肠球菌菌种鉴定方法的探索

  目的  选择一种能将肠球菌属鉴定到种水平的快速准确的方法。  方法  分别使用生化鉴定方法、16S rRNA基因测序技术、rpoA基因测序技术、基因组杂交技术（DNA–DNA hybridization，DDH）和平均核苷酸相似度（Average nucleotide identity，ANI）对12株肠球菌进行种水平鉴定，并比较生化鉴定方法、16S rRNA基因测序技术和rpoA基因测序技术和DDH/ANI结果的一致性。  结果  经过DDH和ANI鉴定，分离自高原野生岩羊粪便的12株肠球菌中有5株屎肠球菌，4株海氏肠球菌，1株蒙氏肠球菌，1株鹑鸡肠球菌和1株疑似肠球菌属内新种，rpoA基因序列比对结果与DDH/ANI结果高度一致，生化鉴定和16S rRNA基因测序技术与DDH/ANI结果不完全相符。  结论  rpoA基因序列比对可以方便快捷准确的将肠球菌鉴定到种水平。     

喜马拉雅旱獭源鹑鸡肠球菌的分离及其耐药性检测

目的 了解青藏高原喜马拉雅旱獭携带院内感染病原菌鹑鸡肠球菌情况,并检测其对临床常用抗菌药物的耐药性。方法 选择性培养基、革兰染色、生化反应和16S rRNA基因序列分析方法对细菌进行分离和鉴定;K-B纸片法检测菌株对15种抗菌药物的耐药情况,并应用PCR方法检测毒力基因和耐药基因。结果 79份喜马拉雅旱獭肠道样本中共分离到3株鹑鸡肠球菌,其中1株对利福平中介,3株均对奎奴普丁中介,对其他被检抗菌药物均敏感;未检测到常见肠球菌毒力基因(asa1、esp、hyl、gelE和cylA)和相关耐药基因。结论 首次在青藏高原旱獭粪便中分离到鹑鸡肠球菌,常见的毒力基因检测阴性,对常见抗菌药物敏感。     

致血液感染的活泼瘤胃球菌的分离与鉴定

目的鉴定1株临床分离活泼瘤胃球菌。方法取2020年8月就诊于海南省人民医院的1例败血症患者的血液标本进行细菌培养、革兰染色,采用Vitek 2 Compact生化鉴定和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)结合16S rRNA PCR扩增及测序鉴定分离株。结果该分离菌为革兰阳性链球菌,专性厌氧,MALDI-TOF MS鉴定置信度为83.7%;16S rRNA PCR产物为1446 bp,与已知活泼瘤胃球菌ATCC 29149^T序列号(NR 036800.1)16S rRNA基因同源性为99%,由分离株的系统进化树可知,该分离菌与标准菌株活泼瘤胃球菌ATCC 29149^T位于同一分支。结论常规生化方法无法鉴定出该菌,16S rRNA检测与MALDI-TOF MS结合可用于活泼瘤胃球菌鉴定。     

16S rDNA序列在艾伯特埃希菌鉴定中的应用

目的 通过16S rRNA基因序列分析快速鉴定艾伯特埃希菌。方法 以30株疑似艾伯特埃希菌为材料,使用通用引物扩增其16S rRNA基因并进行测序。获得的序列与艾伯特埃希菌型菌株LMG 20976,基因组测序菌株KF1、NBRC107761、TW07627以及其他密切相关的细菌种(大肠埃希菌、赫曼埃希菌、费格森埃希菌、志贺菌和Shimwellia blattae)的16S rRNA基因序列进行比较,并使用N-J法构建进化树来分析其相关性。结果 30株疑似艾伯特埃希菌的16S rRNA基因序列与艾伯特埃希菌参考菌株的序列相似性最高,并与其聚类为一簇,为艾伯特埃希菌。结论 16S rRNA基因测序分析可用于艾伯特埃希菌的快速鉴定。     

