2-脱氧-D-葡萄糖对非霍奇金淋巴瘤细胞株Namalwa和SU-DHL-4糖酵解通路的干预研究

目的:研究糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2-DG)对人类非霍奇金淋巴瘤细胞株Namalwa、SU-DHL-4的作用效应及机制。方法:采用锥虫蓝拒染法检测细胞增殖,D-葡萄糖[HK法]检测试剂盒检测葡萄糖浓度,乳酸测试盒检测糖酵解途径终产物乳酸含量,反转录实时定量PCR(RTQ-PCR)检测糖酵解途径关键酶基因的转录水平,流式细胞术检测细胞周期。以健康人外周血梯度离心法分离所得的淋巴细胞为正常对照组。结果:淋巴瘤细胞株Namalwa和SU-DHL-4中糖酵解相关基因HK1、LDHA、GLUT1、HIF-1α在转录水平明显高于正常对照。2-DG能抑制淋巴瘤细胞株葡萄糖消耗,减少乳酸生成,将细胞周期阻滞于G0/G1期,致使细胞增殖受抑。结论:淋巴瘤细胞株Namalwa、SU-DHL-4存在糖酵解异常,2-DG通过抑制淋巴瘤细胞株糖酵解通路,可干扰细胞能量代谢,阻断细胞周期,使细胞增殖受抑,从而发挥抗肿瘤作用。     

胰腺癌组织己糖激酶与丙酮酸激酶活性及乳酸含量检测

目的检测胰腺癌组织中糖酵解关键酶活性及糖酵解产物含量,分析糖酵解与胰腺癌组织生物学行为的关系。方法收集21例胰腺癌组织标本和12例胰岛素瘤等良性病变胰腺组织,制备组织匀浆,用化学比色法检测糖酵解关键酶己糖激酶(hexokinase,HK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)活性及糖酵解产物乳酸含量。结果与正常胰腺组织相比,癌组织中HK、PK活性和乳酸含量明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论胰腺癌有氧氧化功能降低,糖酵解水平增强,特异性抑制糖酵解可能成为胰腺癌新的治疗策略。     

香叶木素对人肺腺癌细胞系H1299和A549增殖能力影响的研究

目的:探究香叶木素(Dios)作用前后人肺腺癌细胞系H1299和A549细胞增殖活性的改变。方法:取RPMI-1640培养基培养的人肺腺癌细系H1299及A549用于实验。采用CCK8法检测Dios作用前后人肺腺癌细胞系H1299和A549细胞增殖活性的改变。结果:不同浓度(0、5、10、20μmol/L)Dios作用H1299细胞24h后,细胞的增殖抑制率分别为(10.9±2.5)%、(32.7±1.8)%、(41.2±2.1)%、(51.7±2.8)%,而A549细胞增殖抑制率为(18.9±2.3)%、(30.8±2.6)%、(42.2±1.2)%、(50.7±2.1)%。结论:Dios对人肺腺癌细胞系H1299和A549的增殖有明显的抑制作用,提示Dios通过抑制肺腺癌细胞的增殖,进而起到良好的抗肿瘤作用。     

土贝母含药血清对人肺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的观察土贝母含药血清对人肺癌细胞增殖、凋亡的影响,初步探讨其作用机制。方法采用灌胃SD大鼠土贝母水提物的方法制备其含药血清。应用不同浓度(0.0%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%、40.0%)含药血清处理人肺癌A549和H1299细胞。采用MTT、免疫荧光法观察含药血清对人肺癌细胞增殖的影响,采用流式细胞术检测含药血清对人肺癌细胞凋亡的影响,采用Western blot方法检测含药血清对肺癌细胞中凋亡相关的裂解型胱天蛋白酶(Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-8、Cleaved-Caspase-9、Bax和Bcl-2)蛋白表达水平的影响。结果土贝母含药血清可明显抑制人肺癌A549和H1299细胞的增殖,诱导其凋亡;土贝母含药血清处理人肺癌细胞的Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9和Bax蛋白水平增加,Bcl-2蛋白水平降低。结论土贝母含药血清可明显抑制人肺癌A549和H1299细胞的增殖,诱导其凋亡,其机制可能与细胞线粒体途径诱导细胞凋亡有关。     

