低频超声联合微泡增强脂质体介导Racl—shRNA质粒转染前列腺癌细胞及对其生物学行为的影响

目的研究低频超声联合微泡增强脂质体介导的Racl-shRNA质粒转染前列腺癌PC3、DUl45细胞,并探索其对前列腺癌细胞凋亡、侵袭能力的影响。方法基础情况下Westernblot检测RWPE-1细胞、PC3细胞和DUl45细胞的Rac1蛋白表达。根据不同处理方式将细胞分为四组：PC3细胞对照组（A组）、超声加微泡联合脂质体转染PC3细胞组（B组）、DUl45细胞对照组（c组）及超声加微泡联合脂质体转染DUl45细胞组（D组）。通过蛋白质体外结合实验技术检测各组Racl蛋白的活性及表达;流式细胞仪检测各组细胞早期凋亡情况;细胞侵袭实验检测各组细胞侵袭能力。结果基础情况下前列腺癌PC3、DUl45细胞Racl蛋白表达均较正常前列腺细胞RWPE-1增加,差异均有统计学意义（均P〈0．01）;低频超声携微泡介导Rac-1shRNA质粒转染细胞后,B组Racl蛋白表达量较A组表达减少,D组表达量较C组减少,差异均有统计学意义（均P〈0．01）;早期细胞凋亡检测显示,B组高于A组,D组高于C组,差异均有统计学意义（均P〈0．01）;同期细胞侵袭力实验显示,B组穿膜细胞数少于A组,D组的穿膜细胞数少于C组,差异均有统计学意义（均P〈0．01）。结论低频超声联合微泡可促进脂质体介导的Racl-shRNA质粒转染人雄激素非依赖型前列腺癌细胞;通过抑制PC3、DUl45细胞中Racl蛋白表达可以促进癌细胞的早期细胞凋亡,同时可抑制癌细胞的侵袭能力。     

RNA干扰技术沉默黏附斑激酶诱导心脏成纤维细胞失巢凋亡

目的：利用短发夹RNA干扰载体介导的RNA干扰技术沉默成年大鼠心脏成纤维细胞中黏附斑激酶，观察细胞增殖和凋亡的变化。方法：实验于2004-12／2005-12在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室完成。实验选用10-12周龄清洁级的雄性Wistar大鼠24只，以转染靶向黏附斑激酶的重组RNA干扰质粒的心脏成纤维细胞为干预组，选择未转染细胞和转染空质粒、非特异siRNA的细胞为不同对照组，共4组，各6只。消化法培养大鼠心脏成纤维细胞，设计、构建和鉴定黏附斑激酶RNA干扰载体，western blot法测量黏附斑激酶的沉默效率，四唑盐比色法检测细胞增殖，DNA缺口末端标记技术检测细胞凋亡，流式细胞仪测定B细胞淋巴瘤2和bax的变化。结果：Wistar大鼠24只，全部进入结果分析。①酶切鉴定和测序鉴定表明黏附斑激酶RNA干扰载体构建成功，转染细胞后，Western blot结果表明第二个重组黏附斑激酶RNA干扰载体的RNA沉默效率最高，为72．1％，其余分别为66．2％和55．3％。（2）Pavu6＋27一黏附斑激酶2转染组A。值明显低于未转染细胞和转染空质粒、非特异siRNA组（0．179&;#177;0．017，0．30&;#177;0．002，0．296&;#177;0．006，0．28l&;#177;0．007；t=17．802，16．436，14．993，P〈0．01）：凋亡率较其余各组则明显升高【（22．28&;#177;2．13）％，（472&;#177;1．67）%，（636&;#177;92）％，（8．19&;#177;1．33）％；t=-19．05，-17．31，-15．16，P〈0．01]。（3）Pavu6＋27-黏附斑激酶2转染组bax上升明显，与正常对照组和空质粒转染组比较，差异十分显著（2．15&;#177;058，1．01&;#177;0．04，1．12&;#177;0．04；t=-4．79，-4．318，P〈0．01）；与阴性对照组比较，差异显著（1．19&;#177;0．31,t=-3．59，P〈0．05）。④Pavu6＋27-黏附斑激酶2转染组B细胞淋巴瘤-2表达较正常对照组、空质粒转染组、阴性对照组显著上升（1．62&;#177;0．15，1．04&;#177;0．03，1．09&;#177;0．01，1．23&;#177;0．04；t=-9．39，-8．701，-6．338，P〈0．05）。结论：通过RNA干扰技术沉默心脏成纤维细胞中黏附斑激酶基因的表达，可诱导心脏成纤维细胞凋亡，抑制或降低心脏成纤维细胞中黏附斑激酶表达可能是防治心肌纤维化的一种手段。     

