     

急性乙型肝炎患者特异性细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞和自然杀伤T细胞的状态

<正>免疫细胞在抗病毒免疫中并不是独立起作用的,而是与不同种类的免疫细胞协同合作的[1]。为此,我们研究急性乙型肝炎(AHB)患者体内特异性细胞毒性T细胞(CTL)的频率改变,及淋巴细胞亚群与自然杀伤细胞(NK)、自然杀伤T细胞(NKT)间的动态改变。探讨特异性及非特异性免疫细胞在病毒清除及细胞损伤中的作用。     

定期无偿献血者NK细胞免疫功能的研究

目的 分析定期无偿全血捐献者、血小板捐献者的NK细胞数量以及细胞毒活性,评价定期捐血对机体NK细胞免疫功能的影响.方法 采用流式细胞术对三组人群(定期无偿全血、血小板和首次捐血者,后者为对照组)外周血中NK细胞群的数量进行分析.采用效/靶细胞混合培养的方法,计算出NK细胞对靶细胞的杀伤率.结果 全血捐献者NK细胞数量及其对靶细胞的杀伤率与对照组的差异无统计学意义(P>0.05);血小板捐献者NK细胞数量较对照组明显增高(P<0.05),而NK细胞杀伤活性明显降低(P<0.05).结论 本研究结果说明,全血捐献者献血间隔期较长(>3个月),机体有足够的时间来恢复NK细胞数量及其细胞毒性,而血小板捐献者献血间隔期短,机体通过NK细胞数量的增加来调节由于其功能降低对机体造成的影响.     

Veto细胞与异体组织移植

Miller 及其同事发现并命名的Veto 细胞,能持久地灭活细胞毒性T 前体细胞(CTLP)或CD_4(+)辅助性T 前体细胞(T_HP),特异性地保护与自身具相同组织相容性抗原(MHC-Ⅰ、minor-H 或MHC-Ⅲ)的细胞不被识别与杀伤,被认为是维持自身耐受、诱导移植耐受的主要机理之一。目前认为Veto 细胞属非T 非B 细胞.是一种具有分化潜能的前体细胞,表型类似NK 前体细胞(pre-NK)。非特异性丝裂原或淋巴因子可提高组织细胞的Veto 活性.移植前输注与供体带相同组织相容性抗原的Veto 细胞,可明显提高组织器官移植的植活率,展示了Veto 细胞在异体组织移植中良好的应用前景。     

淋巴因子诱导B-CLL患者T细胞产生NK样细胞毒活性

慢性 B 淋巴细胞白血病(B-CLL)患者的 B 和 T 淋巴细胞,其功能和细胞表型都有异常;患者有 E 玫瑰花结阳性细胞介导的自然杀伤细胞和 ADCC 活性缺乏。由于 NK 细胞参与对肿瘤的监视、杀伤以及正常造血讽控和防止病毒感染,因此,患者 NK 活性缺乏可能对该病的发展有一定的作用。作者检测了患者外周血单个核细胞、T 细胞和非T 细胞的 NK 活性。结果 NK 活性均较对照组明显降低,E 玫瑰花结阳性细胞 NK 活性缺乏尤其显著(P     

