马钱子碱对一氧化氮诱导软骨细胞凋亡的影响

目的:观察中药马钱子碱对一氧化氮(nitricoxide,NO)在体外诱导的兔软骨细胞凋亡的影响。方法:取体外培养的新西兰兔软骨细胞,分别加入硝普钠(SNP)培养12,24,48h,用透射电镜和流式细胞仪观察软骨细胞凋亡的变化,并以不同剂量马钱子碱加入NO诱导的软骨细胞凋亡体系培养24h,采用annexinV/PI方法检测凋亡情况。结果:在体外培养兔软骨细胞加入硝普钠24h,流式细胞仪检测早期凋亡率为(38.7±6.5)%。空白对照组为(2.4±1.4)%(t=10.90,P<0.01),透射电镜可见典型软骨细胞早期凋亡形态改变,并有一定时间依赖性,加入不同剂量马钱子碱,其凋亡率明显下降,并以高剂量最为显著为(2.9±1.1)%。马钱子碱高剂量组加入硝普钠后与正常软骨细胞组比较,二者凋亡率无显著差异性(t=0.51,P>0.05)。结论:硝普钠在体外能诱导软骨细胞凋亡,马钱子碱能明显降低NO诱导的软骨细胞早期凋亡,提示马钱子碱能有效治疗骨关节炎,可能与抑制软骨细胞早期凋亡有关。     

马钱子碱对一氧化氮诱导软骨细胞凋亡的影响

目的：观察中药马钱子碱对一氧化氮(nitric oxide，NO)在体外诱导的兔软骨细胞凋亡的影响。方法：取体外培养的新西兰兔软骨细胞，分别加入硝普钠(SNP)培养12，24．48h，用透射电镜和流式细胞仪观察软骨细胞凋亡的变化，并以不同剂量马钱子碱加入NO诱导的软骨细胞凋亡体系培养24h，采用annexin V／PI方法检测凋亡情况。结果：在体外培养兔软骨细胞加入硝普钠24h，流式细胞仪检测早期凋亡率为(38．7&;#177;6．5)％。空白对照组为(2．4&;#177;1．4)％(t=10．90，P&;lt;0．01)，透射电镜可见典型软骨细胞早期凋亡形态改变，并有一定时间依赖性，加入不同剂量马钱子碱，其凋亡率明显下降，并以高剂量最为显著为(2．9&;#177;1．1)％。马钱子碱高剂量组加入硝普钠后与正常软骨细胞组比较，二者凋亡率无显著差异性(t=0，51，P&;gt;0．05)。结论：硝普钠在体外能诱导软骨细胞凋亡，马钱子碱能明显降低NO诱导的软骨细胞早期凋亡，提示马钱子碱能有效治疗骨关节炎，可能与抑制软骨细胞早期凋亡有关。     

生殖细胞凋亡过程中外源性一氧化氮的参与及其效应

目的:观察大鼠睾丸生殖细胞凋亡与体外一氧化氮供体硝普钠干预的影响。方法:实验于2005-03/12在解放军第四军医大学西京医院检验科和秦都口腔医院病理科进行。取20×109L-1大鼠生殖细胞悬液0.5mL,分别加入0,100,200和300nmol/L浓度的硝普钠于37℃,体积分数为0.05的CO2培养箱中分别孵育1,5,10,15和20h后,采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的原位末端标记法检测细胞凋亡情况,透射电镜观察生殖细胞超微结构,琼脂糖凝胶电泳检测生殖细胞凋亡特征性DNA片段。结果:①0,100,200和300nmol/L硝普钠作用生殖细胞15h,生殖细胞凋亡率分别为(1.48±0.35)%,(5.06±1.50)%,(9.25±1.28)%,(19.68±2.03)%,作用20h分别为(1.50±0.36)%,(9.51±1.26)%,(22.68±2.06)%,(46.37±2.08)%,呈剂量时间依赖性,加硝普钠的生殖细胞凋亡率明显高于未加硝普钠的生殖细胞(P<0.01)。②透射电镜观察硝普钠处理15～20h后的生殖细胞核染色质凝集,附着于核边缘呈新月形,核固缩、碎裂形成凋亡小体。③琼脂糖凝胶电泳显示生殖细胞DNA片段呈现凋亡特征性的梯形区带。结论:一氧化氮供体硝普钠可诱导生殖细胞的凋亡。     

