精氨酸酶Ⅰ在HCV转染肝癌细胞增殖中的作用

目的:研究丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)基因组转染的肝癌细胞中精氨酸酶Ⅰ的表达及其意义,探究其在HCV-肝细胞肝癌(HCC)发病中的作用.方法:以转染HCV基因组的人肝癌细胞系(Huh7)为研究对象,采用蛋白印迹技术研究HCV基因组转染对细胞内精氨酸酶Ⅰ表达的影响;运用小干扰RNA(siRNA)技术抑制细胞精氨酸酶Ⅰ表达,并探讨其对细胞生长的影响及作用机制.结果:精氨酸酶Ⅰ在HCV阳性肝癌细胞系(Huh7-HCV)中的表达上调,且与对照细胞相比,Huh7-HCV细胞的精氨酸酶Ⅰ含量升高4.3倍.运用siRNA抑制细胞精氨酸酶Ⅰ表达,可明显抑制细胞生长并导致其死亡,且可使细胞周期发生明显改变.结论:精氨酸酶Ⅰ在HCV阳性肝细胞Huh7中表达上调,可能对促进Huh7-HCV细胞生长具重要意义.     

siRNA靶向干扰GPC3基因慢病毒载体的构建及其对肝癌Huh-7细胞凋亡的影响

目的构建GPC3基因短发夹干扰RNA(shRNA)慢病毒载体,观察GPC3基因对人肝癌细胞系Huh-7凋亡的影响,探讨GPC3基因影响肝癌细胞生长的机制,为肝癌的基因治疗提供理论基础。方法采用RNA干扰技术转染肝癌细胞系Huh-7,荧光定量PCR检测GPC3基因在多种肝癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向GPC3基因的小干扰RNA序列PGC-shRNA-GPC3,以脂质体(lipofectamineTM2000)为载体转染人肝癌细胞系,筛选并建立稳定表达siRNA的细胞株。采用RT-PCR及Western blot检测GPC3 siRNA转染后mRNA表达情况,验证siRNA的干扰效率。流式细胞仪检测阴性对照组、未转染组和转染组细胞凋亡的情况。结果在肝癌细胞株Huh-7中,GPC3基因显示高表达。测序验证PGC-shRNA-GPC3重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入肝癌细胞株Huh-7后能明显抑制GPC3 mRNA表达水平;同时,流式细胞仪检测发现,GPC3表达下调后,诱导Huh7细胞的凋亡。结论靶向GPC3的siRNA能有效抑制GPC3的表达,并能促进肝癌Huh7细胞凋亡。     

MiR-132靶向YAP抑制肝癌Huh7细胞的生长

目的研究miR-132靶向YAP后对肝癌Huh7细胞生长的抑制,为临床治疗肝癌的方法提供新的理论依据。方法实验分为三组:未转染miR-132的Huh7细胞组(control组),阴性对照组(miR NC组)以及转染miR-132的Huh7细胞组(miR-132组),通过RT-PCR检测YAP mRNA表达情况;通过流式细胞仪检测细胞凋亡改变;通过Edu检测细胞增殖能力;通过Transwell法检测细胞侵袭能力。结果 RT-PCR检测YAP mRNA发现miR-132可明显抑制YAP基因在肝癌细胞株Huh7中的表达,control组、miR NC组和miR-132组YAP mRNA的相对表达量为1.000 0±0.024 1、0.942 6±0.024 8和0.257 3±0.045 8(P<0.05);流式细胞仪检测发现转染miR-132后能明显促进肝癌Huh7细胞的凋亡,control组、miR NC组和miR-132组Huh7细胞总凋亡为4.03±0.35、4.53±0.26和13.62±0.49(P<0.05);EdU检测发现转染miR-132后肝癌Huh7细胞增殖能力明显受抑制,control组、miR NC组和miR-132组分别为(65.12±1.93)%、(64.02±0.87)%和(42.00±1.26)%(P<0.05);traswell检测结果发现转染miR-132后肝癌Huh7细胞侵袭能力明显受抑制,control组、miR NC组和miR-132组分别为3.35±0.13、0.72±0.06和0.48±0.03(P<0.05)。结论 miR-132具有抑制肝癌细胞生长的作用,并有可能通过靶向YAP而下调其表达起作用。     

乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药株(RT A181T)感染性克隆的构建及在Huh7细胞中的表达

目的利用重叠延伸聚合酶链反应(SOE-PCR)快速构建乙型肝炎病毒(HBV)阿德福韦酯耐药株(RT A181T)感染性克隆,观察重组质粒在Huh7细胞中的表达,建立HBV阿德福韦酯耐药株(RT A181T)的体外研究细胞模型。方法设计保守引物,从慢性乙型肝炎阿德福韦酯耐药患者血清中扩增全长HBV基因组,利用SOE-PCR技术构建1.3倍基因组长度的感染性克隆质粒pHBV1.3,转染肝癌细胞系Huh7,采Western Blot、Real-time PCR检测感染性克隆复制以及表达情况,同时用抗病毒药物拉米夫定以及阿德福韦酯验证对感染性克隆复制及表达的抑制情况。结果成功构建了HBV阿德福韦酯耐药株感染性克隆质粒pHBV1.3(RT A181T),该质粒在Huh7细胞系中能有效复制、转录和表达。拉米夫定能有效抑制该感染性克隆的复制和表达,阿德福韦酯不能抑制该感染性克隆的复制和表达。结论构建的HBV阿德福韦酯耐药株感染性克隆质粒pHBV1.3(RT A181T)在体外能高效复制及表达蛋白,其转染细胞可用于HBV复制机制及抗病毒研究。     

过表达FOXB2对肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响

目的 探讨叉头框蛋白B2（FOXB2）对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法 采用定量PCR检测正常肝细胞LO2细胞和肝癌细胞系Hep3B、Huh7细胞FOXB2 mRNA的表达,构建过表达FOXB2的细胞模型,逆转录实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测过表达效率,细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测FOXB2对Huh7细胞增殖能力的影响;平板克隆实验检测FOXB2对Huh7细胞克隆形成能力的影响;Transwell实验检测FOXB2对Huh7细胞迁移和侵袭能力的影响。结果 FOXB2在肝癌细胞系Huh7和Hep3B细胞中的表达水平低于正常肝细胞LO2（P<0.001）;过表达FOXB2抑制了Huh7细胞的增殖（P=0.005）和克隆形成（P<0.001）;FOXB2过表达肝癌细胞的迁移（P<0.001）和侵袭（P=0.002）能力低于Vector对照细胞。结论 FOXB2在肝癌细胞中低表达,FOXB2过表达抑制了肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。     

MicroRNA-155对3种可经输血传播RNA病毒复制的影响及机制探究

目的了解经血传播的RNA病毒感染细胞后对小分子非编码RNA-155 (miR-155)的诱导作用及miR-155对这类病毒复制的影响。方法在2×10~5/mL肝癌细胞系Huh7.5.1中分别感染3种RNA病毒HCV、DENV和ZIKV,感染复数(MOI)为0.2,感染后48 h,提取胞内RNA,通过荧光定量PCR (qRT-PCR)的方法,检测病毒感染后miR-155的相对表达变化;同时在2×10~5/mL Huh7.5.1细胞中转染10 pmol的miR-155模拟物(miR-155 mimic)使miR-155高表达,转染后12 h分别接种0.2 MOI的3种病毒,感染后48 h提取胞内RNA,通过荧光定量PCR检测3种病毒RNA的复制水平及宿主抗病毒先天免疫相关基因表达水平。结果与未感染病毒的Huh7.5.1细胞相比,HCV、DENV及ZIKV感染Huh7.5.1细胞48 h后,miR-155的相对表达分别升高了132倍、157倍和8倍。与转染阴性对照组相比,miR-155高表达的Huh7.5.1细胞中,HCV、ZIKV和DENV的复制分别降低了48%、54%和70%;miR-155高表达的Huh7.5.1细胞中,IFNβ及一些干扰素刺激基因的表达明显升高。结论 HCV、DENV和ZIKV感染Huh7.5.1细胞后,显著诱导细胞中miR-155的表达;miR-155在细胞中高表达后,通过调节宿主细胞中Ⅰ型干扰素及一些干扰素刺激基因的表达来抑制HCV、DENV和ZIKV的复制。     

