上海地区深静脉血栓形成患者抗活化的白蛋C及FV Leiden突变的初…

应用抗活化的蛋白Ｃ（ＡＰＣＲ）试验、多聚酶链反应－限制性内切酶长度多态性（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）分析及ＤＮＡ序列分析对上海地区深静脉血栓形成（ＤＶＴ）患者ＡＰＣＲ及ＦⅤ Ｌｅｉｄｅｎ突变进行调查。正常人群正常ＡＰＣＲ敏经值（ｎ－ＡＰＣ－ＳＲ）的５％百分位数为０．７５，在被调查的３１例ＤＶＴ患者中有５例患者的ｎ－ＡＰＣ－Ｒ低于此值，ＤＶＴ患者ＡＰＣＲ的发生率为１６％，且ＤＶＴ患者与正常人的ＡＰＣＲ发生率     

上海地区深静脉血栓形成患者抗活化的蛋白C及FⅤLeiden突变的初步调查

应用抗活化的蛋白Ｃ（ＡＰＣＲ）试验、多聚酶链反应－限制性内切酶长度多态性（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）分析及ＤＮＡ序列分析对上海地区深静脉血栓形成（ＤＶＴ）患者ＡＰＣＲ及ＦⅤＬｅｉｄｅｎ突变进行调查。正常人群正常ＡＰＣＲ敏感比值（ｎ－ＡＰＣ－ＳＲ）的５％百分位数为０．７５，在被调查的３１例ＤＶＴ患者中有５例患者的ｎ－ＡＰＣ－Ｒ低于此值，ＤＶＴ患者ＡＰＣＲ的发生率为１６％，且ＤＶＴ患者与正常人的ＡＰＣＲ发生率有显著差异（Ｐ＜０．０５）。用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ检查了１４１例排除ＤＶＴ的个体和３５例ＤＶＴ患者的Ｌｅｉｄｅｎ突变情况，发现所有样本的ＰＣＲ－ＲＦＬＰ均显示了同样的代表野生型基因型的电泳条带，未发现Ｌｅｉｄｅｎ型突变。ＡＰＣＲ试验阳性的２例ＤＶＴ患者之多聚酶链反应（ＰＣＲ）产物测序结果进一步证实了实验中ＰＣＲ反应和ＭｎｌＩ酶切反应的特异性。结果说明ＡＰＣＲ现象可能是中国人群ＤＶＴ发病的一个危险因素；但我们与西方调查者实验结果的差别，说明在不同种族中，ＤＶＴ的致病机制可能不同     

血栓栓塞症患者抗活化的蛋白C的研究

目的 探讨抗活化的蛋白Ｃ（ＡＰＣＲ）现象在中国人血栓栓塞症发病中的作用。方法 用ＡＰＴＴ法检测ＡＰＣＲ敏感比率（ＡＰＣＲ－ＳＲ）来研究４０例深静脉血栓症（ＤＶＴ）患者、５２例脑血栓形成患者和１００例正常人的ＡＰＣＲ发生率;用多聚酶链反应－限制性内切酶长度多态性（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）来检测ＦＶ Ｌｅｉｄｅｎ突变;用免疫火箭电泳测血浆总蛋白Ｓ和游离蛋白Ｓ。结果 正常人的正常化ＡＰＣＲ－ＳＲ（ｎ－ＡＰＣＲ     

聚合酶链反应单链构象多态性和银染技术筛查胰岛素受体基因突变

目的建立聚合酶链反应单链构象多态性（ＲＣＲＳＳＣＰ）和银染技术筛查胰岛素受体基因突变方法。方法选择８９例非胰岛素依赖型糖尿病患者,ＰＣＲ扩增编码胰岛素受体酪氨酸激酶域的外显子（外显子１７～２１）,进行ＳＳＣＰ电泳,银染色后,对突变样品进行序列分析。结果发现１１例外显子１７和１例外显子２０的异常电泳条带,外显子１７的突变经顺序分析,为ＣＡＣ１０５８→ＣＡＴ１０５８的杂合和纯合多态性突变。结论ＰＣＲＳＳＣＰ结合银染技术是一种操作简便、经济、灵敏度高、适合于临床大样本基因突变筛查的方法。     