环氧化酶-2RNA干扰对肺癌A549细胞凋亡及caspase家族的影响

目的观察环氧化酶-2（COX-2）RNA干扰对肺癌细胞凋亡的影响,以及对凋亡调控蛋白caspase-8、caspase-9、caspase-3的调控作用。方法构建COX-2特异性干扰质粒,并转染至肺癌A549细胞株中,AnnexinV-FITC／PI联合流式细胞仪检测细胞凋亡,Western Blot检测caspase-8、caspase-9、caspase-3的活性。结果成功构建COX-2特异性干扰质粒并转染至肺癌A549细胞株中,获得抑制COX-2表达的肺癌细胞模型;干扰COX-2的A549细胞凋亡率[（24．3±2．46）％]较未干扰组[（6．52±0．13）％]明显升高（P〈0．01）。干扰COX-2的肺癌细胞．4549caspase．8蛋白表达（0．86±0．09）较未干扰组（0．12±0．01）明显升高（P〈0．01）,caspase-3蛋白表达（0．94±0．09）较未干扰组（0．16±0．02）明显升高（P〈0．01）,caspase-9蛋白表达（1．12±0．11）较未干扰组（0．13±0．01）明显升高（P〈0．01）。结论干扰COX-2可以促进肺癌A549细胞的凋亡,并且活化caspase-8及caspase-9,从而活化caspase-3。     

粘着斑激酶活性对气道上皮细胞增殖的影响

目的：研究粘着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）磷酸化对细胞外基质成份诱导的气道上皮细胞增殖和细胞周期演进的影响，探讨粘着斑激酶活化对气道上皮细胞损伤后修复影响的机制。方法：通过纤维连接蛋白（finbronectin，FN）诱导培养的气道上皮细胞，利用四唑盐（MTT）比色实验研究气道上皮细胞增殖情况，采用流式细胞术分析气道上皮细胞细胞周期各期分布，以Western blot和免疫共沉淀检测FAK表达水平及其酪氨酸磷酸化程度；以FAK反义寡核苷酸（ODNs）经脂质体转染细胞，观察其对FAK磷酸化、细胞增殖和细胞在细胞周期各期分布的影响。结果：FN诱导的气道上皮细胞MTT吸光度明显增强，G1期细胞数量明显减少，S期和G2期细胞数量明显增多，同时FAK表达水平及其酪氨酸磷酸化程度显著增高；经脂质体转染了反义FAK寡核苷酸的气道上皮细胞MTT吸光度值显著降低，G1期细胞数明显增多，S期和G2期细胞数显著减少，FAK表达水平及其酪氨酸磷酸化程度降低，且与Gt期细胞数量的增多成显著负相关，与S期、G2期细胞数量和MTT吸光度的减少成明显正相关。结论：FAK是细胞外基质诱导气道上皮细胞增殖的重要信号分子，其活化促进气道上皮细胞的增殖和细胞周期的演进，在气道上皮细胞损伤后修复过程中起重要作用。     

促血小板生成素基因转染小鼠骨髓基质细胞的实验研究

目的探讨促血小板生成素（TPO）基因修饰的小鼠骨髓基质细胞（BMSCs）对TPO基因的表达的影响。方法用脂质体lipofectamine^TM2000将TPO cDNA真核表达质粒转染至骨髓基质细胞（BMSCs），RT—PCR方法检测TPO mRNA的表达，免疫组化法测定TPO的表达。结果转染TPO基因的BMSCs TPO mRNA及TPO表达量明显高于空载体组（P〈0．01）及未转染组（P〈0．01）。结论阳离子脂质体能有效介导TPO cDNA真核表达质粒转染BMSCs，且转染后BMSCs中TPO mRNA及TPO的表达显著上调。     