硝普钠促进辐射诱导的K562细胞凋亡的相关研究

目的：观察经不同剂量X射线及联合一氧化氮供体硝普钠在照射后不同时间点对K562细胞生长增殖及凋亡的影响，为提高肿瘤放射治疗效果提供理论依据。方法：以人红白血病细胞株K562细胞为研究对象，加入终浓度为0．1mmol／L的硝普钠共孵育一段时间后，经不同剂量X射线照射，继续培养不同时间分别收获细胞样品，MTT法检测细胞增殖．AO／EB双染法和流式细胞仪检测细胞凋亡和周期。结果：单纯辐射与硝普钠联合辐射对K562细胞的生长增殖均有一定的抑制作用并诱导其凋亡。且硝普钠与辐射联合作用时。X射线诱导K562细胞生长增殖抑制及细胞的凋亡率大于硝普钠和X射线单独作用之和。且随时间的延长及照射剂量的增加而增加；硝普钠对细胞周期的影响在照射前后小剂量（〈4Gy）时没有明显差异，均以G0／G1期阻滞为主，只是在大剂量时有明显不同；8Gy、12h时，照射前以G0／G1期阻滞为主，照射后12h出现明显的G2/M期阻滞，随照射剂量的增加G2／M期阻滞达到高峰，以后随时闾的延长G／M期阻滞逐渐解除，组问有统计学差异。结论：硝普钠在一定程度上可以抑制肿瘤细胞的生长增殖并促进辐射所致肿瘤细胞的凋亡。提高肿瘤细胞的辐射敏感性。[著者文摘]     

壳寡糖对体外培养软骨细胞增殖的影响及对IL-1β诱导凋亡的保护作用

目的 体外实验研究不同浓度壳寡糖对软骨细胞增殖及IL-Iβ诱导细胞凋亡的保护作用.方法 从8周龄SD大鼠乳鼠膝关节分离、培养原代软骨细胞,鉴定后选用第2代软骨细胞进行实验.分别加入不同浓度壳寡糖培养48 h,通过CCK-8细胞计数法检测软骨细胞的增殖情况;采用IL-1β诱导软骨细胞凋亡,同时加入不同浓度的壳寡糖处理,倒置相差显微镜下观察软骨细胞形态及核分裂象的变化,通过流式细胞仪检测细胞早期凋亡比例,并通过Hoechst33258荧光染色检测软骨细胞凋亡细胞核的形态学变化.结果 CCK-8检测结果表明壳寡糖作用软骨细胞不同浓度、不同时间的软骨细胞增殖率比较均无显著性差异（P＞0.05）;流式细胞检测结果表明壳寡糖不仅扭转了细胞活力和增殖活性的下降,而且改善了IL-1β诱导的软骨细胞核染色质的损害,同时对软骨细胞凋亡率也有不同程度的降低.结论 一定浓度的壳寡糖对软骨细胞增殖无明显影响;壳寡糖能明显抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡,且呈剂量依赖性.     