应用16S rRNA基因序列分析鉴定从痰培养中分离的假肺炎链球菌

目的对含有革兰阳性球菌的痰培养分离出的草绿色链球菌样菌落进行16S rRNA基因序列分析与质谱鉴定,探讨16S rRNA基因序列分析与质谱在临床病原菌鉴定方面的意义。方法将分离的菌株采用奥布托辛(OP)试验、Vitek MS质谱鉴定以及16S rRNA基因测序进行鉴定。结果OP试验结果在5%CO2气体环境中抑菌圈直径为15mm,在大气中培养抑菌圈直径为25mm。Vitek MS质谱鉴定显示为假肺炎链球菌,可信度99.9%。16S rRNA基因测序鉴定结果显示该菌与肺炎链球菌的相似度为99.63%,与假肺炎链球菌的相似度更高为99.75%。结论结合表型鉴定结果,可进一步确定分离株为假肺炎链球菌。     

54株分枝杆菌国际参考株16S rRNA序列分析

目的分析54株分枝杆菌国际参考株16S rRNA序列,为临床分离株的鉴定提供参考。方法用16S rRNA序列分析法对54株分枝杆菌国际参考株进行分析,构建系统发育树,计算相似性百分比。结果除11株（共9种4组）分枝杆菌,即产鼻疽分枝杆菌与塞内加尔分枝杆菌;溃疡分枝杆菌与海分枝杆菌;堪萨斯与胃分枝杆菌;3株结核分枝杆菌与田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌16S rRNA基因序列完全相同无法相互鉴别,其它41株（共41种）分枝杆菌菌种间16S rRNA均不相同可以得到很好的鉴别。结论 16S rRNA基因序列分析是一种很好的鉴定分枝杆菌的方法,国际参考株16S rRNA基因序列的研究弥补了基因数据库的不足。     

54株分枝杆菌国际参考株16S rRNA序列分析

目的分析54株分枝杆菌国际参考株16S rRNA序列,为临床分离株的鉴定提供参考。方法用16S rRNA序列分析法对54株分枝杆菌国际参考株进行分析,构建系统发育树,计算相似性百分比。结果除11株(共9种4组)分枝杆菌,即产鼻疽分枝杆菌与塞内加尔分枝杆菌;溃疡分枝杆菌与海分枝杆菌;堪萨斯与胃分枝杆菌;3株结核分枝杆菌与田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌16S rRNA基因序列完全相同无法相互鉴别,其它41株(共41种)分枝杆菌菌种间16S rRNA均不相同可以得到很好的鉴别。结论 16S rRNA基因序列分析是一种很好的鉴定分枝杆菌的方法,国际参考株16S rRNA基因序列的研究弥补了基因数据库的不足。     

基于16S rRNA和gyrB基因的施万菌种水平鉴定分析

  目的   构建基于16S rRNA和gyrB基因对施万菌(Shewanella)进行种水平鉴定的方法,比较2个基因的鉴定能力差异。   方法   利用DnaSP 6.0软件对施万菌16S rRNA 和gyrB 基因的信息位点数及其百分比、核苷酸多态性值、平均G＋C含量、非同义突变率与同义突变率的比值（Ka/Ks）、Tajima检验进行基因多态性分析。 用MEGA 6.06软件的邻接距离矩阵法对90株测试菌株和54株模式菌株构建16S rRNA 和gyrB 基因的进化树。 用MEGA 6.06软件的Kimura’s 2-parameter模型,确定90株测试菌株的菌种后,计算16S rRNA 和gyrB 基因的遗传距离和序列相似性。 比较两者对施万菌种水平鉴定能力差异。   结果   16S rRNA和gyrB基因序列相似性平均值分别为95.0%、80.8%。 在16S rRNA基因进化树中,S. marinintestina和S. sairae、S. livingstonensis和S. vesiculosa的进化分支几乎完全相同,gyrB基因则能在种水平将所有菌株区分开。 16S rRNA基因的种内和种间相似性范围小。   结论   与16S rRNA基因相比,gyrB基因能够更准确的用于施万菌的种水平鉴定。     