K562-DC融合瘤苗刺激的CIK/NK细胞在荷瘤NOD/SCID小鼠体内的杀瘤活性

目的 探讨经K562细胞-树突细胞(DC)融合瘤苗刺激的脐血源性细胞因子诱导的杀伤(CIK)/自然杀伤(NK)细胞在荷瘤NOD/SCID小鼠体内的杀伤效能及其安全性.方法 通过不同细胞因子的组合分别诱导脐血单个核细胞(MNC)成为DC和CIK/NK细胞,通过聚乙二醇(PEG)将灭活K562细胞与DC融合形成K562-DC融合瘤苗.以10:1比例在CIK/NK细胞培养体系中加入K562-DC融合瘤苗,制备K562-DC融合瘤苗刺激的CIK/NK细胞.小鼠均经尾静脉接种K562细胞1×106诱导荷瘤鼠;于接种肿瘤细胞后24 h按不同分组分别经尾静脉输注K562-DC融合瘤苗刺激的CIK/NK细胞1×107、CIK/NK细胞1×107,同时设相应的非荷瘤鼠对照.比较各组小鼠的生存率、存活时间;用流式细胞术检测小鼠外周血、肝、肺组织中人CD13+细胞和外周血人CD56+细胞.结果 在接种1×106K562细胞后未经处理的小鼠39 d内全部死亡,8只鼠中肉眼可见瘤块的小鼠5只,其中位于肝脏的4只、脾脏的1只.接种K562细胞后接受K562-DC瘤苗刺激的CIK/NK细胞治疗的8只小鼠第65天时死亡1只,抗瘤有效率为87.5%;接受CIK/NK细胞治疗小鼠死亡2只,时间分别为接种K562细胞后第56天及第62天,抗瘤有效率为75.0%,均未发现肉眼可见瘤块.该两组小鼠存活时间分别为(69.4±1.8)d、(67.2±5.3)d,两组间差异无统计学意义(P＞0.05),均高于未予治疗的荷瘤对照组[(30.4±4.6)d](P＜0.01),荷瘤后接受K562-DC瘤苗刺激的和未经瘤苗刺激的CIK/NK细胞治疗的两组其余小鼠存活均超过70 d.经CIK/NK细胞治疗的两组存活小鼠外周血,肝、肺组织中人CD13+细胞率差异无统计学意义,均显著低于荷瘤未治疗组(P＜0.01),而治疗的两组存活小鼠外周血人CD56+细胞率与输注不同CIK/NK细胞的非荷瘤对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).结论 经过灭活肿瘤细胞预孵育的脐血源性CIK/NK细胞接种在动物体内具有抗瘤活性,无致瘤性.     

风湿性心脏病NK细胞活性的变化及其临床意义

本文对50例风湿性心脏病患者外周血NK细胞活性的变化进行了研究,结果:风湿活动组NK细胞活性明显降低,而非风湿活动组NK活性与对照组相比无显著差异.认为NK细胞活性降低与免疫反应调节失控有关,同时NK细胞功能缺陷本身,又进一步加剧了免疫调节功能紊乱,加重了心肌及心瓣膜的免疫损害.     

抑癌基因Foxo1和PTEN在小鼠NK细胞淋巴瘤发生中的作用探索

目的:探索抑癌基因Foxo1和PTEN在小鼠NK细胞淋巴瘤发生过程中是否发挥关键作用。方法:利用NKp46-iCre小鼠分别与Foxo1fl/fl、PTENfl/fl小鼠交配,得到NKp46-iCre;Foxo1fl/flPTENfl/fl(Foxo1△NKPTEN△NK)小鼠,即NK细胞内特异性敲除Foxo1和PTEN的小鼠,连续观察小鼠的生长发育和成瘤情况;利用流式细胞术检测NK细胞内Foxo1和PTEN双基因缺失后小鼠主要淋巴器官内的NK细胞的比例变化;利用B16F10恶性黑色素瘤移植瘤小鼠模型观察小鼠NK细胞内Foxo1和PTEN双基因缺失后对NK细胞的肿瘤免疫监视功能的影响。结果:成功建立了NK细胞特异性Foxo1和PTEN双基因缺失小鼠模型,连续观察小鼠46周,与对照组小鼠(Foxo1fl/fl PTENfl/fl)相比,小鼠生长未见明显异常,未形成自发性肿瘤。与对照组小鼠相比,Foxo1△NKPTEN△NK小鼠的外周血、淋巴结、骨髓、脾脏中NK细胞的比例无明显变化(PB:4.76%±0.46%vs 4.17%±0.64%)(P0.05,n=8);(BM:1.13%±0.23%vs 1.31%±0.10%)(P0.05,n=8);(LN:0.50%±0.10%vs 0.85%±0.20%)(P0.05,n=8);(SP:4.41%±0.65%vs 3.5%±0.24%)(P0.05,n=8)。B16F10恶性黑色素瘤移植瘤小鼠模型建立后,与对照组小鼠(Foxo1fl/fl PTENfl/fl)相比,Foxo1△NKPTEN△NK小鼠的生存时间比较无统计学差异(P0.05,n=13)。结论:抑癌基因Foxo1、PTEN在小鼠NK细胞淋巴瘤发生过程中可能不具有关键作用,缺失后对体内NK细胞的肿瘤免疫监视功能影响不大。     