格尔德霉素对胶质瘤细胞MT1-MMP及u—PA基因表达的影响

目的研究格尔德霉素（GDM）作用下,膜型基质金属蛋白酶-1（MT1-MMP）和尿激酶型纤溶酶原激活物（u—PA）基因在胶质瘤细胞中的表达水平。方法培养胶质瘤细胞株U251-MG和U87-MG,反转录PCR方法检测MT1-MMP和u-PAmRNA表达。结果与正常对照组（NC）相比,HGF组u—PAmRNA表达显著增加（P〈0．05）;GDM组MT1-MMP和u—PAmRNA表达水平较对照组和HGF组均显著降低（P〈0．05）;HGF＋GDM组u—PAmR—NA表达水平较对照组和HGF组显著降低（P〈0．05）。结论GDM能够抑制胶质瘤细胞中MT1-MMP和u—PAmRNA的表达。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对肝细胞凋亡的影响

目的：探讨丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B在原发性肝癌发生中的作用,及其发生机制。方法：设置对照组、空白载体PCXN2组、转染NS4B组。使用脂质体介导法,转染丙型肝炎病毒非结构蛋白重组质粒NS4B进入Chang肝细胞内,并用G418筛选。绘制生长曲线,分别用流式细胞仪检测瞬时表达及稳定表达时肝细胞凋亡率,用均数±标准差表示,统计学分析采用Dunnettt检验及q检验。结果：瞬时表达各组（PCXN2,NS4B）凋亡率分别为：（9.18±0.60）%,（4.45±0.53）%。稳定表达各组（PCXN2,NS4B）凋亡率分别为：（15.75±2.09）%,（3.66±0.34）%。与PCXN2组比较P〈0.01。结论：NS4B抑制肝细胞凋亡率,可能导致肝细胞异常增殖,诱导肝癌发生。     

SDF-1 cDNA转染人骨髓间充质干细胞的实验研究

本研究旨在探讨基质细胞衍生因子-1（SDF-1）cDNA瞬时转染人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）前后hBMSCs中SDF-1mRNA表达的情况。在分离、培养、鉴定人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）和构建SDF-1-pIRES2-EGFP真核表达载体的基础上,通过脂质体介导法将SDF-1真核表达质粒转染至hBMSCs,观测绿色荧光蛋白的表达并用RT-PCR方法检测瞬时转染效率。结果发现：SDF-1-pIRES2-EGFP瞬时转染后hBMSCs的SDF-1mRNA表达增高约20%左右。结论：阳离子脂质体可以将SDF-1cDNA真核表达质粒瞬时转染入hBMSCs,但转染效率低下,不能获得足够数量的稳定转染细胞供后续实验,因此需对转染方法作进一步的探讨。     

受体型酪氨酸激酶对NIH-3T3细胞生长和移动浸润能力的作用

目的 研究受体型酪氨酸激酶RONΔ160对3T3细胞生长和移动浸润能力的作用。方法 NIH-3T3细胞转染质粒pDR2-RONΔ160，建立稳定表达RONΔ160的3T3-RONΔ160细胞株；免疫沉淀法检测细胞RONΔ160的酪氨酸磷酸化；倒置显微镜观察细胞形态变化；软琼脂培养法观察RONΔ160对NIH-3T3细胞生长能力的作用；体外跨室趋化运动实验检测RONΔ160对NIH-3T3细胞移动浸润能力的作用。结果 成功建立3T3-RONΔ160细胞株，western blot证明其稳定表达RONΔ160蛋白；免疫沉淀试验结果显示RONΔ160具有自身酪氨酸磷酸化；软琼脂生长实验示转染组细胞生长克隆数为146．00±3．61，而未转染组和载体对照组分别为11．67±1．15和12．67±2．52，转染组与未转染组、载体对照组分别比较，差异均有统计学意义（t分别=51．60、151．19．P均〈0．05）；体外跨室趋化运动实验结果示转染组穿膜细胞数为458．50±4．95，而未转染组和载体对照组分别为20．00±5．66和21．50±4．95，转染组与未转染组、载体对照组分别比较，差异均有统计学意义（t分别=58．47、437．00，P均〈0．05）。结论 表达受体型酪氨酸激酶RONΔ160可使NIH-3T3细胞形态明显变化．并显著增强NIH-3T3细胞的生长能力和移动浸润能力。     

