3D数字PCR检测NSCLC患者血浆EGFR T790M基因突变的临床意义

目的探讨一种新的3D数字聚合酶链反应(PCR)在非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆表皮生长因子受体(EGFR)T790M基因突变检测中的临床意义。方法采集70例初代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)耐药的NSCLC患者血浆标本。采用扩增阻滞突变系统(ARMS)和3D数字PCR进行EGFR T790M基因突变检测,如检测结果不同,则取同期组织蜡块标本采用ARMS进行验证。结果 70例NSCLC患者血浆标本中,ARMS检出EGFR T790M突变30例,3D数字PCR检出EGFRT790M突变34例,其中4例3D数字PCR检测为EGFRT790M阳性,而ARMS显示为野生型。Kappa一致性检验和配对χ2检验结果显示,2种检测方法诊断结果存在较好的一致性(Kappa值为0.885,P0.001)。结论 3D数字PCR适用于检测NSCLC患者血浆EGFR T790M基因突变,并且能检测出ARMS漏检的病例。     

高通量测序在非小细胞肺癌基因突变研究中的应用

目的对非小细胞肺癌(NSCLC)精准化诊疗相关的28种肿瘤驱动基因进行高通量测序,分析多基因突变与疾病临床特征的关系。方法收集重庆大学附属肿瘤医院2017年1月至2018年10月396例NSCLC患者标本,对EGFR、ALK、ROS1、KRAS、NRAS、HRAS、PIK3CA、TP53、PTEN、BRAF、HER2、RET、MET等28种基因进行高通量测序分析。结果EGFR基因突变占基因突变总检出例数的35.35%,且基因突变频率最高的前5个基因占总突变的63.89%,表现出明显的肿瘤主基因突变聚集现象。EGFR基因亚型同样呈明显的主次分布规律,其中最常见的突变亚型是19del、L858R,分别占45.00%、41.43%。EGFR基因的19del、L858R和20ins 3个亚型多为单突变,而T790M、G719X、S768I、L861Q等亚型则常表现为共突变。T790M伴随L858R突变常常是原发性突变,T790M与19del共突变则常常是获得性突变。EGFR突变标本发生其他多基因突变的检出率显著低于无EGFR突变标本,可能是因为EGFR基因突变抑制了其他基因发生突变。结论高通量测序可高效检测NSCLC患者与靶向治疗相关驱动基因的突变情况,可为研究多基因突变的内在关系及突变负荷提供有效工具,为临床医生制订NSCLC患者的精准诊疗方案提供有力支撑。     

EGFR敏感型肺腺癌38例TKIs治疗前及进展后EGFR基因变化分析

目的观察表皮生长因子受体(EGFR)敏感型肺腺癌患者EGFR-TKIs治疗前及进展后EGFR基因变化情况,分析其导致耐药的可能机制。方法回顾性分析38例EGFR-TKIs治疗前及进展后均进行活检取材的肺腺癌患者,所有病例均采用ARMS法检测腺癌组织EGFR和KRAS基因突变状态。结果 38例肺腺癌患者中,临床分期为ⅠA期1例,ⅢA期3例,ⅢB期2例,Ⅳ期32例。EGFR-TKIs治疗前,27例患者检测出EGFR基因19外显子缺失突变(19-del),11例患者检测出EGFR基因21外显子L858R点突变(L858R); EGFR-TKIs治疗进展后,17例患者EGFR基因突变状态没有改变(15例19-del和2例L858R); 19例患者检测出EGFR基因20外显子T790M点突变(T790M),其中12例19-del+T790M双突变,6例L858R+T790M双突变; 1例患者的EGFR基因L858R突变改变为19-del+L858R+T790M复合突变; 1例患者的EGFR基因L858R突变改变为KRAS基因突变(G12 V),1例患者的EGFR基因L858R突变改变为EGFR基因野生型。此外,有2例患者EGFR-TKIs治疗进展后,病理组织学中发现了小细胞癌成分。28例患者给予EGFR-TKIs治疗进展后,T790M突变阳性的患者疾病无进展生存时间为18个月,T790M突变阴性的患者为9个月,差异显著(P 0. 05)。结论 T790M突变是导致EGFR基因产生EGFR-TKIs耐药的主要突变类型,然而EGFR基因也可因发生KRAS基因突变、EGFR敏感突变位点发生丢失或改变等变化而产生耐药。     