不同浓度一氧化氮供体对培养海马神经元存活率影响的相关研究

目的:观察不同浓度一氧化氮供体硝普钠对培养海马神经元存活率的影响以及不同类型钾通道阻断剂对硝普钠诱导的神经元死亡的保护作用。方法:实验于2004-11/2005-04在南方医科大学基础医学院神经生物学教研室实验室进行。①取新生两天以内SD大鼠海马组织做神经元分散细胞原代培养,培养第8天时,分别以不同浓度硝普钠(0.01mmol/L,0.1mmol/L,0.5mmol/L,1mmol/L)处理18h,采用MTT法观察硝普钠对神经元存活率的影响。②硝普钠(0.1mmol/L)处理前10min培养液内预先分别给予钾通道阻断剂四乙铵1mmol/L、4-氨基砒碇1mmol/L、Iberiotoxin(IBTX)100nmol/L或paxilline100μmol/L,18h后测定神经元存活率。结果:①低浓度硝普钠(0.01mmol/L)对培养海马神经元存活无影响(P>0.05),增大硝普钠浓度至0.1mmol/L,0.5mmol/L或1mmol/L可引起神经元存活率浓度依赖性地降低(P<0.001)。②硝普钠(0.1mmol/L)处理前10min给予不同类型钾通道阻断剂,广谱钾通道阻断剂1mmol/L四乙铵或A型钾通道阻断剂1mmol/L4-氨基砒碇均不能降低硝普钠诱导的神经元死亡(P>0.05);两种不同的特异性大电导钙激活钾通道阻断剂100nmol/LIBTX或10μmol/Lpaxilline均可完全保护硝普钠诱导的神经元死亡(P<0.001)。结论:一氧化氮供体硝普钠剂量依赖性地诱导培养新生大鼠海马神经元死亡,大电导钙激活钾通道阻断剂对一氧化氮诱导的神经元死亡具有完全保护作用,提示阻断大电导钙激活钾通道可能作为临床治疗缺血性脑损伤的新靶点。     

硝普钠诱导K562细胞凋亡过程中STAT3/P38MAPK活化及端粒酶hTERT-mRNA表达的研究

为了研究外源性一氧化氮供体硝普钠（SNP）诱导K562细胞凋亡过程中STAT3及P38MAPK活化及端粒酶hTERT—mRNA表达的变化，探讨硝普钠诱导K562细胞凋亡机制，用Annexin—V／PI双标记、DNA片段原位末端标记法、DNA凝胶电泳、DNA含量及细胞周期分析等方法检测细胞凋亡。用流式细胞术测定经硝普钠干预后瞄62细胞磷酸化P38MAPK和磷酸化STAT3的表达，同时利用实时荧光PCR定量检测端粒酶hTERT—mRNA表达的变化。结果表明：K562细胞经硝普钠作用后出现典型的细胞形态改变，DNA片段化，显现亚G1峰Ⅱ并显著增加。Annexin—V／PJ和DNA片段原位末端标记表达增加。这些均证实NO能诱导瞄62细胞凋亡，大部分细胞阻滞于G0／G1期。SNP诱导K562细胞凋亡过程中，磷酸化P38MAPK和磷酸化STAT3的表达随SNP浓度的增加而表现为先增强后下降；瞄62细胞与2．0mmol／LSNP孵育不同的时间内，磷酸化P38MAPK的表达在12小时时达到高峰并持续至48小时，72小时后表达下降；磷酸化STAT3的表达在24小时时达高峰，48小时后表达即显著下降；端粒酶hTERT—mRNA的表达随SNP作用的浓度增加和时间延长而显著下调。结论：SNP能诱导K562细胞凋亡，其机制可能与P38MAPK的活化、抑制端粒酶逆转录酶和STAT3的活化有关。     

一氧化氮对鼻咽癌CNE-2细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨外源性NO对CNE-2细胞增殖与凋亡的影响。方法:分别用不同浓度NO供体药物硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)干预CNE-2细胞,观察细胞形态学变化、检测细胞的抑制率及细胞的凋亡和坏死率。结果:SNP以浓度依赖性方式抑制CNE-2细胞增殖,SNP 100,200,400,600,800,1 600,3 200μmol/L各组细胞抑制率与药物浓度呈正相关;SNP以浓度依赖性方式促进CNE-2细胞凋亡,SNP(1 000μmol/L)组细胞凋亡率较SNP(600μmol/L)组显著增高(P0.05)。结论:外源性NO能抑制CNE-2的增殖,促进CNE-2的凋亡,其抑制效应与NO浓度呈正相关。     

