小鼠骨髓及脾脏来源的树突状细胞培养及鉴定

目的建立体外培养和扩增树突状细胞(dendritic cell-DC)的方法,为免疫耐受研究提供实验材料和奠定基础。方法在无菌条件下提取ICR小鼠脾脏淋巴细胞和骨髓细胞,以小鼠重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL-4)协同诱导下培养,光镜下观察DC的形态,流式细胞仪检测CD80、CD86表达水平。结果骨髓细胞体外诱导培养3天后,光镜下显示细胞表面不规则,呈树突状突起,可见典型的树突状细胞形态,低表达共刺激分子(CD80,CD86)。结论与脾脏细胞相比,骨髓细胞中不仅富含大量的DC的前体细胞而且诱导成DC时间短。     

基于手法筛选的小鼠骨髓树突状细胞的体外培养方法

目的：通过建立简单经济的小鼠骨髓树突状细胞的体外培养方法,比较不同成熟状态下树突状细胞生物免疫学特性的变化.方法：实验于2004-07/2005-06在南方医院检验医学中心完成.①取C57B/L小鼠骨髓细胞作为树突状细胞的前体细胞.将培养的树突状细胞分成两组,未成熟树突状细胞组（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子＋白细胞介素4诱导）;成熟树突状细胞组（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子＋白细胞介素4＋脂多糖）,每天光镜观察各组细胞生长情况.第6天收集细胞,其形态采用电镜观察.②两组树突状细胞表型分析采用流式细胞仪分析.③取BALB/c小鼠脾脏细胞,分离T细胞作为反应细胞.用两组树突状细胞作为刺激细胞.按刺激细胞与反应细胞1：5,1：10,1：20,1：40的比例混合培养,并用T细胞悬液作阴性对照,观察混合淋巴细胞反应情况.结果：①树突状细胞培养的光镜观察：未成熟树突状细胞多为圆形,少量菌幕样突起;脂多糖刺激后,树突状细胞呈悬浮状态,表面较多细长突起.②树突状细胞电镜观察结果：扫描电镜示未成熟树突状细胞表面皱褶和较少的毛刺;成熟树突状细胞表面大量树枝状细长突起.透射电镜示未成熟树突状细胞形态较规则,突起较少,胞浆内有许多吞饮泡及多泡体;成熟树突状细胞形态不规则,胞内囊泡结构减少,细胞器较丰富,细胞核偏向一侧,表面有细长树枝状突起.③各组树突状细胞表型分析：未成熟树突状细胞表面中度表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子,低水平表达CD40,CD86和CD25;成熟树突状细胞表面高度表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子,高水平表达共刺激分子.④混合淋巴细胞反应：未成熟树突状细胞只能轻度刺激同种T细胞增殖;成熟树突状细胞能够刺激T细胞大量增殖.结论：采用重组小鼠粒-巨集落刺激因子和白细胞介素4联合诱导骨髓前体细胞可在体外培养出大量未成熟树突状细胞,低表达共刺激分子,体外诱导同种T细胞增殖能力较弱,呈现耐受性树突状细胞特性,有望应用于移植排斥反应及或自身免疫疾病的生物治疗.     