肿瘤患者预后的判断:AG825对3种非小细胞肺癌细胞系的生长抑制作用

目的观察HER2受体酪氨酸激酶抑制剂AG825对非小细胞肺癌(nonsmallcelllungcancer,NSCLC)细胞系的生长抑制作用。方法采用体外药物敏感性实验(MTT比色法),观察不同浓度的AG825分别作用24,96h对3种人类NSCLC细胞系A549,H322,H1299的生长抑制作用。结果AG825用药24h对A549,H322,H1299的抑制率分别为24.03%,25.87%,17.35%,用药(100μm)96h分别为78.31%,65.28%,63.98%。AG825对A549,H322,H1299的半数抑制浓度分别为7.31,16.29,1.769μm。结论AG825对3种NSCLC细胞系具有生长抑制作用,这种作用呈时间依赖性和浓度依赖性。     

肿瘤患者预后判断:AG1478对3种非小细胞肺癌细胞系的生长抑制作用

目的:观察EGFR酪氨酸激酶抑制剂AG1478对非小细胞肺癌(nonsmallcelllungcancer,NSCLC)细胞系的生长抑制作用。方法:用体外药物敏感性实验(MTT比色法),观察不同浓度的AG1478分别作用24和96h,对3种人类NSCLC细胞系A549,H358,H1299的生长抑制作用。结果:AG1478用药24h对A549,H358,H1299的抑制率分别为26.61%,21.83%,18.46%,用药(100μm)96h分别为78.67%,65.97%,63.09%。AG1478对A549,H358,H1299的半数抑制浓度分别为26.35,21.11,19.54μm。结论:AG1478对3种NSCLC细胞系具有生长抑制作用,这种作用呈时间依赖性和浓度依赖性。     

人HMGN5基因shRNA慢病毒载体构建与RNAi效率的鉴定

目的构建人HMGN5基因的shRNA慢病毒载体并鉴定在肺癌A549和H1299细胞上的沉默效率。方法设计HMGN5基因特异性siRNA靶点,构建于慢病毒pLL-3.7载体,并筛选获得有效的shRNA慢病毒载体,在293T细胞包装成病毒颗粒,将其感染肺癌A549和H1299细胞,应用Real-time PCR方法从mRNA水平上检测HMGN5的沉默效率。结果构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度达到5×108TU/ml。shRNA慢病毒颗粒感染A549和H1299细胞后HMGN5基因的mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组分别下降了71.7%和50.7%。结论成功构建了HMGN5基因的shRNA慢病毒表达载体,在分子水平能够有效沉默靶基因,为探讨HMGN5在肿瘤基因治疗中的作用奠定了基础。     

FOXC2通过上调MMP9促进非小细胞肺癌细胞的侵袭迁移

目的:探讨FOXC2对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞侵袭迁移的影响。方法:采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法检测人支气管上皮样细胞HBE和人NSCLC细胞A549、H1299中FOXC2的m RNA表达水平。利用pcDNA3.1-FOXC2建立FOXC2过表达的细胞模型,q RT-PCR和蛋白质印迹法(Western blot)验证转染效率。采用Transwell实验检测NSCLC细胞的侵袭迁移能力,qRT-PCR法检测基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达水平。结果:人NSCLC细胞H1299、A549中FOXC2的表达水平显著高于人支气管上皮样细胞HBE(P0.05)。过表达FOXC2促进了A549细胞的侵袭迁移,上调了MMP9的表达(P0.05)。结论:NSCLC细胞中FOXC2表达水平明显高于正常支气管上皮样细胞,过表达FOXC2可能通过上调MMP9促进NSCLC细胞的侵袭迁移。     