应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术鉴定临床常见厌氧菌

目的：应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术对临床分离的厌氧菌进行鉴定,与传统Vitek32 ANI鉴定卡及16 S rRNA基因序列法鉴定进行比较,分析MALDI-TOF MS技术用于鉴定临床常见厌氧菌的可行性。方法收集从临床标本培养分离的厌氧菌56株,运用 MALDI-TOF MS 技术对其进行鉴定,同时运用 Vitke32 ANI 鉴定卡及16 S rRNA基因序列法分别进行鉴定,将三者的结果进行比较。结果56株厌氧菌中有41株采用 MALDI-TOF MS技术鉴定至种的水平（分值大于或等于2．0）,11株鉴定至属的水平（分值为1．7～2．0）,4株无可靠结果（分值小于1．7）。MALDI-TOF MS和16S rRNA基因序列法鉴定结果一致的占94．6％（53/56）,不一致的占5．6％（3/56）。MALDI-TOF MS与Vitke32 ANI 鉴定卡的鉴定结果一致的占80．4％（45/56）,不一致的占19．6％（11/56）。结论 MALDI-TOF MS与16S rRNA基因序列法鉴定的符合率高,可应用于临床常见厌氧菌的鉴定。     

1例生痰二氧化碳嗜纤维菌的实验室鉴定及药敏试验

目的全面鉴定1株尿毒症患者血液中分离的生痰二氧化碳嗜纤维菌。方法用血培养仪对尿毒症患者静脉血标本进行需氧和厌氧培养,分离培养阳性培养物,用生化鉴定卡进行生化鉴定,用质谱分析及16S rRNA基因序列分析进行补充鉴定,并用E-test法进行药敏试验。结果该菌为革兰阴性长梭状杆菌,常规方法无法鉴定至种。结合质谱分析及16S rRNA基因序列分析结果,鉴定为生痰二氧化碳嗜纤维菌。该菌对阿米卡星最低抑菌浓度(MIC)为64μg/mL,对其他药物MIC值较低。结论质谱分析和16S rRNA基因序列分析为常规方法无法鉴定至种的细菌鉴定提供了可靠依据,成功将本例细菌鉴定为生痰二氧化碳嗜纤维菌。     

银色棒状杆菌健康携带株耐药性及毒力基因分析

  目的  首次从健康人呼吸道分离到银色棒状杆菌,可进一步探究这一细菌的耐药性和致病性获得此种细菌更加全面的信息。  方法  采用生化鉴定和16S rRNA全长基因序列分析法对2020年大学生健康体检中采集的咽拭子样本进行银色棒状杆菌的分离鉴定,同时对鉴定菌株进行抗生素耐药性测定、基因组测序和耐药基因、毒力基因分析。  结果  从717份健康大学生咽拭子分离到5株银色棒状杆菌。 药敏结果表明这5株菌均对青霉素、莫西沙星、庆大霉素耐药;4株菌对环丙沙星、克林霉素耐药,存在多重耐药情况。 基因组序列分析发现,对克林霉素耐药的菌株均含有耐药基因erm(X),分离菌株携带有Sigma A、GroEL(Hsp60)/Cpn60.2、Nucleoside diphosphate kinase（NDK）、EF-Tu、 MprA/B、 DtxR以及Irp6和 HmuTUV等毒力因子,致病性分析结果表明5株银色棒状杆菌均携带glyA1、mihF、CarD等10个与结核分枝杆菌的毒力密切相关的基因。  结论  首次从健康人咽部分离到银色棒状杆菌,其携带耐药及毒力基因。     

肿瘤靶向治疗新抗原筛选与临床研究进展

肿瘤免疫治疗是近年来研究的热点,而基于靶向肿瘤新抗原的免疫治疗极具广阔前景,但是长期以来,缺乏肿瘤特异性抗原是阻碍肿瘤免疫治疗的瓶颈,因此,发现新的肿瘤特异性抗原一直是基础和临床肿瘤免疫学家梦寐以求的目标。二代测序技术的出现推动了肿瘤新抗原筛选与鉴定的发展。目前主要有全外显子结合转录组测序法、串联微基因序列法、靶基因测序法、共享新抗原肽库法和质谱法等筛选肿瘤新抗原的方法。肿瘤新抗原的发现为临床开展抗原疫苗、抗原特异性T细胞、T细胞受体工程T细胞(T cell receptor genetically engineered T cell,TCR-T)和嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)等靶向肿瘤抗原的免疫治疗提供了优质的靶标。     