抑制促血管生成素基因表达对肝癌血管生成的影响

目的:观察抑制促血管生成素-2(Ang-2)基因表达后时人肝癌细胞系SMMc7721体外成瘤性和血管生成的影响,阐明Ang-2基因在肝癌血管生成和转移过程中的作用,为研究抗血管生成疗法奠定基础.方法:选择携带Ang-2基因的肝癌细胞系SMMC7721,通过脂质体介导的基因转染方法将特异干扰性小RNA(siRNA)基因导入SMMC7721肝癌细胞系,并用G418筛选稳定表达的细胞克隆,用RT-PCR和免疫荧光法检测是否成功构建了抑制Ang-2基因表达的SMMC7721肝癌细胞系.将63只裸鼠随机分成3组,分别用转染和未转染siRNA基因的携带Ang-2基因SMMC7721肝癌细胞及不携带Ang-2基因SMMC7721肝癌细胞注射于裸鼠皮下产生肿瘤结节,观察肿瘤的生长的速度并对肿瘤组织中的微血管进行检测.结果:用RT-PCR方法从RNA水平以及用免疫荧光法从蛋白质水平均证实新构建的肝癌细胞系成功抑制了Ang-2基因及其蛋白产物的表达.抑制了Ang-2基因后肿瘤生长速度明显减慢(P<0.05),肿瘤组织中血管生成的数量较未转染前明显减少(P<0.05).结论:Ang-2的表达增强了人肝癌细胞系SMMC7721的体外成瘤性并促进了肿瘤组织中的血管生成.抑制Ang-2的表达可以明显减弱这种促进作用.     

钠钙交换器1对肝细胞肝癌增殖与侵袭的影响

目的:探讨钠钙交换器1(NCX1)在肝细胞肝癌(简称肝癌)侵袭和增殖中的作用及分子机制,为肝癌的临床诊治提供新思路。方法:采用荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western印迹法检测不同肝癌细胞系中NCX1的表达情况。构建NCX1干扰慢病毒载体和过表达慢病毒载体,并转染肝癌细胞。采用细胞迁移、侵袭实验观察NCX1对肝癌细胞迁移、侵袭的影响;采用细胞增殖实验观察NCX1对肝癌细胞增殖的影响;ELISA、Western印迹法检测NCX1相关蛋白的表达。结果:高转移潜能肝癌细胞系(MHCC97H、HCCLM3)NCX1表达高于低转移潜能肝癌细胞系(HepG2、Huh7、SMMC-7721),差异有统计学意义(P0.05)。转染NCX1后,肝癌细胞侵袭及增殖能力明显增加(P0.05);细胞因子(TGF-β_1、IL-6、TNF-α)分泌明显增多(P0.05);肝癌上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达明显升高(P0.05)。结论:NCX1体外可能通过升高肝癌细胞EMT相关蛋白表达促进肝癌生长、侵袭及转移,是潜在的肝癌诊治靶标。     