基于手法筛选的小鼠骨髓树突状细胞的体外培养方法

目的：通过建立简单经济的小鼠骨髓树突状细胞的体外培养方法，比较不同成熟状态下树突状细胞生物免疫学特性的变化。 方法：实验于2004-07／2005-06在南方医院检验医学中心完成。①取C57B／L小鼠骨髓细胞作为树突状细胞的前体细胞。将培养的树突状细胞分成两组，未成熟树突状细胞组(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子+白细胞介素4诱导)；成熟树突状细胞组(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子+白细胞介素4+脂多糖)，每天光镜观察各组细胞生长情况。第6天收集细胞，其形态采用电镜观察。②两组树突状细胞表型分析采用流式细胞仪分析。③取BALB／c小鼠脾脏细胞，分离T细胞作为反应细胞。用两组树突状细胞作为刺激细胞。按刺激细胞与反应细胞1∶5，1∶10，1∶20，1∶40的比例混合培养，并用T细胞悬液作阴性对照，观察混合淋巴细胞反应情况。 结果：①树突状细胞培养的光镜观察：未成熟树突状细胞多为圆形，少量菌幕样突起；脂多糖刺激后，树突状细胞呈悬浮状态，表面较多细长突起。②树突状细胞电镜观察结果：扫描电镜示未成熟树突状细胞表面皱褶和较少的毛刺；成熟树突状细胞表面大量树枝状细长突起。透射电镜示未成熟树突状细胞形态较规则，突起较少，胞浆内有许多吞饮泡及多泡体；成熟树突状细胞形态不规则，胞内囊泡结构减少，细胞器较丰富，细胞核偏向一侧，表面有细长树枝状突起。③各组树突状细胞表型分析：未成熟树突状细胞表面中度表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子，低水平表达CD40，CD86和CD25；成熟树突状细胞表面高度表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子，高水平表达共刺激分子。④混合淋巴细胞反应：未成熟树突状细胞只能轻度刺激同种T细胞增殖；成熟树突状细胞能够刺激T细胞大量增殖。 结论：采用重组小鼠粒-巨集落刺激因子和白细胞介素4联合诱导骨髓前体细胞可在体外培养出大量未成熟树突状细胞，低表达共刺激分子，体外诱导同种T细胞增殖能力较弱，呈现耐受性树突状细胞特性，有望应用于移植排斥反应及或自身免疫疾病的生物治疗。     

当归多糖对乙肝病毒转基因小鼠树突状细胞功能状态的影响

目的:探讨当归多糖对乙肝病毒转基因小鼠树突状细胞功能状态的影响。方法:取当归多糖处理和未处理的转基因小鼠脾脏来源的单个核细胞,以重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和重组小鼠白细胞介素-4培养诱导树突状细胞,显微镜下观察其形态,流式细胞仪检测其表面共刺激分子(CD80,CD86),MTT法检测其刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,ELISA法测定培养上清液中IL-12、r-IFN水平等方法进行研究。结果:当归多糖处理组小鼠树突状细胞的表面协同刺激分子(CD86)表达水平、刺激同种异体淋巴细胞增殖能力和细胞因子产生水平均高于对照组(P<0.05)。结论:当归多糖可以促进乙肝病毒转基因小鼠树突状细胞的成熟,上调其表面协同刺激分子CD86的表达,增强了其促淋巴细胞细胞增殖和分泌IL-12、r-IFN的能力,加强其抗原递呈能力,诱导细胞免疫反应,在乙肝病毒转基因小鼠抗病毒免疫中可能发挥一定的作用。     

小鼠脾脏树突状细胞的体外扩增与培养

背景:脾脏来源的树突状细胞诱导周期长,产量相对较少,相关报道亦较少.目的:建立简便的体外扩增小鼠脾脏树突状细胞的方法.设计、时间及地点:细胞形态学观察实验,于2007-02/09在华北石油总医院中心实验室完成.材料:健康BALB/C小鼠、C57小鼠及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4.方法:无菌手术取C57小鼠脾脏,用1 mL注射器抽取Hanks液,刺入脾脏并反复冲洗,获取单个核细胞,用0.1 g/L粒-单核细胞集落刺激因了、白细胞介素4的H-DMEM培养,8 d后即得成熟的树突状细胞.同时无菌取BABIJC小鼠脾脏制备单细胞悬液,收集非黏附细胞调整密度后作为反应细胞.再将两种细胞混合培养.主要观察指标:成熟树突状细胞的形态学观察,并对其表面CD11c,CD86及MHC-Ⅱ类分子进行检测.并计算两种细胞混合培养后的吸光度值.结果:体外诱导培养8 d后获得大量成熟的树突状细胞,细胞表面具有典型的树枝状突起,高表达树突状细胞相对特异性表面分子CD11c(78.46%)、CD86(87.24%)及MHC-Ⅱ(92.65%),同时具有较强的刺激同种异基因混合淋巴细胞增殖的能力.结论:联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素体外诱导培养小鼠脾脏细胞,可生成大量功能成熟的树突状细胞.     