引起我国首例婴儿肉毒中毒丁酸梭菌全基因组序列分析

  目的  对我国首次分离自婴儿肉毒中毒病例粪便样品的1株产E型肉毒毒素的丁酸梭菌进行全基因组测序，解析菌株产毒的遗传学特性。  方法  对从婴儿肉毒中毒病例粪便样品中分离的产E型肉毒毒素丁酸梭菌分离株TJ-S提取基因组DNA，利用Pacific Biosciences RSⅡ 平台对菌株进行全基因组测序，并进行序列分析。  结果  TJ-S基因组由一个染色体和一个质粒组成，大小分别为3 949 987 bp和747 151 bp。 GC含量分别为28.8%和28.2%。 染色体上携带产肉毒毒素的bont/e基因，该基因位于典型orfX基因簇内，且在基因簇上游存在3个转座酶编码基因。 遗传进化分析发现，菌株TJ-S在亲缘关系上与引起英国婴儿肉毒中毒的2株产E型肉毒毒素的丁酸梭菌分离株最为接近。  结论  丁酸梭菌携带的产E型肉毒毒素基因位于稳定的orfX基因簇内，可引起人类肉毒中毒。 本报道是我国第一次对产E型肉毒毒素丁酸梭菌进行全基因组学分析。     

2021年武汉市一起肠炎沙门菌引起的跨区食源性疾病暴发的病原学分析

  目的  对2021年武汉市一起跨区食源性疾病暴发事件进行病原菌的鉴定和溯源分析，查明事件暴发原因。  方法  采集此次食源性疾病暴发事件中相关人员的肛拭子样本、粪便样本和食品样本进行分离培养，用VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定系统鉴定分离到的菌株，并进行血清学分型，耐药性敏感试验；采用脉冲场凝胶电泳法（PFGE）对本次事件的检出菌及近两年本地区临床散发病例的同型别菌株进行分子分型和聚类分析；提取本次事件病原菌和本地区同型别菌株的核酸进行全基因组测序，通过基因注释和序列比对分析病原菌的毒力因子与耐药基因，结合多位点序列分型，变异位点检测和不同地区同型别菌株的全基因组序列构建基于单核苷酸多态性的系统发育树对病原菌进行溯源。   结果  共分离出5株肠炎沙门菌，其中2株来自食物样本，3株来自患者粪便和肛拭子样本。 5株检出菌的PFGE带型完全相同，均对抗生素阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、头孢唑啉、头孢西丁、头孢呋辛、甲氧苄啶–磺胺甲恶唑耐药，携带相同的耐药基因和毒力因子，均为ST11型。 本次事件检出菌株的序列间仅存在1个突变位点。 检出菌的全基因组序列与本地肠炎沙门菌序列高度相似。   结论  肠炎沙门菌为本次事件的致病菌。经同源性分析，此株病原菌为本地区肠炎沙门菌流行株。 全基因组测序技术可作为PFGE分子分型的补充应用于病原菌的监测和暴发事件调查。     

中国脑膜炎奈瑟菌ST-4821克隆群荚膜基因簇分布特征

目的了解中国脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis,Nm）高致病性ST-4821克隆群（CC4821）荚膜基因簇分布特征,为流行性脑脊髓膜炎的传播扩散机制研究提供依据。方法使用Artemis、MEGA 6、SimPlot和RDP等软件分析41株Nm全基因组序列,分析荚膜基因簇序列差异性、序列重组和基因排布等特征。结果荚膜基因簇ACE区差异较大,重组现象多集中在AC区。 D和D′区有明显差异序列,表明这2个区并非精准复制。 荚膜基因簇存在基因反转现象。结论Nm高致病性CC4821荚膜基因簇呈现多态性、重组和基因反转等多种荚膜调节机制,可能有助于该克隆群菌株的传播扩散。     