miR-1299通过靶向调控CCND1对非小细胞肺癌细胞增殖、转移和凋亡的影响

目的 探讨miR-1299通过靶向调控细胞周期蛋白D1(CCND1)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、转移和凋亡的影响。方法 回顾性收集2021年1月至2022年1月入青岛大学附属青岛市中心医院胸外科行原发性NSCLC手术的患者29例,取癌组织和癌旁正常肺组织,培养人正常肺上皮细胞16HBE和NSCLC细胞系H1299、A549、PC-9、H1975、SPC-A1,RT-qPCR法检测组织和细胞中miR-1299和CCND1的表达,取生长良好的H1299细胞,将其分为对照组(转染miR-control)、miR-1299 NC组(转染miR-1299 NC)、miR-1299 mimic组(转染miR-1299 mimic)、miR-1299 inhibitor组(转染miR-1299 inhibitor)、PCDNA组(转染pcDNA3.1-NC)、PCDNA-CCND1组(转染pcDNA3.1-CCND1真核表达载体)、miR-1299 mimic+PCDNA组(共同转染miR-1299 mimic和pcDNA3.1-NC)和miR-1299 mimic+PCDNA-CCND1...     

P53基因在电离辐射诱导的非小细胞肺癌细胞死亡中的作用

目的研究p53基因在电离辐射诱导的非小细胞肺癌细胞死亡中的作用。方法选取H1299（p53-/-）,H1299-P53,H1299-175H细胞为研究对象。采用流式细胞术检测细胞凋亡率,WESTERN BOLT方法检测相关蛋白表达情况。结果在H1299（P53-/-）细胞中,4GY、8GY照射后细胞凋亡率分别是假照组的68.4%、50%。在H1299-P53细胞中,4GY、8GY照射后细胞凋亡率分别是假照组的1.7倍、8.1倍。在H1299-175H细胞中,4GY8、GY照射后细胞凋亡率分别是假照组的1.5倍、2倍。LC3蛋白表达在H1299呈现剂量依赖性升高,在H1299-175H呈现剂量依赖性降低,在H1299-P53中,OGY表达最高,4 GY表达最低,8 GY表达低于假照组但比4 GY高。AKT表达在H1299细胞呈剂量依赖性降低,H1299-P53在4GY表达量升高而在8GY又降低但仍高于假照组,在H1299-175H细胞中AKT表达呈剂量依赖性降低。MDM2在H1299的表达呈剂量依赖性升高,在H1299-P53细胞中呈现与AKT相同的变化趋势,在H1299-175H细胞中4GY时表达量最高8GY最低。Caspase-3在H1299细胞中随着照射剂量的增加变化不明显,在H1299-P53细胞中呈现剂量依赖性升高,在H1299-175H细胞中,0 GY表达最高,4 GY表达最低,8 GY低于假照组但高于4 GY组。结论 X射线促进P53（-/-）的H1299细胞时发生自噬,而促进H1299-P53及H1299-175H中发生凋亡。     

人肺腺癌细胞系中SIRT1表达与奈达铂敏感性的关系

目的探讨5株人肺腺癌细胞系HCC827、H1650、H1975、A549和H1299中沉默信息调节因子1(Sirtuin 1,SIRT1)与奈达铂(Nedaplatin,NDP)药物敏感性的关系。方法采用实时定量PCR及western blot检测5株人肺腺癌细胞系SIRT1 m RNA及蛋白质表达水平;NDP作用于细胞后,用CCK-8法检测细胞活力并计算半数生长抑制浓度值(the half growth inhibition concentration,IC50);通过si RNA干扰技术下调A549、H1299、H1650和H1975细胞系中SIRT1的表达,采用CCK-8法和流式细胞术分别检测NDP对细胞存活率和细胞凋亡的影响。结果与HCC827细胞(m RNA和蛋白质相对表达量分别为1.00和0.11±0.02)相比,H1650、H1975、A549和H1299细胞中SIRT1 m RNA(分别为4.53±0.74、3.11±0.64、15.76±2.28和18.09±1.17)和蛋白质表达水平(分别为0.23±0.03、0.21±0.02、0.52±0.11和0.56±0.08)均明显上调,差异有统计学意义(F分别为122.10和26.50,P0.01);A549和H1299细胞对NDP的敏感性[IC50值分别为(7.38±1.59)μmol/L和(8.14±1.43)μmol/L]明显高于HCC827、H1650和H1975细胞[IC50值分别为(26.16±4.35)μmol/L、(22.29±3.26)μmol/L和(24.41±2.58)μmol/L],差异有统计学意义(F=30.86,P0.01)。A549和H1299细胞转染并经NDP处理后,si SIRT1组细胞存活率明显高于NC组(F分别为235.10和39.20,P0.01),细胞凋亡率明显低于NC组(t分别为7.29和6.68,P0.05);而在H1650和H1975细胞中,si SIRT1组细胞存活率明显低于NC组(F分别为185.40和60.09,P0.01),细胞凋亡率明显高于NC组(t分别为6.15和31.36,P0.01)。结论在SIRT1高表达的A549和H1299细胞中SIRT1表达增加了细胞对NDP敏感性,而SIRT1中表达的H1650和H1975细胞中SIRT1表达降低了细胞对NDP的敏感性,提示在人肺腺癌细胞中SIRT1可能在铂类耐药发挥双重作用。     