云南省汉族中所见的一例G6PD基因nt1004C→A突变

目的：检测云南人群中是否存在新的葡萄糖－６－磷酸脱氢酶（Ｇ６ＰＤ）基因突变型。方法：在排除中国人中的常见突变后，作２～１２逐个外显子多聚酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）分析，对电泳异常者测序证实。结果：在筛查云南人群８２３人Ｇ６ＰＤ缺乏症时，发现Ｇ６ＰＤ缺乏者５４例。对其中２９例作了突变型鉴定，除发现１３８８Ｇ→Ａ突变１９例、１３８１Ｇ→Ａ突变１例外，其余９例中，查出１例为第９外显子ＳＳＣＰ有异常泳带。直接测序证实在第９外显子ｎｔ１００４位有Ｃ→Ａ的碱基置换，导致丙氨酸→天冬氨酸。结论：该例为罕见突变，为中国人中的第二例，云南汉族中的首例。     

von Willebrand因子基因外显子28 Arg611 His突变导致的2型血管性血友病

为阐明ｖｏｎＷｉｌｅｂｒａｎｄ因子（ｖＷＦ）基因外显子２８发生突变导致的血管性血友病（ｖＷＤ）的基因缺陷，应用多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术获得ｖＷＦ基因外显子２８，分１０个基因片段（Ｃ～Ｌ）用变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）技术筛选ｖＷＤ患者的基因突变，对变性行为有改变的片段直接测序。在一例２型ｖＷＤ患者ｖＷＦ基因外显子２８的５′端，ＤＧＧＥ显示泳动明显减慢的条带，直接测序表明发生Ｇ→Ａ杂合突变，导致ｖＷＦ成熟蛋白Ａ１区Ａｒｇ６１１Ｈｉｓ替换；此外还发现在中国人群存在Ａｌａ６１８／Ｔｈｒ６１８（Ｇ４１４０Ａ）双态性。位于Ａ１区的Ａｒｇ６１１Ｈｉｓ突变产生血小板依赖性功能减低的２型ｖＷＤ，有助于了解ｖＷＦ的结构与功能的关系；而Ａｌａ６１８／Ｔｈｒ６１８双态性则可作为连锁分析标记用于ｖＷＤ家系的遗传咨询     

脑梗死患者血浆活化蛋白C抵抗、蛋白C和蛋白S活性的测定

活化蛋白Ｃ抵抗 (ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＣｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ,ＡＰＣＲ)是目前已知的静脉血栓形成的最高危因素[1] ,80 %的ＡＰＣＲ是因子Ｖ (ＦＶ)基因点突变 (即Ｌｅｉｄｅｎ突变 )引起的遗传性ＡＰＣＲ ,另一部分ＡＰＣＲ则是由各种获得性原因导致的无ＦＶ基因突变的获得性ＡＰＣＲ。ＡＰＣＲ与动脉血栓形成的关系目前仍有争论。蛋白Ｃ( ｐｒｏｔｅｉｎＣ ,ＰＣ)、蛋白Ｓ(ｐｒｏｔｅｉｎＳ ,ＰＳ)是机体ＰＣ抗凝系统的重要组成部分 ,它们量或质的缺陷 (包括先天性和获得性 )都将导致机体抗凝功能的减退或丧失 ,与血栓形成…     

广东人抗活化蛋白C及FV Leiden突变的检测

为了解活化蛋白Ｃ抵抗（ＡＰＣＲ）以及凝血因子Ｖ Ｌｅｉｎｄｅｎ（ＦＶ Ｌｅｉｄｅｎ）突变在广东人群及血栓性疾病患者中发生的情况,用序列特异性引物ＰＣＲ（ＰＣＲ－ＳＳＰ）方法检测１３０名广东籍正常人ＦＶ Ｌｅｉｄｅｎ突变,其中５７名正常人用ＡＰＣ－ＡＰＴＴ方法检测了ＡＰＣＲ。结果有３名正常人ＡＰＣＲ阳性。但所有的样本均未发现ＦＶ Ｌｅｉｄｅｎ突变,ＡＰＣＲ阳性是否与其他未知的基因缺陷有关,有待进一步     

β地中海贫血[-28(A→G)·CD17(A→T)/N]双重突变杂合子的基因鉴定及家系分析

目的：报道β地中海贫血（β地贫）［－２８（Ａ→Ｇ）·ＣＤ１７（Ａ→Ｔ）／Ｎ］双重突变杂合子的基因鉴定及家系分析结果。方法：采用聚合酶链反应结合等位基因特异的寡核苷酸探针杂交（ＰＣＲ／ＡＳＯ）技术。结果：对４例先证者及其家系成员计３５人进行基因鉴定，共检出２２人同时携带有β地贫－２８（Ａ→Ｇ）和ＣＤ１７（Ａ→Ｔ）的突变基因，结合临床体征、血液及生化指标、家系调查资料综合分析，确定他们是β地贫［－２８（Ａ→Ｇ）·ＣＤ１７（Ａ→Ｔ）／Ｎ］双重突变杂合子，为同一条染色体上基因的双重点突变。结论：［－２８（Ａ→Ｇ）·ＣＤ１７（Ａ→Ｔ）／Ｎ］双重突变杂合子是一种新的β地贫类型，这种β地贫的发现，为认识我国地贫的高度异质性积累了资料。     