萘普生对体外宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨萘普生对人子宫颈癌Hela细胞增殖和凋亡的影响。方法:用含不同浓度的萘普生细胞培养液(1、10、100、300、500μg/mL)于不同作用时间(6、12、24、48h)处理宫颈癌Hela细胞48h后,采用MTT法检测不同浓度的萘普生细胞培养液在不同作用时间下对Hela细胞增殖率的影响;用500μg/mL的萘普生细胞培养液处理宫颈癌Hela细胞48h后荧光显微镜观察细胞形态变化,并采用Annexin V-FITC/PI染色,以流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果:(1)MTT法显示,不同浓度的萘普生细胞培养液对Hela细胞均有抑制作用,不同药物浓度组在同一作用时间下对Hela细胞生长抑制率的差异有统计学意义(P<0.01),同一药物浓度在不同作用时间组之间的细胞生长抑制率的差异也有统计学意义(P<0.01)。(2)Hoechst33342染色后,经荧光显微镜观察,可见到染色质浓缩及凋亡小体等凋亡特征。(3)流式细胞仪检测显示萘普生处理宫颈癌Hela细胞48h后,细胞凋亡率明显增加。结论:萘普生在体外对Hela细胞增殖具有抑制作用,且抑制作用呈时间依赖性及浓度依赖性。     

不同浓度一氧化氮供体对培养海马神经元存活率影响的相关研究

目的：观察不同浓度一氧化氮供体硝普钠对培养海马神经元存活率的影响以及不同类型钾通道阻断剂对硝普钠诱导的神经元死亡的保护作用。 方法：实验于2004-11／2005—04在南方医科大学基础医学院神经生物学教研室实验室进行。①取新生两天以内SD大鼠海马组织做神经元分散细胞原代培养，培养第8天时，分别以不同浓度硝普钠（0．01mmol／L，0．1mmol／L，0．5mmol／L，1mmol／L）处理18h，采用MTT法观察硝普钠对神经元存活率的影响。②硝普钠（0．1mmol／L）处理前10min培养液内预先分别给予钾通道阻断剂四乙铵1mmol／L、4-氨基砒碇1mmol／L、Iberiotoxin（IBTX）100nmol／L或paxilline100μmol／L，18h后测定神经元存活率。 结果：①低浓度硝普钠（0．01mmol／L）对培养海马神经元存活无影响（P〉0.05），增大硝普钠浓度至0．1mmol／L，0．5mmol／L或lmmol／L可引起神经元存活率浓度依赖性地降低（P〈0．001）。②硝普钠（0．1mmol／L）处理前10min给予不同类型钾通道阻断剂，广谱钾通道阻断剂1mmol／L四乙铵或A型钾通道阻断剂lmmol／L 4-氨基砒碇均不能降低硝普钠诱导的神经元死亡（P〉0．05）；两种不同的特异性大电导钙激活钾通道阻断剂100nmol／LIBTX或10μmol／Lpaxilline均可完全保护硝普钠诱导的神经元死亡（P〈0．001）。 结论：一氧化氮供体硝普钠剂量依赖性地诱导培养新生大鼠海马神经元死亡，大电导钙激活钾通道阻断剂对一氧化氮诱导的神经元死亡具有完全保护作用，提示阻断大电导钙激活钾通道可能作为临床治疗缺血性脑损伤的新靶点。     