乳酸脱氢酶对己糖激酶法测定血糖结果的影响

目的探讨乳酸脱氢酶对己糖激酶法(hexokinase,HK)检测血糖的影响。方法采用HK法和葡萄糖氨化酶法(GOD)法分别检测110例血清乳酸脱氢酶(LDH)及不同浓度梯度LDH含量的PBS溶液和血清溶液中血清葡萄糖(GLU)含量。结果 (1)HK法检测110例患者血清GLU的结果随LDH含量升高,GLU测定值逐渐下降的趋势,LDH含量与GLU结果呈明显负相关关系(t=5.34,P<0.01);(2)当LDH>500μmol/L时,HK法检测GLU-PBS溶液中的GLU结果均显著低于实际浓度。HK法检测溶液中GLU结果均呈现随LDH浓度升高,所检测GLU结果与实际GLU含量相比呈现逐渐下降的趋势。结论乳酸脱氢酶(LDH)可能对HK法检测GLU结果产生显著的负干扰影响。     

BH3诱导肺癌H1299细胞凋亡的试验研究

目的研究肽BH3抗人非小细胞肺癌细胞株H1299的作用,并探讨其作用机制。方法体外培养H1299细胞,取10μM、100μM和1000μM浓度的BH3作用于H1299细胞,72h后,用RT-PCR检测Bcl-2、Capase3和Bcl-xL的表达变化、测定Capase3和Capase9的活性并观察体内外细胞生长的抑制情况。结果 RT-PCR结果显示,不同浓度的BH3作用后,Bcl-2、Capase3和Bcl-xL的表达表现出相应变化,Capase3和9的活性也有增高的趋势。BH3对细胞有明显的抑制作用,24h后,抑制率分别为2.34%、17.5%、24.46%;48h后,抑制率分别为8.72%、20.33%、45.17%;72h后,抑制率分别为13.11%、38.90%、50.24%。BH3(10μM、100μM和1000μM)对裸鼠移植性非小细胞肺癌细胞株H1299也有抑制作用,3个剂量组的抑瘤率分别为43.85%,54.92%和59.02%。结论肽BH3有促进H1299细胞凋亡的作用。降低高表达的Bcl-2和Bcl-xL基因,升高Ca-pase3基因,可能是BH3抗人非小细胞肺癌的机制之一。     

奥沙利铂诱导的细胞外基质重构介导的非小细胞肺癌H1299细胞系凋亡机制研究

目的探讨奥沙利铂诱导的细胞外基质重构介导的非小细胞肺癌H1299细胞系凋亡的机制。方法非小细胞肺癌H1299细胞系随机分为4组:对照组、奥沙利铂低剂量、中剂量和高剂量组。DAPI染色法和检测各组细胞的凋亡情况,PCR或免疫印迹法检测各组细胞的细胞凋亡蛋白Bax/Bcl2及Caspase9的表达,明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶MMP2/9蛋白的活性。结果奥沙利铂引起细胞凋亡蛋白Bax和Caspase9蛋白表达增加和Bcl2表达的下调,细胞内凋亡小体的出现以及MMP2和MMP9活性增加,且奥沙利铂的作用效果具有剂量依从性。结论奥沙利铂诱导的MMP2和MMP9蛋白表达上调介导的细胞外基质重构参与了非小细胞肺癌H1299细胞系凋亡过程。     