丙型肝炎病毒感染影响载脂蛋白B基因甲基化水平

目的 探讨丙型肝炎病毒（HCV）感染与载脂蛋白B（ApoB）DNA甲基化的关系.方法 采用生化分析仪Olympus 5400检测HCV患者和健康对照者血清ApoB的水平,RT-PCR检测人肝癌细胞系Huh7和含JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1细胞系中ApoB mRNA的水平,比较两种细胞系DNA甲基化酶活性的差别,分析加入不同剂量的甲基化酶抑制剂后ApoB mRNA的水平变化.结果 HCV患者ApoB的水平为0.67&#177;0.14 μmol/L,健康对照组为0.98&#177;0.26 μmol/L,ApoB mRNA在Huh7.5.1细胞中的表达水平低于Huh7细胞,且HCV感染可以增加细胞核内DNA甲基化酶的活性,甲基化酶抑制剂能剂量依赖地促进ApoB mRNA表达.结论 HCV通过增加DNA甲基化酶活性来抑制ApoB的表达.     

miR-1225-5p靶向调控S100A9抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究

目的探讨miR-1225-5p对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及作用机制。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测肝癌细胞系Huh7、MHCC97H和MHCCLM3及正常肝细胞系THLE-2中miR-1225-5p和S100钙结合蛋白A9(S100A9)mRNA表达水平。采用Western blot试验检测S100A9的表达水平。以Huh7细胞作为研究对象,分别转染miR-1225-5p模拟物(mimics)、S100A9的小干扰RNA至Huh7细胞,四甲基噻唑蓝染色法检测miR-1225-5p过表达或下调S100A9表达对Huh7细胞增殖的影响,Transwell检测miR-1225-5p过表达或下调S100A9表达对Huh7细胞迁移和侵袭的影响,Western blot试验检测miR-1225-5p过表达或下调S100A9表达对Huh7细胞细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21、p27、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9、MMP-14蛋白表达的影响。生物信息学软件预测S100A9的3′非翻译区中含有与miR-1225-5p互补的核苷酸序列,双荧光素酶报告基因试验验证miR-1225-5p与S100A9的靶向关系。结果与正常肝细胞THLE-2比较,肝癌细胞系Huh7、MHCC97H和MHCCLM3中miR-1225-5p表达水平均降低,差异均有统计学意义(P0.05),S100A9mRNA和S100A9表达水平均升高,差异均有统计学意义(P0.05)。过表达miR-1225-5p或下调S100A9表达均可抑制Huh7细胞增殖、迁移和侵袭,以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表达(P0.05),促进p21和p27蛋白的表达(P0.05)。miR-1225-5p在Huh7细胞中负调控S100A9表达,过表达S100A9逆转了miR-1225-5p过表达对Huh7细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。结论 miR-1225-5p过表达可能通过下调S100A9的表达抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。     

siRNA特异性抑制K562细胞Livin基因表达及其诱导凋亡作用

本研究探讨小分子RNA干扰技术抑制livin基因表达对白血病细胞系K562细胞凋亡的影响。设计合成livin特异性小干扰RNA(siRNA),核转染K562细胞,培养转染后的K562细胞,用RT-PCR检测livin mRNA的表达,Western blot检测Livin蛋白的表达。以未转染细胞作对照,同时转染带有增强型绿色荧光蛋白的载体作为阳性对照,用流式细胞术检测其细胞绿色荧光以确定转染效率。用膜联蛋白Ⅴ及碘化丙锭双染法检测细胞凋亡率。结果表明,电穿孔的转染效率可达50%。siRNA既可以抑制livin mRNA表达,也可以抑制livin蛋白表达。特异性siRNA转染细胞后48 h细胞凋亡率为(27.41±2.30)%,与对照组(9.63±0.89%)比较明显提高(P<0.05)。结论:SiRNA可以抑制livin基因的表达,并能抑制livin基因的抗凋亡作用。     