内蒙古包头地区非小细胞肺癌患者EGFR基因突变检测分析

目的分析内蒙古包头地区非小细胞肺癌(NSCLC)患者EGFR基因突变的情况。方法采用等位基因特异PCR(allele specific PCR,ASPCR)荧光探针法检测内蒙古包头地区506例NSCLC患者EGFR基因的突变情况,并分析该突变与患者临床相关参数的关系。结果 506例NSCLC患者中检出EGFR基因突变197例,总体突变率为38.93%,突变发生以单一位点为主,在总体突变中占92.39%(182/197),共检出EGFR基因第18～21号4个外显子上7个位点的突变,其中突变率发生最高的2个为21-L858R和19-del位点,分别占总体突变的38.07%(75/197)和30.96%(61/197);检出两位点发生突变者14例,占总体突变的7.11%(14/197),其中19-del+20-T790M位点突变6例、21-L858R+20-T790M位点突变5例;发现1例三位点突变者,为20-Ins+20-T790M+21-L861Q;男性患者的突变率明显低于女性(32.87%vs 47.00%,χ~2=10.412,P0.05);病理类型为腺癌患者的突变率明显高于鳞癌患者(42.20%vs 18.57%,χ~2=14.166,P0.05)。结论内蒙古包头地区NSCLC患者EGFR基因突变以单一位点为主,且存在2个以上多位点同时突变的个体;可作为指导NSCLC患者使用抗EGFR靶向药物治疗的重要指标。     

微滴式数字PCR技术检测非小细胞肺癌患者外周血EGFR基因突变

目的分析微滴式数字PCR技术(droplet digital PCR,dd PCR)在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)患者外周血EGFR基因突变检测中的应用价值。方法采用dd PCR法与扩增阻滞突变系统技术(amplification refractory mutation system,ARMS)分别检测58例NSCLC患者及TKI治疗后耐药患者20例外周血EGFR基因突变,Kappa检验验证dd PCR法检测EGFR基因突变结果与ARMS法的一致性,并对检测结果进行分析比较。结果 ARMS法检测EGFR基因突变共检出34例患者,其中双突变患者5例,dd PCR法共检出38例患者,其中双突变患者10例;两者Kappa值=0.72,阳性一致率为97.50%,阴性一致率为72.73%,总一致率为86.30%;dd PCR法检测接受TKI治疗患者的20外显子p.T790M位点突变检出率为50.00%(10/20),而无TKI用药史患者均未检出;dd PCR法检出突变丰度1%的突变位点占总突变位点的29.17%(14/48),ARMS法仅检出其中的35.71%(5/14)。结论 dd PCR法与ARMS法相比具有更高敏感性,且可绝对定量,EGFR基因突变的检出率更高。     

非小细胞肺癌患者外周血及胸水中EGFR基因突变的研究

目的检测非小细胞肺癌患者外周血与新鲜胸水EGFR基因突变率及两者的一致性,探讨外周血标本在EGFR基因突变的临床应用价值。方法采用ARMS法检测51例非小细胞肺癌患者新鲜胸水及其外周血EGFR基因突变状态,比较外周血和新鲜胸水基因突变的一致性,分析EGFR基因突变与患者临床特征关系。结果 51例外周血中检出20例突变(突变率39.2%),其中19del突变11例(55%,11/20),L858R突变8例(40%,8/20),G719X突变1例(5%,1/20);新鲜胸水中检出24例突变(突变率47.1%),其中19del突变13例(54.2%,13/24),L858R突变10例(41.7%,10/24),G719X突变1例(4.1%,1/24)。两者突变一致性为80.4%(41/51),差异具有统计学意义(Kappa=0.603,P=0.000)。外周血及新鲜胸水EGFR基因突变状态均与性别、是否吸烟和病理类型有关(P0.05),而与年龄及TNM分期无关(P0.05)。结论非小细胞肺癌患者外周血与新鲜胸水EGFR基因突变一致性较高,在无法获得组织及细胞学标本时可以检测外周血EGFR基因状态,为非小细胞肺癌患者提供临床诊疗帮助。     