极低频磁场诱导人肝癌细胞的凋亡

背景:磁场能在体内或体外影响肿瘤细胞的生长与分裂,但目前尚无定论磁场能否在体外诱导人肝癌细胞的凋亡。目的:观察极低频磁场诱导人肝癌细胞SK-HEP-1凋亡的效果。设计:开放性实验。单位:上海交通大学生物技术研究所。材料:实验于2004-09/2005-01在上海交通大学生物技术研究所完成。人肝癌细胞SK-HEP-1购于上海中科院细胞库。方法:SK-HEP-1细胞以2.0×104L-1接种,生长于含有体积分数为0.1的热灭活新生牛血清和2mmol/LL-谷氨酰胺的DMEM培养基中,50Hz,20mT磁场对人肝癌细胞SK-HEP-1连续作用8d;对照组细胞则在另一个培养箱中培养,除无磁场干预外,与磁场处理组细胞的生长条件完全一致。在细胞培养的第8天以DNA梯度电泳、Hoechst33258染色和AO/EB双染色检测凋亡情况。主要观察指标:①有无DNA断裂后形成的梯度。②有无异常的细胞核。③凋亡细胞的比例。结果:①DNA梯度电泳检测细胞核间DNA裂解情况:SK-HEP-1细胞在极低频磁场处理8d后产生DNA片段条带,对照组中(无磁场处理)则未观察到此特征性DNA条带。②Hoechst33258荧光染色细胞凋亡分析:Hoechst33258染色被用来研究细胞中核的变化,在极低频磁场处理过的细胞中,存在许多包含有细胞核片段的凋亡小体,但在对照组中则几乎没有。同时,磁场处理的细胞观察到有细胞质皱缩现象,在某些细胞中,甚至细胞膜都不完整。③AO/EB双染细胞凋亡分析:极低频磁场处理后活细胞的比例(9.2%)与对照组(91.8%)相比极为低下,且伴有很高的细胞凋亡率(72.3%),对照组细胞凋亡率为4.2%,凋亡细胞中的大多数属于凋亡早期。磁场处理后坏死细胞的比例(18.5%)也比对照组(4%)要高。AO/EB双染结果显示AO/EB双染后细胞的不同形态,其中对照组的细胞呈亮绿色的完整圆球状,而磁场处理后的细胞则呈现出不规则的细胞形态且有凝集的细胞核。结论:50Hz,20mT极低频磁场能在体外诱导人肝癌细胞SK-HEP-1发生凋亡。     

双醋瑞因对白细胞介素1β诱导软骨细胞凋亡的影响

背景：双醋瑞因是一种新型的白细胞介素1阻滞剂,其是否对软骨细胞的凋亡有抑制作用以及是否通过细胞信号转导通路发挥作用的基础应用研究较少。目的：观察双醋瑞因对体外白细胞介素1β诱导大鼠关节软骨细胞凋亡的影响。方法：体外培养SD大鼠关节软骨细胞,苏木精-伊红染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色鉴定软骨细胞,用白细胞介素1β诱导大鼠关节软骨细胞凋亡模型,再用10-4,10-5,10-6mol/L双醋瑞因干预培养。结果与结论：10-4mol/L和10-5mol/L的双醋瑞因可降低白细胞介素1β诱导的软骨细胞凋亡率（P〈0.01和P〈0.05）。10-5mol/L双醋瑞因能够显著抑制白细胞介素1β诱导p38磷酸化（P〈0.01）。双醋瑞因干预的软骨细胞中p38mRNA的表达量较模型组下降0.38倍（P〈0.01）。结果证实,双醋瑞因能够抑制软骨细胞中p38蛋白和基因的表达,从而抑制白细胞介素1β诱导关节软骨细胞凋亡。     

电针后血清对肿瘤坏死因子α诱导软骨细胞凋亡的影响

背景:电针具有活血化瘀、行气止痛、舒筋通络的作用,能有效缓解骨性关节炎的临床症状。目的:观察电针后血清对肿瘤坏死因子α诱导软骨细胞凋亡的影响。方法:采用机械-酶消化法分离3周龄SD大鼠膝关节软骨细胞,用10μg/L的肿瘤坏死因子α诱导体外培养软骨细胞的凋亡,同时给予正常大鼠血清、骨性关节炎大鼠血清、透明质酸钠治疗的骨性关节炎大鼠血清、及电针内、外膝眼5,15,30min治疗的骨性关节炎大鼠血清进行干预。结果与结论:电针内、外膝眼15,30min治疗的骨性关节炎大鼠血清干预24h,软骨细胞活力显著增高,凋亡显著减少。说明电针后血清能有效抑制肿瘤坏死因子α诱导的软骨细胞凋亡。     