慢病毒介导可溶性肿瘤坏死因子受体1在小鼠骨髓未成熟树突状细胞中的表达(英文)

背景:肿瘤坏死因子α是介导树突状细胞成熟的重要细胞因子之一,可溶性肿瘤坏死因子受体1与其结合可阻断肿瘤坏死因子α的作用,维持树突状细胞于不成熟状态,诱导免疫耐受.目的:构建含有人sTNFR1的慢病毒表达载体,观察其在未成熟树突状细胞中的表达.方法:以人外周血单个核细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增出sTNFR1基因片段,亚克隆至慢病毒转移质粒pXZ208,通过IRES连接eGFP报告基因,建立双顺反子慢病毒转移质粒,命名为pXZ9-sTNFR1,DNA测序鉴定.采用脂质体转染293 FT细胞,根据报告基因eGFP测定病毒滴度.采用小剂量粒-巨噬细胞集落刺激因子+白细胞介素4体外培养扩增C57BL/6小鼠骨髓来源树突状细胞.培养第5天,以pXZ9-sTNFRl重组慢病毒上清感染未成熟树突状细胞,RT-PCR检测感染后sTNFRl转录,Westernblot法检测sTNFR1蛋白表达,观察sTNFR1基因修饰及脂多糖刺激后树突状细胞的表型特征.结果与结论:成功构建重组质粒pXZ9-sTNFR1,转染293 FT细胞24 h后观察到eGFP表达,病毒滴度在10~6U/L以上.RT-PCR显示pXZ9-sTNFR1感染的未成熟树突状细胞sTNFR1呈阳性表达,Western blot检测到sTNFR1蛋白存在于感染后未成熟树突状细胞和培养上清中.培养第5天的树突状细胞低表达CD40、CD86、CD80和MHCⅡ类分子,脂多糖刺激后,高表达MHCⅡ类分子和CD40、CD80、CD86分子,显示出成熟型树突状细胞表型特征,sTNFR修饰的树突状细胞MHC Ⅱ类分子和CD40、CD80、CD86分子表达水平无变化.提示:①成功构建了负载sTNFR1基因片段及含eGFP报告基因的慢病毒载体,获得了高滴度的重组慢病毒颗粒.②经慢病毒高效转导的未成熟树突状细胞sTNFR1 mRNA及蛋白稳定地表达,可以保护未成熟树突状细胞不被外源性脂多糖刺激活化,维持树突状细胞于非成熟状态.     

双重保护培养SD大鼠骨髓来源树突状细胞

目的:深入研究大鼠骨髓来源的树突状细胞的生物学功能,建立一种有效的细胞培养方法.方法:提取大鼠骨髓细胞,采用GM-CSF + IL-4进行体外诱导分化,对最终培养的细胞采用形态、表型、功能综合鉴定.结果:大鼠骨髓细胞培养12 d,光镜下呈现典型的树突状细胞形态.细胞表面分子抗原随着培养时间的延长表达也增加.各时间点分子抗原表达差异有统计学意义(P ＜ 0.05).其中第12天刺激T细胞增殖能力强.结论:该方法是一种经济、实用、有效的体外诱导扩增大鼠骨髓来源树突状细胞的培养方法.     