循环肿瘤细胞的磁分离法建立及在肺癌EGFR-TKI治疗中的应用

目的探索磁分离循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)联合竞争性等位基因特异性Taq ManPCR(Cast PCR)检测表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的可行性。方法收集12例晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者血液样本各7.5 m L,两步法磁分离CTCs,免疫荧光染色检测上皮细胞黏附分子(Ep CAM)和细胞角蛋白(Cytokeratin)后,流式细胞术检测CTCs数量及纯度;Cast PCR检测CTCs及循环DNA中EGFR基因del EGFR19、T790M和L858R突变;用EGFR基因突变检测试剂盒(ADx-ARMS法)检测癌组织的上述位点突变。结果高表达与不表达Ep CAM的CTCs分别在6例和12例NSCLC患者中被检测出;del EGFR19、T790M和L858R突变例数分别在2例、8例和5例NSCLC患者的CTCs中被检测出,其总检出率为83.3%(10/12);2例患者的循环DNA中检出L858R突变;ADx-ARMS法检测12例NSCLC患者癌组织中上述3种突变分别是2例、5例和3例,总检出率为75.0%(9/12)。CTCs与癌组织的突变具有一致性(Kappa=0.75,P=0.007),循环DNA与癌组织的突变一致性无统计意义(Kappa=0.06,P=0.546)。结论磁分离CTCs联合Cast PCR能有效检测EGFR基因突变,值得在NSCLC患者的EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)治疗中推广应用。     

396例非小细胞肺癌EGFR,KRAS,ALK和BRAF基因突变状态及其临床病理特征

目的:探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者表皮生长因子受体(EGFR)基因、Kirsten鼠肉瘤基因(KR AS)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因和鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B1(BR AF)基因的表达及其临床病理特征。方法:收集郑州大学第一附属医院病理确诊NSCLC患者396例临床病理资料,采用高通量二代测序(next-generation sequencing,NGS)检测肿瘤组织中EGFR,KRAS,A L K和B R A F基因的突变状态,分析基因的突变率及其与临床病理特征的关系。结果:EG F R基因突变阳性率为49.24%(195/396例),女性、腺癌、非吸烟患者中突变率较高(P0.05);KRAS基因突变阳性率为8.59%(34/396例),男性、腺癌、大于60岁老年吸烟患者中突变率较高(P0.05);ALK基因突变阳性率为6.06%(24/396例),60岁以下年轻患者中突变率较高;BRAF基因突变阳性率为3.28%(13/396例)。其中EGFR合并ALK突变共存1例,EGFR合并BR AF突变共存2例,KRAS合并ALK突变共存1例,ALK合并BRAF突变共存1例,KRAS合并BRAF突变共存1例,EGFR,KRAS合并BRAF三基因突变共存1例。结论:NSCLC患者EGFR,KRAS,ALK和BRAF基因突变阳性率与国内外报道相仿,与患者临床病理特征存在相关性,存在2个及以上基因突变共存,共存突变患者的临床治疗方案仍有待进一步研究提供循证依据。     