硼替佐米单用或联合三尖杉酯碱体外诱导HL-60细胞凋亡实验研究

本研究探讨硼替佐米（bortezomib,Bor）单用或联合三尖杉酯碱（harringtonine,HT）对HL-60细胞凋亡的影响。以不同浓度Bor、HT处理HL-60细胞12-48小时,采用MTT比色法检测细胞增殖活性,以DNA凝胶电泳、荧光显微镜检、流式细胞术检测细胞凋亡。结果表明：10-50nmol/LBor可有效抑制HL-60细胞增殖,并诱导其凋亡。其中10nmol/L剂量处理12小时即有细胞凋亡发生,延长作用时间或增加药物剂量可使细胞凋亡率明显增加。30nmol/LHT与10nmol/LBor联合应用时,可见HL-60细胞凋亡率比两种药物单独使用时显著增加。结论：Bor对HL-60细胞具有时间和剂量依赖性的细胞凋亡诱导效应,与HT联合应用有明显的协同作用。     

IL-1β对小鼠软骨细胞中 c-myc 蛋白表达的影响

目的：通过观察不同浓度IL-1β对软骨细胞c-myc蛋白表达的影响,探讨IL-1β在骨关节炎软骨损伤中的作用及机制并寻找有效治疗骨关节炎的方法。方法选用20只C57BL/6小鼠,体外进行关节软骨细胞的分离及原代培养;将原代培养的软骨细胞分为4组：A 组为空白对照组,采用含10% FBS 的RPMI-1640常规培养基培养;B、C、D组为IL-1β处理组,分别用含有1、10和100 ng/ml IL-1β的常规培养基培养,12 h后进行实验分析。采用Western blot和流式细胞仪检测法,观察各组c-myc蛋白表达情况及细胞凋亡情况。结果原代培养细胞24 h后开始贴壁,呈圆形或多角形,传至第4代、第5代细胞体积变大,逐渐成为梭形,甲苯胺蓝染色为软骨细胞内见蓝紫色异染颗粒。与对照组相比较,不同浓度IL-1β处理组软骨细胞 c-myc 蛋白表达水平逐渐增高,呈剂量依赖性（P＜0.05）;与对照组相比较,不同浓度 IL-1β处理组软骨细胞凋亡率逐渐增高,呈剂量依赖性（P＜0.05）。结论实验体外分离小鼠关节软骨,可成功获得高纯度,且传至3代以内活性率超过90%的软骨细胞;IL-1β可以按照剂量依赖方式上调软骨细胞c-myc蛋白的表达,同时增加软骨细胞凋亡率,说明IL-1β可能通过c-myc蛋白诱导软骨细胞凋亡。     

Advanced glycation end products‐induced chondrocyte apoptosis through mitochondrial dysfunction in cultured rabbit chondrocyte

Advanced glycation end products (AGEs) are an important mediator in osteoarthritis (OA) and cause apoptosis in articular chondrocytes. Mitochondrial function is involved in modulating apoptosis of articular chondrocytes. This study was performed to investigate the mechanism of AGEs‐induced chondrocyte apoptosis. The ratio of apoptotic cell and cell viability was surveyed by TUNEL, MTT,LDH release assay. The reactive oxygen species was determined by the fluorescent probe 2’, 7’‐dichlorofluorescein diacetate. The expression of caspase‐3 and cytochrome c was detected by Western blot. The mitochondrial membrane potential (?Ψm) was evaluated by rhodamine‐123 fluorescence. We found that AGEs induced apoptosis in primary rabbit chondrocytes, upregulation of ROS production, cytochrome c, and caspase‐3 levels. Simultaneously, AGEs decreases the levels of ?Ψm and ATP production; however, the antibody of AGEs (sRAGE) and antioxidant‐N‐acetylcys‐teine (NAC) significantly reversed AGEs‐induced the above damage thus to protect the cells from apoptosis. These observations suggested that the mechanism of AGEs‐induced chondrocyte apoptosis was primarily via ROS production and mitochondria‐mediated caspase‐3 activation.     

