白血病骨髓基质细胞黏附培养对Jurkat细胞IAP家族主要成员表达的影响

目的:观察白血病骨髓基质细胞黏附培养对Jurkat细胞化疗敏感性及IAP家族主要成员表达的影响。方法:Jurkat细胞与60Co照射的基质细胞层黏附培养构建共培养模型,扫描电镜观察,0.5μmol/L DNR作用24h后FITC-Annexin V/PI标记流式细胞仪定量Jurkat细胞的凋亡率。Western blot检测黏附培养4、24及48h时Jurkat细胞总蛋白中XIAP和survivin的表达变化,流式细胞仪检测Jurkat细胞周期分布。结果:白血病基质细胞黏附培养组、正常基质细胞黏附培养组Jurkat细胞凋亡率分别为(6.05±0.54)%、(8.48±0.86)%,与悬浮对照组(25.74±6.15)%比较差异均有显著性(P<0.01),且白血病基质细胞黏附培养组与正常基质细胞黏附培养组间差异也有显著性(P<0.05)。Western blot检测结果示,与白血病基质细胞黏附培养4h即观察到XIAP表达的上调,24h和48h尤为明显,但survivin表达的变化呈现相反趋势。与Western blot结果相一致,Jurkat细胞周期阻滞于G0-G1期。结论:白血病骨髓基质细胞黏附培养能介导Jurkat细胞耐药,其机制可能与Jurkat细胞XIAP表达上调和survivin表达下调有关。     

白血病原代骨髓基质细胞对柔红霉素作用下Jurkat细胞基因表达的影响

目的研究白血病患者骨髓基质细胞（BMSCs）抑制柔红霉素（DNR）诱导Jurkat细胞凋亡过程中Jurkat细胞相关基因表达的变化,并进一步分析差异表达基因在BMSCs对Jurkat细胞保护过程中的意义.方法采用Percoll体外分离初治急性白血病患者骨髓单个核细胞,贴壁培养BMSCs;采用抑制性消减杂交技术等分子生物学方法建立白血病BMSCs保护的Jurkat细胞差异表达基因的cDNA文库;并对差异表达的基因进行初步鉴定与分析.结果成功地建立了白血病BMSCs保护的Jurkat细胞上调和下调差异表达基因的cDNA文库;初步筛选克隆到30个上调差异表达基因和22个下调差异表达基因cDNA片段;其功能主要与细胞周期调控、细胞凋亡、细胞能量代谢相关.结论白血病患者BMSCs能诱导Jurkat细胞基因发生差异表达,为探讨白血病患者BMSCs保护白血病细胞逃避化疗药物杀伤的分子机制进行了前期研究.     

Co^60γ辐照对裸鼠血像及造血微环境功能影响的动态观察

目的探索建立供移植实验使用的裸鼠造血微环境损伤动物模型。方法分别用3．5、5．0、6．5、8．0Gy4个Co^60γ辐照裸鼠，检测经过辐照后各组裸鼠1、3、5、7、14、21d血像变化，检测辐照后1、7、14、21d裸鼠骨髓基质CFU-F形成情况并用流式细胞仪检测辐照后1、7、14、21d骨髓基质细胞血管内皮细胞黏附分子-1（VCAM-1）的表达。结果8．0Gy辐照剂量裸鼠死亡率100％；3．5、5．0、6．5Gy辐照剂量组裸鼠的造血损伤均能在辐照后21d之内自我恢复；6．5Gy组骨髓CFU—F于移植7（22．00±6．00）、14d（33．00±6．00）后较3．5、5．0Gy组均显著降低（P〈0．01），VCAM-1表达于7（21．67±7．45）、14（22．33±9．07）、21d（23．33±4．51）较对照组显著降低（P〈0．01），较3．5Gy组差异有统计学意义（P〈0.05），21d（23．33±4．51）较5．0Gy组（34．00±4．36）差异有统计学意义（P〈0．05）。结论6．5Gy是裸鼠造血微环境损伤实验动物模型的适宜辐照剂量。     

大剂量化疗、自体外周血造血干细胞移植、长间歇维持化疗序贯治疗成人急性淋巴细胞白血病疗效观察

急性淋巴细胞白血病（ALL）是一种常见的血液系统恶性肿瘤，其治疗包括常规化疗和造血干细胞移植（HSCT）。常规化疗对成人ALL效果较差，据报道其长期生存率只有20％～30％，而且要进行长期维持治疗。2001年3月至2003年8月，我们对我院14例初次诱导治疗缓解的成人ALL患者进行连续3个周期大剂量甲氨蝶呤（Hi—MTX）治疗，之后行自体外周血造血干细胞移植（auto—PBSCT），移植后长间歇常规剂量化疗维持2年，取得了较好的治疗效果。     