H2-B1基因转染对小鼠内皮细胞凋亡与增殖的影响

目的转染pEGFP-N1-H281质粒载体至小鼠血管内皮细胞（VEC）,观察H2-B1基因对小鼠VEC凋亡与增殖的影响,探讨借鉴母胎免疫耐受模型预防心脏移植术后免疫排斥反应的机制。方法0.5μg/ml空质粒、0．5μg／ml H2-B1质粒、1.0μg/ml H2-B1质粒转染小鼠VEC后,采用实时荧光定量PCR、流式细胞仪、酶标仪检测不同时间质粒的转染效率、H2．B1基因mRNA的相对表达量、转染VEC的凋亡与增殖情况。结果荧光定量PCR结果显示,0．5μg/ml、1．0μg／ml H2-B1质粒组的H2-B1基因mRNA表达量均高于对照组（P〈0．05,P〈0．001）。H2-B1基因促进VEC凋亡,转染48h、72h后1．0斗g／mlH2一B1质粒组与空白对照、0．5μg／ml空质粒比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。H2-B1基因抑制VEC增殖,转染24h、48h、72h后0．5μg／ml H2-B1质粒组、1．0μg／ml H2-B1质粒组分别与空白对照组、0．5μg／ml空质粒组比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论pEGFP—N1-H281质粒载体转染小鼠VEC后,能够有效促进其凋亡,抑制其增殖,减弱小鼠VEC活性,诱导免疫耐受。     

外源Smad7转染肝星状细胞及对转化生长因子β1和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达的影响

背景:Smad7是转化生长因子β信号转导途径的主要抑制性蛋白,具有抗纤维化的作用.目的:构建并鉴定大鼠Srnad7真核表达质粒,观察外源Smad7可否有效转染肝星状细胞T6,并进一步研究其对转化生长因子β及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达水平的影响.设计、地点:基因重组及细胞观察实验,于新疆石河子大学医学院第一附属医院完成.材料:pcDNA3.1(+)质粒为课题组保留;大肠杆菌DH5a系石河子大学医学院新疆地方与民族高发病教育部重点实验室所赠;肝星状细胞T6细胞由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所提供品.方法:采用基因重组技术将Smad7cDNA插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建大鼠Smad7真核表达质粒.脂质体介导转染肝星状细胞T6细胞,分为正常对照、空质粒及转染组,G418筛选,挑取阳性细胞.主要观察指标:反转录-聚合酶链反应法检测各组中Smad7、转化生长因子β及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达水平.结果:酶切和测序结果证实Smad7真核表达质粒构建成功.Smad7转染组与正常对照组、空质粒组比较:Smad7 mRNA 达显著增加(P<0.01);转化生长因子β、Ⅰ型胶原mRNA表达减少(P<0.01);Ⅲ型胶原mRNA表达差异无显著性意义(P>0.05).正常对照组、空质粒组smad7、转化生长因子β及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达差异无显著性意义(P值均>0.05).结论:大鼠Smad7真核表达质粒构建成功,外源Srnad7转染肝星状细胞T6细胞后可有效表达,并能降低转化生长因子β及Ⅰ型胶原mRNA表达水平.     

RNA干扰沉默CXCR4基因对Jurkat细胞周期和凋亡的影响

本文研究探讨下调CXCR4的表达对人T-ALL Jurkat细胞周期和凋亡的影响。设计合成CXCR4的特异性siRNA,采用脂质体转染Jurkat细胞株。用RT—PCR检测siRNA对细胞内CXCR4基因表达的影响,用流式细胞术检测细胞周期分布和细胞的凋亡情况。结果表明：成功构建了CXCR4的特异性siRNA;与空白对照组相比,转染CXCR4siRNA的Jurkat细胞的CXCR4mRNA表达水平明显下降（56．9％±1．4％FS68．3％±2．4％）,G0／G1期细胞比例增加（35．8％±1．9％vs18．1％±1．2％）,G,／M期和S期细胞比例相应下降（19．8％±1．7％VS27．2％±1．5％;44．4％±2．1％VS54．7％±2．8％）,凋亡细胞率明显增高（20．9％±2．0％VS3．13％±0．9％）。结论：CXCR4的特异性siRNA能够有效下调CXCR4基因表达,诱导Jurkat细胞凋亡和细胞周期阻滞,从而抑制细胞的增殖。     