电针后血清对肿瘤坏死因子α诱导软骨细胞凋亡的影响

背景：电针具有活血化瘀、行气止痛、舒筋通络的作用,能有效缓解骨性关节炎的临床症状。目的：观察电针后血清对肿瘤坏死因子α诱导软骨细胞凋亡的影响。方法：采用机械-酶消化法分离3周龄SD大鼠膝关节软骨细胞,用10μg/L的肿瘤坏死因子α诱导体外培养软骨细胞的凋亡,同时给予正常大鼠血清、骨性关节炎大鼠血清、透明质酸钠治疗的骨性关节炎大鼠血清、及电针内、外膝眼5,15,30min治疗的骨性关节炎大鼠血清进行干预。结果与结论：电针内、外膝眼15,30min治疗的骨性关节炎大鼠血清干预24h,软骨细胞活力显著增高,凋亡显著减少。说明电针后血清能有效抑制肿瘤坏死因子α诱导的软骨细胞凋亡。     

酸性肽对神经元凋亡的抑制

背景:高浓度的一氧化氮能引起神经细胞的凋亡。因此抑制一氧化氮引起的细胞凋亡就能达到预防和治疗老年痴呆病的目的。目的:观察酸性肽能否抑制一氧化氮引起的神经元凋亡。设计:对照观察细胞和分子实验。材料:实验于2003-05/2005-05在郑州大学生物活性肽研究所第二实验室和郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室细胞培养室完成。新生的24h内SD雄性大鼠,由河南省动物中心提供(410117)。方法:对新生的SD大鼠海马神经元进行原代培养。取培养至第11天的神经细胞,用不同剂量的酸性肽预处理6h,再加入终浓度为50μmmol/L的亚硝基铁氰化钠,继续培养24h,收集细胞进行实验。每次实验均分为以下5组:正常对照组、亚硝基铁氰化钠处理组、亚硝基铁氰化钠 0.0375mg/mL酸性肽组、亚硝基铁氰化钠 0.075mg/mL酸性肽组,亚硝基铁氰化钠 0.15mg/mL酸性肽组。用噻唑蓝法测定细胞的存活率,用免疫组织化学法对神经丝蛋白进行染色,再用吖啶橙荧光染色法显示细胞凋亡的形态。用琼脂糖凝胶电泳法分析凋亡细胞的DNA梯带。用WesternBlot和吸光度扫描分析Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表达水平。主要观察指标:①噻唑蓝法比色法检测细胞存活率的实验结果。②细胞凋亡的核型观察结果。③细胞凋亡的DNA电泳分析。④Bcl-2和Bax蛋白的WesternBlot分析结果。结果:①亚硝基铁氰化钠处理组的神经元存活率为58.9%,亚硝基铁氰化钠 0.037mg/mL酸性肽处理组为70.0%,亚硝基铁氰化钠 0.075mg/mL酸性肽处理组为72.8%,亚硝基铁氰化钠 0.15mg/mL酸性肽处理组为75.3%。②细胞凋亡的核型观察结果:亚硝基铁氰化钠处理组呈现细胞凋亡的明显特征。不同浓度的酸性肽 亚硝基铁氰化钠共同处理组海马神经元的细胞核接近正常对照组的细胞核形态。③细胞凋亡的DNA电泳分析结果表明,仅亚硝基铁氰化钠处理组的神经元DNA在琼脂糖凝胶电泳上显示出清晰的细胞凋亡的特征性DNA梯带。④Bcl-2和Bax蛋白的Western Blot和吸光度扫描分析结果显示,亚硝基铁氰化钠处理组Bcl-2蛋白表达水平下降,Bax蛋白表达水平升高。而不同浓度的酸性肽 亚硝基铁氰化钠共同处理组的Bcl-2蛋白水平随酸性肽浓度逐渐增加,Bax蛋白的表达水平逐渐下降。结论:酸性肽能够抑制神经元的凋亡,增加神经元Bcl-2蛋白的表达水平,抑制神经元Bax蛋白的表达水平。     