一例凝血因子Ⅷ B区错义突变导致重型血友病A

目的：检测一例重型血友病Ａ患者（ＳＨ９）的基因突变。方法：用ＰＣＲ、变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）和ＤＮＡ测序检测因子Ⅷ基因突变。先用Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ排除内含子２２倒位，然后应用ＰＣＲ对凝血因子Ⅷ基因进行扩增。扩增范围包括所有外显子及其侧翼内含子序列。结果：片段１４２在ＤＧＧＥ中泳动异常。ＤＮＡ测序证实Ｃ２５３５Ａ导致Ｂ区错义突变８２６Ａｓｐ（ＧＡＣ）→Ｇｌｕ（ＧＡＡ）。结论：该突变可能是导致重型血友病Ａ的原因，但有待进一步研究证实。     

两个终止密码子导致的遗传性蛋白C和蛋白S缺陷症

目的:研究1个蛋白C(PC)和1个蛋白S(PS)缺陷症家系的表型诊断和基因特征。方法:PC活性(PC:A)和PS活性(PS:A)用发色底物法测定;PC抗原(PC:Ag)和PS抗原(PS:Ag)用ELISA方法测定。用PCR扩增PC和PS基因各个外显子及其侧翼序列,用直接测序法检测突变点。利用逆转录PCR(RT-PCR)分析PCmRNA水平变化。同时利用蛋白印迹分析血浆中PC含量的变化。结果:先证者1的PC:A为49%,PC:Ag为1.34mg/L,基因检测发现PC基因9号外显子的8831有G→A杂合无义突变,导致Trp372Stop;先证者2的PS:A为29%,PC:Ag为8.3mg/L,14号外显子Gln522(CAG)→Stop(TAG)。结论:G8831A杂合突变引起Trp372Stop,其可导致遗传性PC缺陷症;Gln522Stop可导致遗传性PS缺陷症。     

两个遗传性蛋白C缺陷症家系临床表型和基因型变化的研究

目的对两个遗传性蛋白C（PC）缺陷症家系进行临床表型和基因突变检测。方法血浆蛋白C活性（PC：A）和抗原（PC：Ag）分别用发色底物法和ELISA法测定，蛋白S活性（PS：A）和抗凝血酶活性（AT：A）用发色底物法测定。用PCR法对先证者PC基因的9个外显子及其侧翼、内含子序列进行扩增，PCR产物纯化后直接测序，检测其基因突变。仅对先证者家系成员基因突变部位的外显子及其侧翼序列进行PCR扩增和测序。突变位点经限制性内切酶酶切分析或直接测序证实。结果先证者1（Ⅱ7）的PC：A和PC：Ag分别为1．2％和0。基因测序显示，先证者1在PC基因外显子5存在C3135G杂合错义突变，致C（TGC）64W（TGG），同时在外显子7存在T6128G杂合错义突变，致F（TTC）139V（GTC）。家系成员中，先证者的父亲（Ⅰ4）和女儿（Ⅲ3）存在T6128G杂合突变，先证者的舅舅（Ⅱ）存在C3135G杂合突变，先证者丈夫（Ⅱ8）存在外显子76161-6163或6164～6166AAG（K150或K151）杂合缺失，而其女儿（Ⅲ3）亦有此突变。先证者2（Ⅲ1）的PC：A和PC：Ag分别为50．3％、1．9mg／L，基因测序显示其存在K150或K151杂合缺失，该突变遗传自其父亲。2个家系中所有成员在PC基因启动子区中存在-1654C／T、-1641A／G、-1476A／T多态性，先证者2为CC／GG／TT纯合型。限制性内切酶PSp5Ⅱ酶切分析显示T6168G不是多态性。所有成员的PS：A和AT：A均在正常范围。结论复合杂合性PC基因突变（C64W和F139V）是导致先证者1遗传性Ⅰ型PC缺陷症的原因，杂合性Lys150或151缺失突变和PC基因启动子区CC／GG／TI纯合多态性是致先证者2遗传性Ⅰ型PC缺陷症的原因。C64W为国际首次报道，F139V、K150或151缺失突变为国内首次报道。     