自体外周血干细胞移植治疗血液肿瘤206例观察

目的:观察自体外周血干细胞移植(APBSCT)治疗血液恶性肿瘤临床疗效。方法:自2001年3月—2006年12月对206例血液肿瘤患者施行APBSCT,其中急性淋巴细胞白血病(ALL)40例,急性髓细胞白血病(AML)29例,非何杰金淋巴瘤(NHL)95例,何杰金淋巴瘤(HD)26例,多发性骨髓瘤(MM)16例,观察临床疗效和并发症。结果:除1例ALL外,205例患者移植后造血功能均快速重建。急性淋巴细胞白血病首次完全缓解(ALL-CR1)25例,其中无病存活17例,带病存活2例,死亡6例,急性淋巴细胞白血病再次完全缓解(ALL-CR2)15例,其中无病存活3例,带病存活3例,死亡9例;急性髓细胞白血病首次完全缓解(AML-CR1)17,其中无病存活10例,带病存活2例,死亡5例,急性髓细胞白血病再次完全缓解(AML-CR2)12例,其中无病存活5例,带病存活1例,死亡6例;非何杰金淋巴瘤首次缓解(NHL-CR1)57例,其中无病存活42例,带病存活6例,死亡9例,非何杰金淋巴瘤再次缓解(NHL-CR2)28例,其中无病存活18例,带病存活4例,死亡6例,非何杰金淋巴瘤未缓解(NHL-NR)10例,其中无病存活2例,带病存活3例,死亡5例;何杰金淋巴瘤首次缓解(HD-CR1)8例,其中无病存活8例;何杰金淋巴瘤部分缓解(HD-PR)13例,其中无病存活11例,带病存活2例;RE5例,其中无病存活3例,带病存活1例,死亡1例;MM16例,其中无病存活5例,带病存活4例,死亡7例。结论:APBSCT是一种治疗血液肿瘤安全有效的方法。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对骨髓基质细胞的毒性作用

背景:已证实肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)能选择性诱导白血病细胞凋亡,并且不影响正常造血干/祖细胞的功能。但TRAIL对作为造血微环境核心的骨髓基质细胞的毒性作用如何,据作者查新检索目前尚未见系统报道。目的:通过观察TRAIL对骨髓基质细胞的凋亡诱导效应及其造血支持功能的影响,继而评价TRAIL对骨髓基质细胞的毒性作用。设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2006-03/10在解放军沈阳军区总医院中心实验室完成。材料:血常规、骨髓涂片细胞检查正常的骨髓标本11份,取自解放军沈阳军区总医院血液科。化疗药物柔红霉素为浙江海正药业股份有限公司产品,国药准字H33020925。方法:Percoll 贴壁法体外分离培养骨髓基质细胞,达80%融合时胰蛋白酶消化扩增,取处于对数生长期的细胞,分为4组,空白对照组不进行任何干预,柔红霉素组加入0.5μmol/L柔红霉素作用24h,TRAIL组加入200μg/L TRAIL作用18h,联合组加入0.5μmoL/L柔红霉素作用6h后再以200μg/L TRAIL作用18h。取第2代骨髓基质细胞,60Co射线照射消除内源性造血集落,接种后去除悬浮细胞,TRAIL组以200μg/L TRAIL作用基质细胞层18h,按1×105/孔将骨髓单个核细胞接种于基质细胞层,扩增5d后加入甲基纤维素培养体系,于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件下培养10d。主要观察指标:荧光显微镜观察诱骗受体在骨髓基质细胞的表达及定位,流式细胞仪检测柔红霉素对骨髓基质细胞诱骗受体表达的影响,AnnexinⅤ/PI标记TRAIL对骨髓基质细胞的凋亡诱导作用及对其造血支持功能的影响。结果:诱骗受体DcR1和DcR2在骨髓基质细胞中均有表达,主要定位于胞膜及胞浆。0.5μmol/L柔红霉素作用24h后,基本不影响诱骗受体DcR1和DcR2的表达水平。与空白对照组细胞凋亡率比较,TRAIL组无明显变化(t=0.973,P>0.05);柔红霉素组、联合组均显著升高(t=5.141,P=0.001;t=4.187,P=0.002),此两组间比较差异无显著性意义(t=1.222,P>0.05)。与空白对照组比较,TRAIL组骨髓单个核细胞数、粒-巨噬集落形成单位均无明显变化(t=1.313,P>0.05;t=1.172,P>0.05)结论:TRAIL的诱骗受体DcR1及DcR2在骨髓基质细胞均有表达,使骨髓基质细胞免于TRAIL的凋亡诱导效应,且TRAIL不增强柔红霉素对骨髓基质细胞的细胞毒性作用。     