Caspase 3 siRNA抑制关节软骨细胞的凋亡

背景:到目前为止,国内外对caspase 3抑制剂的研发大都集中在肽类或非肽类化合物的合成和发现上,而利用RNAi干扰技术直接沉默caspase 3基因,在基因水平抑制软骨细胞凋亡还未见报道.目的:利用慢病毒载体,把Caspase 3 siRNA转入软骨细胞,使其caspase 3基因沉默,相对阻断凋亡效应的联级反应,期望达到抵抗软骨细胞凋亡的目的.设计、时间及地点:单一样本观察,于2008-06/2009-06在暨南大学医学院附属广州市红十字会医院,广州市创伤外科研究所完成.材料:软骨细胞从SPF级SD大鼠关节中提取,caspase 3 siRNA慢病毒载体为实验构建.方法:构建大鼠pSIH1-H1-copGFP-Caspase 3 siRNA表达质粒,使用慢病毒包装系统,在293TN细胞中进行包装生产含caspase 3 siRNA的慢病毒颗粒,然后转导(transduce)入大鼠软骨细胞.主要观察指标:实时荧光定量-聚合酶链反应和Western blot检测转导后软骨细胞caspase 3 基因沉默情况,再用肿瘤坏死因子α诱导软骨细胞凋亡,流式细胞技术Annexin V/ PI检测软骨细胞凋亡情况.结果:Caspase 3 siRNA能顺利转入软骨细胞,转导率达90%;实时荧光定量-聚合酶链反应检测软骨细胞中Caspase 3 mRNA的表达量,实验组低于与对照组差异有显著性(P < 0.01);Western blot检测软骨细胞的Caspase 3蛋白表达量,实验组低于与对照组差异有显著性意义(P < 0.01);在使用肿瘤坏死因子α诱导软骨细胞凋亡时,caspase 3 siRNA转导组抑制细胞凋亡的能力是对照组的7倍.结论:利用慢病毒载体把caspase 3 siRNA转入软骨细胞,使软骨细胞的caspase 3 基因沉默,可以达到相对拮抗软骨细胞凋亡的目的.     

碘乙酸钠诱导原代大鼠软骨细胞凋亡

背景：近年碘乙酸钠多用于诱导骨关节炎的发生,病理结果观察到软骨区域凋亡的发生,但有关碘乙酸钠诱导软骨细胞凋亡机制的研究较少。目的：探讨不同剂量碘乙酸钠诱导原代大鼠软骨细胞凋亡的发生机制。方法：使用酶消化法建立大鼠关节软骨细胞培养体系;荧光显微镜和流式细胞仪检测软骨细胞凋亡;激光共聚焦显微镜和荧光分光光度计评估线粒体膜电位的改变;荧光分光光度法测定活性氧水平改变;免疫印迹法检测凋亡调控蛋白细胞色素C和caspase-3的表达。结果与结论：碘乙酸钠剂量依赖性地诱导软骨细胞凋亡,使活性氧水平显著升高（P〈0.05）,线粒体膜电位水平明显降低（P〈0.05）,凋亡调控蛋白的表达明显增加。提示碘乙酸钠诱导的原代大鼠软骨细胞凋亡主要与活性氧的产生及线粒体介导的caspase-3活化有关。