RelB shRNA慢病毒感染小鼠骨髓树突状细胞的免疫学效应

背景:沉默树突状细胞发育成熟的关键基因核因子кB/RelB可构建新型致耐受树突状细胞? 目的:探讨RelB shRNA转染小鼠骨髓树突细胞的生物免疫学功能的影响.方法:利用重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和重组白细胞介素4联合诱导小鼠骨髓树突状细胞;慢病毒载体将RelB shRNA转染致小鼠骨髓树突细胞后,分为未成熟树突状细胞、脂多糖刺激成熟、RelB基因沉默及脂多糖刺激RelB沉默的4组树突状细胞进行观察.结果:体外培养第 6 天脂多糖刺激组细胞表面可见大量细长的类似树枝的突起,其他3组细胞形态特征相似,呈圆形、皱缩状态,这3组细胞表面MHC-II类分子、CD86和CD40分子表达水平相当,但低于脂多糖刺激组;3组混合淋巴细胞反应中刺激T细胞增殖能力差异无显著性意义(P > 0.05),但均较脂多糖刺激组显著降低(P < 0.01);RelB基因沉默的树突状细胞分泌Th1细胞因子γ-干扰素和白细胞介素2的能力较低,分泌Th2白细胞介素10和白细胞介素4的能力较高(P < 0.01),Th1/Th2细胞因子的比例与未成熟树突状细胞类似.说明RelB shRNA经慢病毒转染骨髓源性树突状细胞后,在细胞形态、表面分子表达、免疫学功能等方面均具有与未成熟树突状细胞相似的特点,且不能被脂多糖刺激成熟.     

小鼠骨髓树突状细胞体外扩增方法的探索

背景树突状细胞(Dendritic cells,DC)是抗原提呈功能最强的细胞,但因数量极微限制了它的应用.目的建立小鼠骨髓DC体外大量扩增方法.设计完全随机对照研究.地点和对象实验地点基础医学部中心实验室;C57BL/6(H-2kh)小鼠,BALB/c(H-2kd)小鼠各6只.干预用粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与白细胞介素4(IL-4)体外培养小鼠骨髓细胞.主要观察指标用相差显微镜观察形态学变化,3H-TdR掺入法检测细胞增殖能力,FACS检测细胞表面分子,ELISA检测细胞因子.结果扩增的DC形态学特征典型,具有强烈的激活T细胞增殖能力,表达IaKb,CD11c,CD80,CD86,ICAM-1分子以及分泌IL-12,IL-6,TNF-α和IL-1β水平增强.结论该法在体外扩增的大量的DC细胞,具很强的免疫学活性.     

CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞的诱导培养及鉴定

背景:新近发现CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞在参与免疫负向调控机制和临床治疗上有潜在的意义。目前对于健康人骨髓来源的调节性树突状细胞的体外诱导培养及鉴定的研究较少。目的:体外培养正常人骨髓来源的具有CD11clowCD45RBhigh表型的调节性树突状细胞,从细胞形态、免疫表型、吞噬功能及刺激T淋巴细胞增殖能力等方面对其进行鉴定。方法:分离正常人骨髓单个核细胞分别在不同的培养体系中进行体外诱导培养,实验分3组:①调节性树突状细胞组,在含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素10,转化生长因子β1的1640培养基中培养7d后,用脂多糖刺激24h。②未成熟树突状细胞组,用含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素4的1640培养基培养8d。③成熟树突状细胞组,用含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素4的1640培养基培养7d后,予脂多糖刺激24h,使其成熟。光镜和扫描电镜观察树突状细胞的形态,流式细胞仪检测其免疫表型以及吞噬能力,CCK-8法检测其刺激异基因淋巴细胞增殖能力。结果与结论:①人骨髓源单个核细胞在联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素10,转化生长因子β1培养8d后获得的细胞具有调节性树突状细胞的典型特征和免疫表型,说明该实验建立的培养调节性树突状细胞的方法是切实可行的。②CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞这种新亚群具有较强的吞噬能力,刺激T淋巴细胞增殖的能力较弱,为调节性树突状细胞诱导免疫耐受的进一步研究奠定实验基础。