SDF-1 cDNA转染人骨髓间充质干细胞的实验研究

本研究旨在探讨基质细胞衍生因子-1（SDF-1）cDNA瞬时转染人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）前后hBMSCs中SDF-1mRNA表达的情况。在分离、培养、鉴定人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）和构建SDF-1-pIRES2-EGFP真核表达载体的基础上,通过脂质体介导法将SDF-1真核表达质粒转染至hBMSCs,观测绿色荧光蛋白的表达并用RT-PCR方法检测瞬时转染效率。结果发现：SDF-1-pIRES2-EGFP瞬时转染后hBMSCs的SDF-1mRNA表达增高约20%左右。结论：阳离子脂质体可以将SDF-1cDNA真核表达质粒瞬时转染入hBMSCs,但转染效率低下,不能获得足够数量的稳定转染细胞供后续实验,因此需对转染方法作进一步的探讨。     

Ad-vcam-1-gfp重组腺病毒转染人脐血源基质细胞的实验研究

本研究探讨血管细胞黏附分子（vcam-1）修饰的人脐血源基质细胞（human umbilical cord blood derived strom cells，CBDSC）在造血调控中的作用。采用DNA重组技术，将目的基因vcam-1克隆至含有报告基因gfp的穿梭质粒；在BJ5183细胞中与pAdeasy—1质粒进行同源重组，产生重组腺病毒载体转染人脐血源基质细胞并进行鉴定。结果表明：vcam-1基因与pAdTrack—CMV载体成功连接，经NotⅠ／XhoⅠ双酶切后电泳可见2个大小约为9kb和2kb左右条带，经PCR法扩增后电泳可见1个600bp左右条带，证明pAdTrack—CMV—vcam-1重组质粒构建成功。pAdTrack—CMV—vcam-1质粒与pAdeasy—1质粒同源重组后，产物经PACⅠ酶切后电泳可观察到2个大小约为31kb、4kb左右条带，与预期结果相符。腺病毒载体转染人脐血源基质细胞后免疫化学、RT—PCR、荧光显微镜等方法均检测到目的基因vcam-1的表达。结论：构建ad—vcam-1-gfP重组腺病毒载体可成功转染人脐血源基质细胞并使其vcam-1表达增高。     

急性淋巴细胞白血病自体外周血造血干细胞移植术后髓外复发伴左侧臂丛神经损伤1例

患者,男,25岁。于2005年1月无明显诱因出现咳嗽、无咳血,吞咽时感胸痛,同年3月患者出现呼吸困难,胸闷,心慌,左侧胸部胀痛,院外骨髓穿刺检查诊断为“急性淋巴细胞白血病”,予抽胸水后感左侧胸部胀痛症状缓解,但仍有呼吸困难,咳嗽,咳白色泡沫痰,遂到我科治疗。骨髓细胞形态学提示     

骨髓基质细胞-白血病细胞共培养模型中主要微环境成分对化疗敏感性的影响

背景：目前多数耐药机制研究均采用单细胞培养模型。目的：构建骨髓基质细胞．白血病共培养模型，探讨该模型中纤维连接蛋白、基质细胞膜蛋白及基质细胞因子等白血病微环境成分对白血病细胞化疗敏感性的影响。设计、时间及地点：开放性实验，于2006—03／10在解放军沈阳军区总医院中心实验室完成。材料：血常规、骨髓涂片细胞检查正常的骨髓标本11份，其中男6例，女5例，中位年龄34岁；经临床和血常规、骨髓涂片细胞检查确诊的未经治疗的急性淋巴细胞白血病患者骨髓标本13份，其中男7例，女6例，中位年龄28岁；每份骨髓1．0～2．0mL，50U／mL肝素抗凝。方法：①常规分离、培养骨髓基质细胞，Jurkat细胞与^60Co照射的基质细胞层黏附培养48h，收集上清，扫描电镜观。②2％戊二醛固定灭活基质细胞层，去除其细胞因子分泌功能，保留基质细胞膜蛋白。③通过MTT法测定柔红霉素的IC50、FITC-Annexin V／PI标记流式细胞仪定量细胞凋亡率。主要观察指标：采用倒置显微镜、扫描电镜及荧光显微镜对骨髓基质细胞、骨髓基质细胞-Jurkat细胞共培养模型及凋亡的Jurkat细胞进行形态学观察；通过流式细胞仪定量细胞凋亡率；MTT法测定IC50评价化疗药物敏感性。结果：①成功构建骨髓基质细胞-Jurkat共培养模型，扫描电镜发现Jurkat细胞通过伪足黏附于基质细胞层。②纤维连接蛋白黏附、灭活基质细胞黏附培养、活性基质细胞黏附及共培养上清均明显黏附抑制了柔红霉素对Jurkat细胞的细胞毒作用。③纤维连接蛋白黏附、灭活基质细胞黏附培养、活性基质细胞黏附及共培养上清均明显黏附抑制了柔红霉素对Jurkat的凋亡诱导效应。结论：骨髓基质细胞-Jurkat细胞共培养模型中微环境成分骨髓基质细胞膜蛋白、纤维连接蛋白和基质细胞因子均参与了Jurkat细胞耐药的形成。