406例肺癌小活检标本中表皮生长因子受体基因的突变分析

目的探讨肺癌小活检标本中表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因的突变情况。方法采用蝎形探针扩增阻滞突变系统（Scorpions ARMS）检测406例肺癌小活检标本中EGFR基因第18、19、20和21外显子的突变情况。结果在406例肺癌小活检标本中,检测到190例存在EGFR突变（占46.8%）,其中80例为第19外显子框内多核苷酸缺失、88例为第21外显子L858R突变、4例为第21外显子L861Q突变、9例为第18外显子G719X突变、2例为第20外显子S768I突变、1例为第20外显子T790M突变;此外,发现6例存在双位点突变。肺腺癌EGFR突变率为55.5%（186/335）,鳞状细胞癌突变率为5.8%（3/52）,5例腺鳞癌中有1例检测到EGFR基因突变,其它类型肺癌均未检测到EGFR基因突变（0/14）。女性患者EGFR基因突变率（62.4%）明显高于男性患者（32.1%,P〈0.01）,非吸烟患者EGFR基因突变率（59.8%）明显高于吸烟患者（24.7%,P〈0.01）。结论 EGFR基因突变多见于女性、非吸烟和肺腺癌患者;Scorpions ARMS是检测活检小标本EGFR基因突变的可靠方法。     

非小细胞肺癌患者外周血游离DNA中检测EGFR基因突变

目的检测非小细胞肺癌患者外周血游离DNA中表皮生长因子受体(EGFR)基因19和21外显子的突变情况,并与相应的肿瘤组织检测结果进行比较,探讨非小细胞肺癌患者应用外周血游离DNA检测EGFR突变的临床意义。方法应用实时荧光聚合酶链反应(PCR)技术检测32例非小细胞肺癌患者术后肿瘤组织和术前外周血游离DNA中EGFR基因19和21外显子的突变,所有扩增标本均经基因测序法验证。结果 32份外周血标本中,共检测到13份EGFR基因突变,突变率达40.6%,肿瘤组织中有16份EGFR基因突变,突变率达50.0%,外周血和肿瘤组织EGFR基因同时突变的有13份,两者突变一致性达到81.2%,两者间差异无统计学意义(P0.05)。结论外周血游离DNA代替肿瘤组织进行EGFR基因突变检测具有可行性,为无法取得肿瘤组织的非小细胞肺癌患者提供一种更快捷、简便的EGFR基因突变检测方法,其检测结果可为临床选择靶向药物治疗提供依据。     

Super-ARMS PCR和ddPCR检测晚期肺腺癌患者血浆循环肿瘤DNA EGFR基因T790M突变的临床价值研究

目的探讨超级扩增阻滞突变系统PCR(Super-ARMS PCR)和微滴式数字PCR(ddPCR)检测晚期肺腺癌患者经表皮生长因子受体抑制剂(EGFR-TKI)治疗后血浆循环肿瘤DNA(ctDNA)表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M突变情况和应用价值。方法经EGFR-TKI治疗后耐药的124例患者分别应用Super-ARMS PCR法和ddPCR法检测T790M突变情况,比较2种方法检出率,用药时间及突变丰度的相关性。结果2种方法共检出51例T790M突变,诊断结果一致性较好,Kappa=0.756;2种方法阳性符合率为74.00%,阴性符合率98.65%,总符合率88.71%。用药超过12个月的患者采用Super-ARMS PCR法检测T790M突变的检出率高于用药小于12个月的患者(P<0.05)。ddPCR法检测突变丰度为0.01%~68.10%。结论2种方法在晚期肺腺癌患者经EGFR-TKI治疗后T790M突变检测中具有较高的一致性,ddPCR法灵敏度更高且可以提供突变丰度的信息。     

Significant benefits of osimertinib in treating acquired resistance to first-generation EGFR-TKIs in lung squamous cell cancer: A case report