层黏连蛋白对胰腺癌细胞内在性耐药的影响及其机制

  目的  探讨层黏连蛋白(laminin, LN)对胰腺癌细胞内在性耐药的影响, 并探讨其作用机制。  方法  选择胰腺癌细胞系AsPC-1, 检测LN对盐酸吉西他滨(健择, gemcitabine, Gem)的细胞毒性及对Gem诱导细胞凋亡能力的影响。通过Western blot等方法检测LN对下游信号通路的影响; 在AsPC-1中, 过表达黏着斑激酶相关非激酶(focal adhesion kinase-related non-kinase, FRNK)或应用PF-573, 228抑制黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)磷酸化与活性, 检测FAK及其下游信号的抑制对LN作用的影响。  结果  在胰腺癌细胞系AsPC-1中, LN处理使Gem的细胞毒性及Gem诱导细胞凋亡的能力显著降低。Gem作用72 h后, LN处理组细胞存活率为57.71%±6.08%, 形成的克隆数目为55.33±5.01;而在无LN包被组, 细胞存活率与形成的克隆数目分别为36.65%±4.14%及31.43±4.62(P均 < 0.05);LN处理组Annexin V标记阳性细胞百分数(41.00%±5.46%)较无LN处理组(55.70%±3.44%)显著下降(P < 0.05)。LN能够时间依赖性上调AsPC-1细胞的FAKTyr397位点及Akt磷酸化水平, LN还可以显著增加AsPC-1细胞的survivin蛋白表达水平及BAD Ser-136位点磷酸化水平。过表达FRNK或应用PF-573, 228能够显著抑制FAK磷酸化水平及其下游通路的活化, 并能够对抗LN对胰腺癌内在性耐药的效应。应用PF-228可以使LN处理后Gem诱导的AsPC-1细胞凋亡率从26.77%±0.49%升高至38.53%±2.83%(P < 0.05)。  结论  细胞外基质蛋白LN能够诱导胰腺癌细胞系对Gem产生内在性耐药。LN影响胰腺癌细胞内在性耐药的具体机制可能与FAK磷酸化及其下游PI3K-Akt通路活化、Bad Ser-136位点磷酸化与survivin表达水平改变有关, FAK靶向治疗与Gem联合在胰腺癌治疗中具有重要的潜在应用价值。     

基质金属蛋白酶家族的表达对急性单核细胞白血病细胞体外侵袭力的影响

目的 研究基质金属蛋白酶家族(TIMP-2、MT1-MMP、MMP-2)的表达对急性单核细胞白血病细胞体外侵袭力的影响.方法 以急性单核细胞白血病细胞株SHI-1细胞为研究对象,用定量PCR、Western blot法分别检测TIMP-2、MT1-MMP、MMP-2 mRNA和蛋白表达,并以NB4、K562、THP-1等人类其他白血病细胞株细胞为对照,进行比较.构建TIMP-2逆转录病毒载体,转染SHI-1细胞,G418筛选,有限稀释法挑选出单克隆S1、S2、S3细胞.RNA干扰(RNAi)法干扰SHI-1细胞TIMP-2、MT1-MMP、MMP-2表达.明胶酶谱法测定不同细胞和骨髓基质细胞(BMSC)共培养24 h后上清中MMP-2的表达,细胞侵袭实验测定SHI-1细胞侵袭人工基质膜的能力.结果 SHI-1细胞的TIMP-2、MT1-MMP、MMP-2 mRNA表达和蛋白表达均显著高于其他细胞(P＜0.05).SHI-1细胞和BMSC共培养上清中的MMP-2酶原和活化的MMP-2含量及细胞体外侵袭率均高于其他细胞(P＜0.05).单克隆S1、S2、S3细胞TIMP-2 mRNA表达水平分别是SHI-1细胞的3.0倍、2.0倍和1.5倍(P＜0.05),蛋白表达水平分别上调2.6倍、1.5倍和1.3倍(P＜0.01),体外侵袭率增加1.5～2.5倍(P＜0.05),活化的MMP-2含量增加1.5～3.0倍(P＜0.01).RNA干扰基因沉默效率为85%～98%.SHI-1细胞TIMP-2、MMP-2、MT1-MMP表达沉默后,细胞侵袭率分别下降60%～70%、50%～60%、40%～50%(P＜0.05).RNA干扰后的细胞培养上清中检测不到活化的MMP-2.结论 SHI-1细胞在mRNA水平和蛋白水平均高表达TIMP-2、MT1-MMP、MMP-2 mRNA,SHI-1细胞和BMSC共培养后这些分子的高表达促进MMP-2的活化,增强细胞的体外侵袭力.TIMP-2表达增加1.5～2.5倍对SHI-1细胞MMP-2的活化和细胞的体外侵袭力发挥的是增强作用,而不是抑制作用.