遗传性蛋白C缺陷症家系的一个基因突变

目的 研究一个遗传性蛋白C（PC）缺陷症家系的遗传表型及基因特征。方法 PC活性用凝固法测定，PC抗原用ELISA方法测定。用PCR扩增2代家系12个成员中4个PC活性及抗原减低的PCⅡ-Ⅸ号外显子片段，用单链构象多态性（SSCP）分析cDNA变性后的差异，用测序法检测突变点。用限制性酶切验证突变点，同时分析家系的基因型。结果 该家系2代4名成员PC抗原水平在34．3％－67．8％（参考值80％－120％）。PC活性在22％－49％（参考值70％－130％），较正常参考范围明显减低。限制性酶切分析该家系12名成员时发现9名成员存在基因的突变。基因突变位点在Ⅶ号外显子第6219位核苷酸G→A突变，使正常编码的CGG精氨酸突变为CAG谷氨酰胺。结论 该家系为I型PC缺陷症，基因分析证明先证为杂合子型。在PCⅦ号外显子上第6219位核苷酸G→A突变，在蛋白质合成过程中第169位精氨酸被谷氨酰胺替代（R→Q），为目前国内献中尚未报道的一个基因突变点。     

一例遗传性蛋白C缺陷症家系的实验诊断

目的对1例遗传性蛋白C缺陷症家系进行临床表型诊断和基因突变检测。方法用发色底物法测定血浆蛋白C活性;用聚合酶链反应（PCR）法对先证者PC基因（PROC）的9个外显子及其侧翼序列进行扩增,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变。家系成员DNA在先证者PROC基因突变区域扩增后测序,进行家系调查以期发现遗传规律。结果先证者蛋白C活性为38.6%,抗原为45.3%。直接基因测序分析发现先证者PROC基因外显子7区存在杂合错义突变c.565C〉T,该突变将引起编码的蛋白C 147位精氨酸被色氨酸替换（p.Arg147Trp）。家系分析发现先证者的c.565C〉T突变遗传于其父亲。结论 c.565C〉T杂合突变是导致该家系遗传性PC缺陷症的原因。     

一种新的抗凝血酶基因突变导致遗传性抗凝血酶缺陷症

目的对1例遗传性抗凝血酶（AT）缺陷症患者及其家系成员AT活性（AT：A）、AT抗原含量（AT：Ag）进行检测及基因分析，探讨该遗传性AT缺陷症发病的分子机制。方法采用发色底物法和免疫比浊法分别检测先证者及其家系成员血浆AT：A和AT：Ag，提取外周血基因组DNA，PCR法扩增AT基因的全部7个外显子及侧翼序列，DNA序列分析AT的基因异常。结果先证者AT：A和AT：Ag分别为45％和97mg／L，为Ⅰ型AT缺陷症。AT基因外显子5区第9833位核苷酸发生杂合性T→A突变，引起Tyr363Stop（Y363X）无义突变。其他家系成员基因测序结果显示有4人（Ⅱ2、Ⅱ6、Ⅲ7、Ⅲ14）存在该突变。结论该家系为I型遗传性AT缺陷症。AT基因外显子5区杂合性9833T—A无义突变引起AT缺陷，导致静脉血栓是该遗传性AT缺陷症的分子致病机制。该突变在国际上尚未见报道。     

凝血因子Χ基因两种新的突变导致的遗传性凝血因子Χ缺陷症

目的:探讨1个遗传性凝血因子Χ(FΧ)缺陷症家系的分子发病机制。方法：测定活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间、FΧ促凝活性以及FΧ抗原进行表型诊断；用PCR方法对先证的FΧ基因8个外显子及其侧翼序列和5′端非翻译区(5′UTR)序列进行扩增，产物纯化后直接测序检测其基因突变。应用等位基因特异性PCR验证测序所发现的突变。结果：先证表型诊断为FΧ缺陷症(Ⅱ型)；FΧ基因分析发现2个杂合突变：第1内含子5′端剪接位点供位GT→AT(IVS1 1G′A)和第8外显子1185G′A(Arg347His)。结论：双重杂合性突变IVS1 1G′A和Arg347His是导致该例遗传性FΧ缺陷症的原因。     

Molecular basis of hereditary C3 deficiency.