小片段干扰RNA抑制人肝癌细胞株中YAP基因表达的研究

目的:研究用小片段干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制肝癌细胞株中YAP(yes-associated protein)表达后肝癌细胞株对阿霉素(adriamycin,ADM)的敏感性变化。方法:设计YAP基因的siRNA序列,用脂质体LipofectamineTM2000将siRNA转染至4株肝癌细胞株PLC/PRF/5、Huh-7、MHCC97H、MHCC97L中,在荧光显微镜下观察并采用蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测肝癌细胞株中YAP的表达。将细胞以不同浓度的ADM处理后,采用四甲基偶氮唑蓝(methyl thialzolyl tetrazolium,MTT)比色法检测细胞的存活率。结果:成功构建针对YAP的siRNA表达载体。Western blotting结果显示,肝癌细胞株经特异性siRNA转染后,YAP蛋白的表达受到抑制,表明RNA干扰(RNA interference,RNAi)能特异、有效地抑制肝癌细胞株中YAP的表达。MTT结果显示,转染YAP siRNA后肝癌细胞株的存活率受到明显抑制。结论:siRNA抑制肝癌细胞株中YAP的表达可增强肝癌细胞株对ADM的敏感性。     

LRRC1通过DLG1/YAP信号通路促进肝癌细胞增殖的研究

目的 研究富含亮氨酸的重复序列蛋白1(LRRC1)通过巨盘状蛋白1(DLG1)/Yes相关蛋白(YAP)信号通路调节肝癌细胞增殖的机制。方法 在原发性肝细胞癌患者的癌灶组织及配对癌旁组织中,检测LRRC1的表达水平。使用小干扰RNA(siRNA)抑制HepG2及Huh7中LRRC1的表达后,检测细胞增殖能力及YAP、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)表达水平。通过共聚焦显微镜,定位HepG2细胞中LRRC1与DLG1分布。结果 肝细胞癌患者癌灶中LRRC1表达量较癌旁组织升高。siRNA 抑制HepG2及Huh7细胞中LRRC1基因表达后,细胞增殖能力受到抑制,YAP、Cyclin D1及CDK4表达水平下降。镜下发现HepG2细胞中LRRC1与DLG1均主要分布于细胞膜内侧面,两者分布位置高度重叠。结论 LRRC1通过DLG1/YAP信号通路调控细胞周期,促进肝癌细胞增殖。     

RNA干扰抑制JMJD3基因表达对肝癌细胞生长,增殖和侵袭的影响

目的研究小干扰RNA(siRNA)抑制含Jumonji结构域蛋白3(JMJD3)基因对肝癌细胞QGY-7703和HepG2的生长、增殖和侵袭能力的影响。方法利用RNA干扰技术沉默JMJD3(siR-JMJD3),以非特异性序列(pSilencer 2.1)转染肝癌细胞QGY-7703细胞和HepG2细胞作为阴性对照,采用四甲基噻唑蓝(MTT)法、集落形成、Transwell侵袭实验来检测肝癌细胞生长、增殖和侵袭能力的变化。结果 Western Blot检测结果显示,转染siR-JMJD3质粒的试验组成功抑制肝癌细胞中JMJD3的蛋白表达水平。MTT结果显示转入siR-JMJD3后,QGY-7703和HepG2细胞的生长活性与对照组相比分别降低了约25%和17%。集落形成结果显示2种细胞系的集落形成数分别降低了约31%和25%。Transwell侵袭实验结果显示穿膜细胞数分别下降了约44%和47%。结论应用siRNA技术能有效抑制JMJD3基因的表达,同时有效抑制肝癌细胞QGY-7703和HepG2体外生长、增殖和侵袭,为肝癌的生物学治疗提供了新思路。     