BACKGROUND Lung squamous cell cancer(LSCC)rarely harbors epidermal growth factor receptor(EGFR)mutations,even much rarer for acquired T790M mutation.Although clinical trials of AURA series illustrated that non-small cell lung cancer(NSCLC)with EGFR T790M mutation can benefit from osimertinib,only five LSCC patients were enrolled in total;moreover,the efficacy for LSCC was not shown in the results.Therefore,the response of LSCC to osimertinib is still unclear to date.CASE SUMMARY We report an LSCC case with T790M-related acquired resistance after treatments with first-generation EGFR-tyrosine kinase inhibitors(EGFR-TKIs)and benefited from osimertinib significantly.A 63-year-old Chinese man was diagnosed with stage IV(cT2N2M1b)LSCC harboring an EGFR exon 19-deletion mutation.Following disease progression after gefitinib and multi-line chemotherapy,rebiopsy was conducted.Molecular testing of EGFR by amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction detected the exon 19-deletion without T790M mutation.Therefore,the patient was given erlotinib,but progression developed only 3 mo later.Then the frozen re-biopsy tissue was tested by next-generation sequencing(NGS),which detected an EGFR T790M mutation.However,he was very weak with symptoms of dysphagia and cachexia.Fortunately,osimertinib was started,leading to alleviation from the symptoms.Four months later,normal deglutition was restored and partial response was achieved.Finally,the patient achieved an overall survival time period of 29 mo.CONCLUSION Our findings highlight that EGFR T790M mutation may also be an important acquired drug resistance mechanism for LSCC and offer direct evidence of the efficacy of osimertinib in LSCC with T790M mutation.NGS and better preservation conditions may contribute to higher sensitivity of EGFR T790M detection.     

Allelic dilution obscures detection of a biologically significant resistance mutation in EGFR-amplified lung cancer

EGFR is frequently mutated and amplified in lung adenocarcinomas sensitive to EGFR inhibitors gefitinib and erlotinib. A secondary mutation, T790M, has been associated with acquired resistance but has not been shown to be sufficient to render EGFR mutant/amplified lung cancers resistant to EGFR inhibitors. We created a model for studying acquired resistance to gefitinib by prolonged exposure of a gefitinib-sensitive lung carcinoma cell line (H3255; EGFR mutated and amplified) to gefitinib in vitro. The resulting resistant cell line acquired a T790M mutation in a small fraction of the amplified alleles that was undetected by direct sequencing and identified only by a highly sensitive HPLC-based technique. In gefitinib-sensitive lung cancer cells with EGFR mutations and amplifications, exogenous introduction of EGFR T790M effectively conferred resistance to gefitinib and continued ErbB-3/PI3K/Akt signaling when in cis to an activating mutation. Moreover, continued activation of PI3K signaling by the PIK3CA oncogenic mutant, p110alpha E545K, was sufficient to abrogate gefitinib-induced apoptosis. These findings suggest that allelic dilution of biologically significant resistance mutations may go undetected by direct sequencing in cancers with amplified oncogenes and that restoration of PI3K activation via either a T790M mutation or other mechanisms can provide resistance to gefitinib.     

奥西替尼治疗EGFR T790M突变的老年晚期肺腺癌患者1例

1例表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)基因第19外显子突变阳性肺腺癌患者接受第一代EGFR抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)治疗后,无进展生存期(progression-free survival,PFS)达31个月,此后病情进展,患者肺内病灶增大,行血液标本基因检测,提示T790M突变,予以奥希替尼靶向治疗19个月,2019年9月患者仍未达到PFS。奥希替尼治疗T790M突变老年肺腺癌,疗效确切,安全性较好,该例患者主要不良反应为腹泻。     

Combined treatment with silibinin and epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors overcomes drug resistance caused by T790M mutation

Although epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors (EGFR-TKI) produce an initially dramatic response in lung cancer patients harboring a mutation in the EGFR gene, development of acquired resistance is almost inevitable. A secondary mutation of threonine 790 (T790M) is associated with approximately half of the cases of acquired resistance. This study investigated whether the addition of silibinin to therapy with gefitinib or erlotinib could overcome T790M-mediated drug resistance considering that silibinin has various antitumor effects, including EGFR modulation. Silibinin selectively reduced the activity of the EGFR family (EGFR, ErbB2, and ErbB3) through the inhibition of receptor dimerization in lung cancer cells with EGFR mutations, but not in those harboring the wild type. In primary and acquired resistant cells with T790M, addition of silibinin enhanced the ability of EGFR-TKIs to downregulate EGFR signals and to inhibit cell growth. Similarly, the combination of silibinin and erlotinib effectively suppressed tumor growth in erlotinib resistance-bearing PC-9 xenografts. The results indicate that the addition of silibinin to EGFR-TKIs is a promising strategy to overcome T790M-mediated drug resistance.     