Abstract：

Objective To study the effect of matrix metalloproteinase 2 ( MMP-2), membrane type 1 MMP (MT1-MMP) and tissue inhibitor of metalloproteinase 2 (TIMP-2) expressions on the in vitro invasive capacity of acute monocytic leukemia SHI-1 cells. Methods SHI-1, NB4, K562, M937 and THP-1 human leukemia cell lines were cultured in vitro. The mRNA and protein expressions of TIMP-2, MMP-2 and MT1-MMP in different cells were detected by quantitative RT-PCR and western blot. A retroviral vector carrying human TIMP-2 cDNA was constructed and transfected into SHI-1 cells. Three subclone cells (S1, S2 and S3) were screened by G418 and selected by limiting dilution. RNA interference (RNAi) was used to knock down the expression of MMP-2, MT1-MMP and TIMP-2. Cell invasion capacity was performed through a reconstituted human basement membrane assays. Zymography was used to analyze the expression of MMP-2 in the supernatant of co-culture. Results The expressions of MMP-2, MT1-MMP and TIMP-2 in SHI-1 cells were higher than that in other leukemic cells at both mRNA and protein levels (P ＜ 0. 05 ). The amount of proMMP-2 and activated MMP-2 in the conditioned media from SHI-1 cells co-cultured with bone marrow stromal cells (BMSCs) was more than that from other cells (P ＜ 0. 05 ). The in vitro invasive capacity of SHI-1 cells were higher than that of other cells( P ＜ 0.05 ). The mRNA levels of TIMP-2 were increased by about 3 fold, 2 fold and 1.5 fold in S1, S2 and S3 cells, respectively( P ＜ 0.05 ), while the protein levels were by about 2.6 fold, 1.5 fold and 1.3 fold than that of SHI-1 cells, respectively(P ＜ 0.01 ). The invasion rates of subclone cells demonstrated a 1.5 - 2.5 fold' elevation ( P ＜ 0.05 ) and activated MMP-2 from their supernatants increased by 1.5 -2.0 fold(P＜0.01 ). The knock-down efficiency of siRNA was 85% to 98%. The down-regulation of TIMP-2, MMP-2 and MT1-MMP decreased the invasion rates of SHI-1 cells by 60% -70%, 50% - 60% and 40% - 50%, respectively ( P ＜ 0. 05 ). No activated MMP-2 in the supernatants from any knock-down cells could be found. Conclusions SHI-1 cells constitutively overexpress MMP-2,MT1-MMP and TIMP-2 at both mRNA and protein levels. After co-cultured with BMSCs the SHI-1 cells increased MMP-2 activation and cell invasion. An increase of TIMP-2 expression in SHI-1 cells reflects an activating effect on cells invasion and MMP-2 activation.     