A549/DDP耐药肺癌细胞系的建立及其与SP细胞的关系

目的:建立耐顺铂(DDP)人肺癌耐药细胞系A549/DDP,初步探讨耐药细胞与肿瘤SP(side population cell)细胞的关系.方法:以DDP为诱导剂,采用高浓度反复间歇诱导法诱导建立人肺癌耐药细胞系A549/DDP,用MTT法测定药物敏感性,最后将耐药细胞和亲本细胞分别行Hoechst33342染色,用流式细胞仪检测SP细胞含量.结果:成功建立DDP耐药细胞系A549/DDP,对DDP的耐药指数为5.957;耐药谱分析表明其是一个多药耐药细胞系;Hoechst33342染色分析显示:A549和A549/DDP中SP细胞含量分别为1.09%和0.31%.结论:建立了稳定的人肺癌多药耐药耐药细胞系A549/DDP,耐药细胞中SP细胞含量无明显变化.     

TCRP1基因启动子区CpG岛测序体系的建立

目的建立可用于舌癌耐药蛋白1(TCRP1)基因启动子区CpG岛测序检测的反应体系。方法采用人肺癌A549细胞作为待测样品,以TCRP1启动子区CpG岛为靶片段设计特异扩增、测序引物,建立TCRP1启动子区CpG岛测序检测反应体系,并检测H1299、H460、Huh-7细胞株和2例患者肿瘤组织标本。结果建立了以P2-1[二甲基亚砜(DMSO)终浓度0%,降落聚合酶链反应(PCR)条件]联合P1-2(DMSO终浓度1%,常规PCR反应条件)为优选方案的TCRP1启动子区CpG岛测序检测体系,并成功检测了A549、H1299、H460、Huh-7细胞株和2例患者肿瘤组织标本。结论成功建立可用于TCRP1启动子区CpG岛测序的反应体系。     

阿伐他汀通过PTEN/mTOR信号调节糖酵解代谢逆转白血病耐药的作用及机制

目的：探讨阿伐他汀对耐阿霉素人急性早幼粒白血病细胞系HL-60/ADM糖酵解代谢的影响及作用机制。方法：取对数生长期耐阿霉素白血病细胞HL-60/ADM，给予不同浓度阿伐他汀处理后，采用CCK-8法测定细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞凋亡，葡萄糖消耗实验检测白血病细胞糖酵解活性，Western blot方法检测PTEN、p-m TOR、PKM2、HK2、P-gp、MRP1蛋白的表达；将PTEN-si RNA转染至HL-60/ADM细胞后，进一步采用上述方法检测PTEN低表达对阿伐他汀调节HL-60/ADM细胞凋亡及糖酵解代谢的影响。结果：CCK-8结果显示，阿伐他汀呈浓度依赖性和时间依赖性抑制HL-60/ADM细胞增殖（r=0.872,r=0.936）,10μmol/L阿伐他汀干预24 h后HL-60/ADM细胞增殖活性下降最明显，增殖活性降至（32.3±2.18）%。流式细胞术结果显示，阿伐他汀诱导HL-60/ADM细胞凋亡，该作用呈浓度依赖性（r=0.796）,10μmol/L阿伐他汀对HL-60/ADM细胞的诱导凋亡作用最强，细胞凋亡率达到（48.78±2.95）%。葡萄糖消耗实...     