2018年浙江省余姚市一起伊桑吉沙门菌引起的食源性疾病暴发事件调查

目的研究2018年浙江省余姚市发生的一起因食用被伊桑吉沙门菌污染的烤鸭引起的食源性疾病暴发事件,了解病原的生物学特性、分子分型及药敏特征。方法使用国家标准对可疑食品样本进行致病菌检测,对收集的沙门菌进行系统生化和血清型鉴定,利用纸片扩散法进行药敏试验,采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）和全基因组测序（WGS）方法进行分子分型分析,通过查阅患者就诊记录和回访进行流行病学、临床和实验室调查。结果经流行病学调查和实验室检测确认为一起因食用被伊桑吉沙门菌污染的烤鸭引起的食源性疾病暴发事件,共分离到3株伊桑吉沙门菌,均为单耐药株（耐复方新诺明）。 3株菌PFGE带型完全一致,均为ST216型,全基因组多位点序列分型（wgMLST）分析发现2株患者分离株存在1个差异等位基因,但均携带126种已知毒力基因和1个氨基糖苷类耐药基因aac（6）-Iaa。结论此次事件为一起因食用被ST216型伊桑吉沙门菌污染的烤鸭引起的食源性疾病暴发事件,为余姚市首次报道。     

实时荧光定量PCR方法检测青藏高原喜马拉雅旱獭血样中布鲁氏菌DNA

  目的   应用实时荧光定量PCR（real-time PCR）方法检测青藏高原喜马拉雅旱獭血样中布鲁氏菌DNA。  方法   2019—2020年收集青海省青藏高原喜马拉雅旱獭全血,进行布鲁氏菌病血清学试验,包括虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）微量法、胶体金免疫试验（GICA）,阳性标本进行real-time PCR检测。 分析real-time PCR方法的灵敏度、特异度等指标,评价其结果的准确性。  结果   共收集全血1 466份,RBT检出阳性64 份,GICA检出阳性28份,SAT检出阳性18份。64 份RBT阳性标本进行real-time PCR检测,其中56份标本及阳性对照菌株有特异的荧光扩增曲线,8份标本及阴性对照无特异的扩增曲线。 real-time PCR与SAT、GICA比较灵敏度为100%,与RBT比较特异度为99.93%,Kappa值为0.81,高度一致。  结论   与传统方法相比,real-time PCR方法具有快速、特异等优点,可以用于青藏高原喜马拉雅旱獭样本检测。     

碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌ST11菌株的基因组学特点分析

目的分析碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)ST11菌株的基因组学特点。方法挑取南京地区流行的3株CRKP-ST11菌株,提取基因组DNA,进行全基因组学测序,获得拼接后的全基因组。同时,从NCBI数据库中下载HS11286(中国上海)、JM45(中国杭州)、ATCC BAA-2146(美国/印度)的基因组为对照菌株,进行基因组GC碱基含量、单核苷酸多态性、亲缘关系及荚膜多糖(CPS)基因簇结构分析。结果CPS基因簇的G+C含量大多<50%,不同于染色体其他部分,是CRKP-ST11的主要单核苷酸多态性位点;进化树分析显示南京地区分离的3株CRKP-ST11菌株与上海、杭州的CRKP-ST11亲缘关系相近,与美国/印度的CRKP-ST11较远。这3株CRKP-ST11的CPS基因簇一致,与杭州、上海及美国/印度的3株CRKP-ST11菌株的差异主要在CPS可变区。结论CPS是CRKP-ST11的主要单核苷酸多态性位点,可能是CRKP-ST11菌株的主要进化区,CRKP-ST11的流行可能与CPS基因簇可变区有关,具有地域特点。     

dapb1基因对诺卡菌系统分类和物种鉴定方法的建立与评价

目的 评价dapb1基因对诺卡菌属系统分类和物种鉴定的能力.方法 从公共数据库中获得230株菌株(198株诺卡菌属菌株和32株非诺卡菌属菌株)基因组序列,从198株诺卡菌(90株模式菌株、31株标准菌株和77株临床菌株)基因组中提取dapb1基因,采用clustalo进行多序列比对,并用iqtree构建系统发育树.计算...