宁夏某医院225例非小细胞肺癌患者EGFR基因突变检测结果分析

目的分析宁夏某医院非小细胞肺癌(NSCLC)患者表皮生长因子受体(EGFR)基因突变检测结果。方法选择2014年1月至2017年12月在宁夏医科大学总医院住院的NSCLC患者225例进行回顾性分析,用扩增阻滞突变系统-聚合酶链反应(ARMS-PCR)检测EGFR基因突变情况。结果 EGFR基因总突变率50.22%(113/225),最常见突变位点为19外显子19-del及21外显子L858R,突变率分别为21.33%及17.78%,20外显子T790M耐药突变率及20-Ins插入突变(非敏感突变)的突变率分别为3.56%及1.33%;EGFR各外显子双突变共10例;EGFR基因突变率在性别、年龄、民族、季节、标本类型之间差异无统计学意义(P>0.05),在年份、病理类型之间差异有统计学意义(P<0.05)。结论 ARMS-PCR可有效应用于临床病理石蜡标本基因突变检测,EGFR基因在19和21外显子存在较高的突变率,其突变亚型能指导小分子表皮生长因子酪氨酸酶抑制剂(EGFR-TKI)的肿瘤靶向治疗。     

LAMP技术检测非小细胞肺癌患者外周血EGFR基因L858R位点突变方法的建立及应用

目的利用环介导等温扩增(LAMP)技术建立非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血靶点表皮生长因子受体(EGFR)基因L858R位点突变的快速筛查方法。方法在Genebank上查找EGFR 21号外显子(L858R)的DNA序列,利用Primer Explorer V4软件设计特异性引物,建立LAMP检测方法,并对其特异性和敏感性进行评价。采集11例临床病理诊断为NSCLC患者外周血血浆,以聚合酶链反应(PCR)扩增结果为标准,对建立的LAMP方法的准确性进行验证。结果采用自行设计的LAMP引物及构建的反应体系可特异性扩增EGFR L858R位点突变阳性DNA,检测敏感性为0.1%,特异性达到100%。LAMP法在11例EGFR L858R位点突变阳性的NSCLC患者血浆标本中检测到9例阳性。结论成功建立了LAMP检测人外周血浆EGFR基因突变方法,诊断敏感性、特异性和准确性均较高,可荧光目测判读检测结果,是一种简单、快速的EGFR基因突变筛查方法。     

奥希替尼治疗T790M突变的晚期肺腺癌1例并文献复习

在肺癌的驱动基因中,表皮生长因子(epidermal growth factor receptor,EGFR)是其最常见的驱动基因之一。在EGFR突变阳性的患者中,一线使用表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)(例如吉非替尼、埃克替尼、阿法替尼等)口服治疗,已经体现出良好的疗效。但大多数患者在服用初始一线的TKIs治疗后出现T790M突变,引起耐药,导致疾病进展。嘉兴市第二医院呼吸与危重症医学科收治的1例EGFR突变阳性患者,在使用吉非替尼片口服治疗1年后,出现疾病进展。行基因检测后提示T790M突变阳性,改奥希替尼口服。目前患者疗效评价为部分缓解。奥希替尼对于出现T790M突变患者的治疗,有着稳定的疗效。早期及时将临床、病理和分子诊断学技术联合起来对患者治疗进行全程管理,可以为晚期非小细胞肺癌患者的治疗提供强有力的保障。