胰岛素样生长因子-Ⅰ对重症急性胰腺炎大鼠小肠黏膜上皮细胞凋亡的影响

目的 研究外源性胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠肠黏膜上皮细胞凋亡及凋亡相关基因bax,bcl-2,caspase-3 mRNA表达的影响.方法 72只雄性Wistar大鼠按照随机数字表法分为假手术组(SO组)、重症急性胰腺炎组(SAP组)、IGF-Ⅰ治疗组(IGF-Ⅰ组)共三组.通过胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠制作大鼠SAP模型,SO组用同样方法经胰胆管逆行注射生理盐水;IGF-Ⅰ组分别于术后30 min和术后3 h经后肢内侧皮下注射ICF-Ⅰ.各组动物分别于术后6,12,24 h处死8只,检测血浆淀粉酶,TUNEL法检测小肠黏膜上皮细胞凋亡,观察小肠组织病理学变化并进行病理评分,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测小肠黏膜上皮细胞中bax,bcl-2和caspase-3mRNA的表达.数据采用SPSS 11.0统计软件分析,多组间比较采用单因素方差分析.结果 IGF-Ⅰ治疗组与SAP组各时相点相比,血浆淀粉酶和小肠病理评分均低于各相应时相点,于12 h和24 h差异有统计学意义,均P<0.05;小肠黏膜上皮细胞凋亡指数IGF-Ⅰ组与SAP组各相应时相点相比均显著降低[6 h:(13.88±1.73)vs.(19.00±2.78);12 h:(10.13±1.55)vs.(17.63±1.60);24 h:(9.50±1.07)vs.(17.25±2.76)],P<0.05;电镜示小肠组织病理变化较SAP组明显改善.bax mRNA表达在SAP组各时点较SO组相应时相点明显增高[6 h:(1.35±0.18)vs.(0.85±0.12);12 h:(1.21±0.21)vs.(0.86±0.24);24 h:(1.14±0.24)vs.(0.95±0.22)],6 h即达高峰,而在IGF-Ⅰ组的表达与SAP组相应时相点比较则明显减弱,在12 h和24 h差异具有统计学意义(P<0.05),于24 h即接近SO组;caspase-3 mRNA表达在SAP组各时相点较SO组相应时相点明显增高[6 h:(0.78±0.01)vs.(0.55±0.04);12 h:(0.79±0.04)vs.(0.57±0.05);24 h:(0.81±0.06)vs.(0.55±0.01)(P<0.01)],而在IGF-Ⅰ组的表达与SAP组相应时相点比较则明显减弱,在12 h和24 h差异具有统计学意义(P<0.05):bcl-2 mRNA的表达在SO组和SAP组均较弱且差异无统计学意义,P>0.05,而在IGF-Ⅰ组各时相点的表达则明显增强[6 h:(0.65±0.07)vs.(0.54±0.04)vs.(0.57±0.06);12 h:(0.69±0.04)vs.(0.56±0.05)vs.(0.53±0.05);24 h:(0.72±0.05)vs.(0.54±0.07)vs.(0.58±0.08),P<0.05].结论 外源性IGF-Ⅰ通过拮抗SAP大鼠小肠黏膜上皮细胞的凋亡从而可以减轻SAP大鼠肠黏膜损害,其机制可能与其上调bcl-2 mRNA表达及下调bax,caspase-3 mRNA表达有关.     

miR-223对结肠癌SW480细胞生物学行为的影响

目的 观察miR-223对结肠癌SW480细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响.方法 PLL3.7-miR-223和PLL3.7-miR-EV质粒转染SW480细胞,Real-time PCR检测转染24h后miR-223的表达变化,CCK-8试剂盒检测转染12、24、48 h后细胞的增殖能力,流式细胞仪分析转染48 h后细胞周期和凋亡情况,Western blot检测IGF-1R、AKT蛋白表达情况.结果 转染24 h后,Real-time PCR检测结果显示PLL3.7-miR-223转染组miR-223的表达量（6.55±2.04）较PLL3.7-miR-EV（以其miR-223的表达量为1）明显上调（P＜0.01）.与对照EV组相比,SW480细胞在转染miR-223后生长明显受到抑制,细胞周期在G1期发生阻滞[（61.61±4.02）％vs.（35.99±1.62）％],凋亡增加明显[（67.43±4.75）％vs.（44.23±3.11）％],均P＜0.01,并且能够降低生长相关蛋白IGF-1R及细胞凋亡相关蛋白AKT的表达.结论 miR-223可以通过调节IGF-1R和AKT的表达影响结肠癌细胞SW480的增殖、细胞周期和凋亡.     

心源性猝死患者心肌SOCS-1和SOCS-3表达的研究

目的 探讨心源性猝死(sudden cardiac death,SCD)患者心肌中细胞因子信号转导抑制分子-1(suppressor of cytokine signaling-1,SOCS-1)和SOCS-3的表达及临床意义.方法 取2005-2006年中山大学法医学系的尸检心肌标本24例,其中9例尸检符合冠状动脉粥样硬化(非心肌梗死)导致SCD(简称非心梗组),7例尸检符合急性心肌梗死猝死(简称心梗组),对照组8例选择了因交通事故、外伤等所致死亡的患者.以RT-PCR法检测对照组、非心梗组和心梗组心肌中SOCS-1,SOCS-3的mRNA表达,用免疫组化法检测对照组、非心梗组和心梗组心肌中SOCS-1,SOCS-3的蛋白表达.数据以SPSS13.0统计学软件处理,采用方差分析检验.结果 非心梗组和心梗组患者心肌中SOCS-1 mRNA,SOCS-3 mRNA的表达量均显著高于对照组,分别为[(0.788±0.101),(0.741±0.111)vs.(0.436±0.044),P<0.01],及[(0.841±0.092),(0.776±0.070)vs.(0.454±0.076),P<0.01].非心梗组和心梗组患者心肌中SOCS-1的蛋白抗体阳性细胞数均显著高于对照组,分别为[(320.00±48.48),(347.14±70.88)vs.(42.50±10.35),P<0.01].非心梗组和心梗组患者心肌中SOCS-3的蛋白抗体阳性细胞数均显著高于对照组,分别为[(381.11±59.25)vs.(40.00±10.69),P<0.01]和[(332.86±111.91)vs.(40.00±10.69),P<0.01].结论 冠心病所致SCD患者的心肌中SOCS-1,SOCS-3的表达显著增加,提示它们可能参与了SCD的发病机制.     