异基因造血干细胞移植中NK细胞的作用

摘要异基因造血干细胞移植后，供者细胞可产生强大而持久的免疫治疗功效，其中异源反应性NK细胞活性是T细胞异源反应活性以外的，具有显著抗肿瘤／白血病活性的自然免疫现象，并逐渐受到人们的重视。已证实，NK细胞通过其受体与靶细胞MHC分子特异性的识别机制参与移植物抗白血病（GVL）作用并影响移植物抗宿主病（GVHD）的发生。异基因造血干细胞移植后异源反应性NK细胞输注已从动物实验逐渐应用于临床。本文就NK细胞异源反应性及其在异基因造血干细胞移植中的作用进行综述。     

NK细胞对异基因骨髓移植中移植排斥和造血及免疫重建的影响

本研究探讨自然杀伤（NK）细胞在小鼠异基因骨髓移植（allo—BMT）中对移植排斥、造血及免疫重建的影响。以C57BL／6（H-2^b）小鼠为供鼠、BALB／c（H-2^d）小鼠为受鼠，分别在致死剂量和非致死剂量（≤7．0Gy）全身照射（TBI）的预处理条件下进行allo—BMT，移植同时输注供鼠外周T细胞和（或）NK细胞，移植后不同时间检测受鼠外周血白细胞、骨髓CD34^＋细胞数和外周血淋巴细胞中CD3^＋细胞、CD19^＋细胞及供鼠来源的H-2K^b＋细胞表达的百分率，并对不同移植组的存活率、植入与排斥、造血及免疫重建进行比较。结果表明：在致死剂量TBI预处理的移植中，输注NK细胞与不输注NK细胞的移植组比较，存活率显著增高（60天存活率为70％vs 0．0％）；白细胞数、CD19^＋细胞表达及骨髓CD34^＋细胞数恢复快；H-2K^b＋细胞的表达水平高[（86．68±4．45）％vs（4．68±0．32）％]。移植后28天输注NK细胞组CD3^＋细胞表达水平明显低于不输注NK细胞组[（33．69±3．36）％们（50．40±5．06）％，P〈0．01]，移植后60天两组比较差异无显著性（P〉0．05）。在非致死剂量TBI预处理的移植中，移植后30天．异基因骨髓移植组H-2K^b＋细胞表达率明显下降，移植后60天已下降至移植前水平；而输注高浓度和低浓度NK细胞的两组在移植后60天仍能检测到80％以上的H-2^b＋细胞表达。结论：在小鼠allo—BMT中，同种异基因反应性NK细胞可以抑制移植排斥，提高造血干细胞的植入水平，促进造血及免疫重建并增加移植受鼠的生存率。     

NK细胞对造血细胞的杀伤作用

自然杀伤细胞(NK细胞)对各种靶细胞起自发细胞毒作用。它不具有经典的巨噬细胞、粒细胞或细胞毒性T细胞的特性;其细胞毒作用无MHC限制性。NK细胞不仅对自体、同种及异种肿瘤细胞有细胞毒活性,而且对胚胎成纤维细胞、巨噬细胞、骨髓和胸腺的某些细胞亚群,对疱疹病毒、流感病毒及支原体感染细胞也有杀伤作用。本文就NK细胞对骨髓细胞(BMC)的杀伤作用作一总结。     

NK细胞对骨髓瘤RPMI 8226细胞的体外杀伤活性

目的:探讨NK细胞对骨髓瘤RPMI 8226细胞的体外杀伤活性.方法:分离纯化NK细胞,LDH法检测不同效靶比时NK细胞对RPMI 8226细胞的杀伤活性,并以K562细胞为对照.同时用甲基纤维素克隆形成试验观察效靶比为20:1时细胞克隆形成率.结果:NK细胞对K562、RPMI 8226细胞的杀伤活性随着效靶比升高而增强,在同一效靶比,NK细胞对K562、RPM1 8226细胞的杀伤活性组间比较差异均有统计学意义.NK细胞对K562细胞克隆形成抑制率为(63.48±6.78)%,对RPMI 8226细胞克隆形成抑制率为(23.71±2.39)%,差异有显著统计学意义.结论:NK细胞可杀伤骨髓瘤RPMI 8226细胞,但为低度敏感.     