miRNA-155表达对人肺癌细胞A549增殖的影响

【目的】探讨miRNA-155在正常肺组织和非小细胞肺癌组织中的表达及miRNA-155对人肺癌细胞A549增殖的影响。【方法】采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术检测15例非小细胞肺癌组织及其癌旁组织中miRNA-155的表达;A549细胞分别转染miR-NC和miRNA-155 mimic ,采用Real-time PCR技术检测转染后A549细胞中的miRNA-155表达水平,同时采用MTT 技术和流式细胞技术检测转染后A549细胞增殖情况,Western印迹法检测转染后A549细胞中Akt、p-Akt（Ser473）、p27、bcl-2、bax的表达。【结果】miRNA-155在非小细胞肺癌组织中的表达情况明显高于癌旁组织（ P ＜0．05）;与转染 miR-NC 组相比, A549细胞转染miRNA-155 mimic后miRNA-155表达水平明显增高（ P ＜0．001）,MTT实验和流式细胞技术显示miRNA-155促进A549细胞的增殖;Western印迹法结果显示：转染miRNA-155的A549细胞p-Akt （Ser473）,bcl-2的表达水平增高,p27、bax的表达水平降低。【结论】miRNA-155可能通过促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,上调p-Akt（Ser473）、bcl-2表达,同时抑制p27、bax的表达来促进非小细胞肺癌的发生发展。     

干扰PKM2对急性白血病细胞增殖和凋亡的影响及分子机制

目的:探讨糖酵解酶丙酮酸激酶M2型(PKM2)对人白血病细胞HL-60增殖和凋亡的影响及其分子机制。方法:以干扰PKM2的质粒转染HL-60细胞株(si-PKM2组),同时将转染空载体的HL-60细胞设为对照组(si-Ctl组)。采用RT-q PCR和Western blot技术分别检测si-Ctl组和si-PKM2组PKM2 m RNA和蛋白水平的变化;CCK-8检测两组细胞的增殖能力;采用流式细胞术检测两组细胞周期和凋亡的变化;Western blot和RT-q PCR技术检测两组细胞中PI3K/Akt/m TOR信号通路的变化及糖酵解相关基因的表达变化,并检测两组细胞中葡萄糖消耗和乳酸生成的变化情况。过表达PKM2的细胞给予PI3K抑制剂LY294002或给予半乳糖培养后检测细胞的增殖能力、周期和凋亡的变化以及葡萄糖消耗和乳酸生成的变化。结果:干扰PKM2表达后,si-PKM2组中PKM2的m RNA (t=45.21,P0.001)和蛋白水平(t=13.56,P0.01)显著降低,si-PKM2组的细胞增殖能力较对照组明显下降(F=253.59,P0.05),敲低PKM2后细胞被显著阻滞于G_1期,且明显诱导了细胞的凋亡(t=56.38,P0.05)。与对照组相比,si-PKM2组p-Akt和p-m TOR水平显著降低(t=50.23、13.51,P0.01),葡萄糖消耗和乳酸生成显著下降(t=23.16、15.20,P0.05)。补救实验结果显示,过表达PKM2给予PI3K抑制剂LY294002后减弱了其诱导的葡萄糖消耗和乳酸的产生(t=45.13、26.35,P0.05),半乳糖培养过表达PKM2的HL-60细胞对细胞增殖能力(t=16.52,P0.05)、周期及凋亡无显著影响(t=48.63,P0.05)。结论:敲低PKM2可以抑制白血病HL-60细胞的增殖并诱导其凋亡,其分子机制可能与PKM2介导的PI3K/Akt/mTOR糖酵解轴抑制有关,提示PKM2可能作为白血病防治的一个分子靶点。     

肿瘤糖代谢机制的研究进展

代谢重编程是肿瘤的主要特征,其中葡萄糖代谢异常是最突出的特征。癌细胞和正常细胞中葡萄糖代谢的主要区别在于癌细胞中的葡萄糖在有氧条件下仍优先转化为乳酸,而不是在线粒体中被氧化,这一过程称为有氧糖酵解,即“瓦博格效应”。肿瘤细胞通过改变葡萄糖转运体及相关关键酶来提高代谢能力以支持肿瘤组织大量消耗葡萄糖的需要。本文就肿瘤细胞有氧糖酵解的特征做一综述,为靶向肿瘤代谢的个体化治疗寻找有效靶点。