系统性红斑狼疮患者血清催乳素水平与Th1/Th2细胞因子平衡研究

目的 探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血催乳素(PRL)水平、Th1/Th2细胞因子分泌模式与SLE患者病情活动的关系.方法 检测40例SLE患者(SLE组)血清PRL IFN-γ、IL-4水平,分析二者与SLE病情活动的关系并与20例健康献血者(对照组)比较.结果 ①SLE组较正常对照组血清PRL[(21.58±4.29)ng/ml与(11.87±2.57)ng/ml,P<0.01)]、IL-4[(26.79±5.08)ng/L与(10.71±1.35)ng/L,P<0.01)]高,而IFN-γ[(11.47±3.36)ng/L与(18.36±2.61)ng/L,P<0.01)]、IFN-γ/IL-4(0.76±0.29与2.30±0.15,P<0.01)较正常对照组低.②SLE病情活动组PRL[(28.07±6.36)ng/ml与(14.61±2.14)ng/ml,P<0.01)]、IL-4[(38.52±8.44)ng/L与(14.15±1.63)ng/L,P<0.01)]高于病情稳定组,而IFN-γ[(6.98±2.72)ng/L与(16.24±2.57)ng/L,P<0.01)]、IFN-γ/IL-4(0.35±0.14与1.24±0.29,P<0.01)水平低于病情稳定组.③SEE活动期组10例患者治疗好转后较治疗前PRL[(39.41±11.65)ng/ml与(14.49±8.65)ng/ml,P<0.01)]、IL-4[(45.12±10.44)ng/L与(17.53±5.42)ng/L,P<0.01)]下降,IFN-γ[(6.31±2.59)ng/L与(16.89±4.43)ng/L,P<0.01)]、IFN-γ/IL-4(0.16±0.11与1.16±0.27,P<0.01)回升.结论 SLE患者存在高PRL血症及Th2细胞因子优势,高PRL血症和Th1/Th2比值失衡程度与病情活动呈消长关系.     

重组腺病毒介导反义p38α基因抑制烧伤复合缺氧条件下乳鼠心肌细胞凋亡的研究

目的 探讨烧伤血清复合缺氧条件下乳鼠心肌细胞p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)活化与细胞凋亡之间的关系.方法 采用原代培养的乳鼠心肌细胞,按照处理因素不同分为3组:正常对照组细胞自然生长;烧伤缺氧组细胞给予烧伤血清+缺氧刺激(含10%的40%总体表面积Ⅲ度烫伤大鼠伤后6 h血清的DMEM/F12培养液+1%O2、5%CO2和94%N2);反义阻断组在细胞转染反义p38α重组腺病毒(AD-ASp38α)后给予烧伤血清+缺氧刺激.细胞培养6 h后,采用蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测p38磷酸化水平;采用DNA片断和流式细胞术检测心肌细胞凋亡情况.结果 与正常对照组比较,烧伤缺氧组p38磷酸化水平(灰度值)明显提高(8.68±0.14比3.21±0.05,P＜0.01),细胞凋亡率明显增高[(50.367±0.451)%比(2.063±0.111)%,P＜0.01];心肌细胞转染AD-ASp38α后,p38磷酸化水平(灰度值)明显下降(5.46±0.16比8.68±0.14,P＜0.01),细胞凋亡率明显降低[(13.200±0.121)%比(50.367±0.451)%,P＜0.01].结论 烧伤血清复合缺氧条件下通过促使p38MAPK活化导致心肌细胞凋亡增多;阻断p38MAPK信号转导通路可减轻严重烧伤早期心肌细胞的损伤.