预设靶标免疫靶向盐酸吡柔比星治疗小鼠S180肉瘤的试验研究

目的:制备小鼠抗人IgG-葡聚糖-盐酸吡柔比星(THP)免疫靶向偶联物,在肿瘤组织中接种人IgG非特异性靶点,探讨人造靶点免疫导向治疗肿瘤的可行性.方法:制备小鼠抗人IgG-葡聚糖-THP偶联物,建立荷瘤小鼠模型.采用ELISA法测定小鼠抗人IgG-葡聚糖-THP偶联物抗体活性;体外细胞毒性实验(四甲基偶氮唑蓝法)比较分析小鼠抗人IgG、THP、小鼠抗人IgG-葡聚糖-THP对S180细胞的毒性作用;比较THP、小鼠抗人IgG-葡聚糖-THP、小鼠抗人IgG-葡聚糖-THP+人IgG的抑瘤作用及时荷瘤小鼠生存时间的影响.结果:制备的偶联物中,小鼠抗人IgG、葡聚糖与THP物质的量比为1:2.5:54;偶联物保留了小鼠抗人IgG抗体活性;体外细胞毒性实验表明偶联物对S180细胞有体外杀伤作用.小鼠抗人IgG-葡聚糖-THP+肿瘤中接种人IgG组时小鼠移植性5180肉瘤的抑瘤率达34.3%,并可延长荷瘤小鼠的生存时间.结论:通过在肿瘤组织中接种IgG非特异性靶点,用抗人IgG单克隆免疫靶向THP治疗小鼠S180肉瘤较对照组具有明显靶向作用.     

高强度超声治疗对患宫颈癌U14小鼠的脾淋巴细胞增殖及细胞毒性影响

目的　探讨高强度超声治疗对患宫颈癌 U14小鼠脾淋巴细胞增殖及细胞毒性影响。方法　采用四唑盐比色法 (MTT法 )及双色流式细胞技术检测了高强度超声 (HIU)治疗组 ,手术治疗组 ,患瘤对照组及正常对照组小鼠脾淋巴细胞的增殖功能及细胞毒性。结果　HIU治疗组小鼠脾淋巴细胞增殖活性较手术组、患瘤对照组及正常对照组增高 (P<0 .0 5 ) ,手术组及正常对照组较患瘤对照组小鼠脾淋巴细胞增殖活性增强 (P<0 .0 5 ) ,HIU治疗组脾淋巴细胞对同源宫颈癌 U14细胞有较强的杀伤活性 ,与手术、患瘤及正常对照组比较差异明显 (P<0 .0 5 )。结论　HIU治疗患宫颈癌 U14小鼠后 ,原位埋植的固化肿瘤细胞具有同源肿瘤的抗原性 ,能够激活小鼠脾淋巴细胞 ,发挥抗肿瘤免疫功能 ,起到“HIU原位固化瘤疫苗”的作用     

IL-2和IL-15刺激脐血NK细胞对K562/Jurkat细胞的杀伤活性研究

本研究旨在探讨脐血(cord blood,CB)NK细胞的杀伤功能及细胞因子IL-2和IL-15对NK细胞杀伤K562/Jurkat细胞活性的影响。采用autoMACS及CD3阴选后CD56阳选两步免疫磁珠分选法从脐血单个核细胞纯化NK细胞,分选后NK细胞用流式细胞仪测定纯度,通过IL-2及IL-2和IL-15两种细胞因子组合培养3天,用LDH释放法检测培养前后脐血NK细胞对白血病细胞株K562和Jurkat的细胞毒活性(效靶比10∶1),并记录不同细胞因子培养体系条件下NK细胞的生长状况。结果表明,CB-MNC中CD3-CD56+细胞含量为(14.88±9.2)%,分选后CD3-CD56+细胞含量为(92.39±0.8)%;培养3天后,IL-2组NK细胞形成集落数为148.60±13.0,IL-2复合IL-15组NK细胞形成集落数为831.80±23.0,两者比较,有显著性差异;以K562为靶细胞时,新鲜纯化CB-NK的杀伤活性为(27.76±8.8)%,IL-2组杀伤活性为(61.9±9.1)%,IL-2复合IL-15组杀伤活性为(87.62±3.7)%,差别有统计学意义;以Jurkat为靶细胞时,新鲜纯化CB-NK细胞的杀伤活性为(29.32±2.5)%,IL-2组杀伤活性为(69.43±4.4)%,IL-2复合IL-15组杀伤活性为(92.95±3.2)%,差别有统计学意义。结论:脐血新鲜纯化NK细胞对K562、Jurkat细胞有一定的杀伤作用,但自发细胞毒活性较低,IL-2/IL-15刺激后杀伤活性显著提高,IL-15复合IL-2对促进脐血NK细胞的生长和提高其细胞毒活性明显优于单用IL-2。