Hereditary deficiency of complement component C3 in a 10-yr-old boy was studied. C3 could not be detected by RIA of serum from the patient. Segregation of C3 S and C3 F allotypes within the family confirmed the presence of a null gene for C3, for which the patient was homozygous. 30 exons have been characterized, spanning the entire beta chain of C3 and the alpha chain as far as the C3d region. Sequence analysis of the exons derived from the C3 null gene showed no abnormalities in the coding sequences. A GT-AT mutation at the 5' donor splice site of the intervening sequence 18 was found in the C3 null gene. Exons 17-21 were amplified by the polymerase chain reaction (PCR) from first-strand cDNA synthesized from mRNA obtained from peripheral blood monocytes stimulated with LPS. This revealed a 61-bp deletion in exon 18, resulting from splicing of a cryptic 5' donor splice site in exon 18 with the normal 3' splice site in exon 19. This deletion leads to a disturbance of the reading frame of the mRNA with a stop codon 17 bp downstream from the abnormal splice in exon 18. His parents had both the normal and abnormal C3 mRNA and were shown to be heterozygous for this mutation by sequence analysis of genomic DNA amplified by PCR. Similar splice mutants have previously been reported in the beta-globin, phenylalanine hydroxylase, and porphobilinogen deaminase genes. This mutation is sufficient to cause the deficiency of C3 in the patient.     

抗凝血酶基因A9850G突变导致一个新的遗传性抗凝血酶缺陷症家系

目的对一个遗传性抗凝血酶(AT)缺陷症家系进行临床表型诊断和基因突变检测。方法用AT活性(AT:A)和抗原含量(AT:Ag)作实验诊断;用聚合酶链反应(PCR)对先证者AT基因的7个外显子及其侧翼内含子序列进行扩增,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变(H is369Arg),为国际首次报道。结果先证者表现为AT基因外显子5区的第9850位有A→G的杂合突变。结论该突变是遗传性AT缺陷症的一个新的突变位点,可以导致血栓形成。     

遗传性蛋白S缺陷症一个新的基因突变

目的 研究一个遗传性蛋白S（PS）缺陷家系的遗传表型及基因型特征。方法 PS活性用凝固法测定,PS抗原用ELISA方法测定。用聚合酶链反应扩增5代家系34个成员中9个PS活性及抗原减低的PS1－15号外显子片段,用单链构象多态性（SSCP）分析cDNA变性后的差异,用测序方法检测突变点。结果 该家系5代9名成员游离PS抗原在10％－45％（正常值为55％－128％）。PS活性在13％－37％（正常值为70％－130％）,较正常参考范围明确降低,二者呈平行下降,但总PS抗原均在正常范围。在这些成员中均检测到10号外显子第163位核苷酸G→T突变,使AGT→ATT,在mRNA转录时,转录为终止密码子,阻断蛋白质的合成。结论 本家系的Ⅲ型PS缺陷症基因分析证明,先证者为杂合子型。在PS10号外显子上第163位核苷酸发生G→突变,在蛋白质合成过程中丝氨酸被终止密码子替代,为目前文献中尚未报道的一个新的基因突变点。     

Seven novel mutations in the factor XIII A-subunit gene causing hereditary factor XIII deficiency in 10 unrelated families.

BACKGROUND: Hereditary factor (F)XIII deficiency is a rare bleeding disorder mostly due to mutations in FXIII A subunit. OBJECTIVES: We studied the molecular basis of FXIII deficiency in patients from 10 unrelated families originating from Israel, India and Tunisia. METHODS: Exons 2-15 of genomic DNA consisting of coding regions and intron/exon boundaries were amplified and sequenced. Structural analysis of the mutations was undertaken by computer modeling. RESULTS: Seven novel mutations were identified in the FXIIIA gene. The propositus from the Ethiopian-Jewish family was found to be a compound heterozygote for two novel mutations: a 10-bp deletion in exon 12 at nucleotides 1652-1661 (followed by 22 altered amino acids and termination codon) and Ala318Val mutation. The propositus of the Tunisian family was homozygous for C insertion after nucleotide 863 within a stretch of six cytosines of exon 7. This insertion results in generation of eight altered amino acids followed by a termination codon downstream. The propositus from Indian-Jewish origin was found to be homozygous for G to T substitution at IVS 11 [+1] resulting in skipping of exons 10 and 11. In addition to the Ala318Val mutation, three of the novel mutations identified are missense mutations: Arg260Leu, Thr398Asn and Gly210Arg each occurring in a homozygous state in an Israeli-Arab and two Indian families, respectively. CONCLUSIONS: Structure-function correlation analysis by computer modeling of the new missense mutations predicted that Gly210Arg will cause protein misfolding, Ala318Val and Thr398Asn will interfere with the catalytic process or protein stability, and Arg260Leu will impair dimerization.