启动子低甲基化介导NOL9过表达促进肝癌细胞增殖

目的 探讨核仁蛋白9(NOL9)在肝癌中的表达和对肝癌细胞增殖的影响，进一步阐明NOL9在肝癌中表达上调的分子机制。方法 选择7例肝癌患者的手术标本（癌组织和癌旁组织），通过蛋白免疫印迹法和反转录-实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测NOL9在癌组织和癌旁组织中的表达水平；分别转染小干扰RNA(si-RNA)到肝癌Huh7和HCCLM3细胞，采用RT-qPCR、蛋白免疫印迹法、细胞集落形成实验、细胞计数试剂盒-8(CCK-8)分析差异；利用TCGA数据库肝癌数据评估NOL9 mRNA表达水平和启动子的甲基化水平，同时评估NOL9和DNA甲基异位擦除蛋白家族（TET1、TET2和TET3）转录水平的相关性；采用RT-qPCR和蛋白免疫印迹法检测DNA去甲基化试剂5-Aza-Dc处理后Huh7和HCCLM3细胞中NOL9表达水平的变化；5-Aza-Dc预处理后再转染si-RNA，采用细胞集落形成实验和CCK-8分析细胞增殖的差异。结果 NOL9在肝癌组织中表达上调；敲低NOL9能抑制肝癌Huh7和HCCLM3细胞增殖以及细胞集落形成（P均<0.01）；肝癌中NOL9启动子甲基化与...     

姜黄素对肝癌细胞耐药基因表达的影响

目的:研究姜黄素对人肝癌细胞Huh7和Hep3B中耐药基因(MDR1、MRP1和DRG2)表达的影响,探讨姜黄素诱导肝癌细胞凋亡的分子作用机制.方法:以DAPI核染色法研究姜黄素对不同肝癌细胞的凋亡诱导作用.利用JC-1染料进行线粒体染色研究姜黄素对Huh7和Hep3B细胞线粒体膜电位的影响.通过半定量PCR(RT-PCR)检测姜黄素对耐药基因表达的影响.结果:姜黄素可以显著抑制Huh7细胞中耐药基因MRP1的表达.结论:姜黄素可能通过抑制耐药基因MRP1的表达诱导肝癌细胞Huh7凋亡.     

应用RNAi技术沉默survivin基因对肝癌细胞系BEL-7404生长的影响

目的为研究生存素survivin基因的功能及肝细胞癌（HCC）的基因治疗策略。构建针对survivin基因的siR-NA的表达载体,转染肝癌细胞系BEL-7404后评价其对survivin基因表达的抑制作用。方法依据survivin基因设计siRNA片断,构建pGenesil-1/survivin表达载体,脂质体LipofectamineTM 2000转染BEL-7404细胞。实时定量聚合酶链反应从基因转录水平检测survivin基因的表达率,应用免疫组织化学的方法检测肝癌细胞系BEL-7404中survivin蛋白表达抑制情况。结果本实验已成功构建了针对survivin基因的pGenesil-1/survivin质粒。实时定量PCR检测显示,BEL-7404细胞经特异性siRNA作用后survivin基因的表达受抑制,其Ct值由34.2降低到22.8,免疫组织化学结果显示,pGenesil-1/survivin介导的siRNA能抑制BEL-7404细胞中survivin蛋白的表达。结论构建的siRNA能特异地抑制sur-vivin靶基因在肝癌细胞株BEL-7404中的表达,为肿瘤的生物学治疗提供了新的方法和材料。     

沉默GPC3对肝癌Huh-7细胞增生、迁移和侵袭能力的影响

目的探讨Hippo通路靶向GPC3后对肝癌Huh-7细胞增生、迁移、侵袭能力的影响。方法采用Western blot检测法及RT-PCR分别测量肝癌Huh-7不同对数生长期的肝癌细胞株GPC3蛋白表达水平及GPC3 mRNA水平,并筛选出可有效沉默GPC3基因的siRNA。将肝癌Huh-7细胞株分为实验组、未转染组及对照组,实验组导入GPC3-siRNA-1633转染Huh-7,其余两组不作处理。EdU实验检查三组细胞增殖率,划痕实验测定各组细胞迁移率,Transwell实验测定各组细胞侵袭能力。结果实验组GPC3 mRNA表达量及GPC3蛋白水平显著低于未转染组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组Hippo通路中YAP mRNA表达量显著低于未转染组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。转染48 h后,实验组细胞增生率、迁移率及侵袭率显著低于未转染组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 GPC3可促进肝癌Huh-7细胞增殖、侵袭及转移,从而促进肝癌细胞生长。CPG3可通过上调Hippo通路中YAP表达水平从而促进肝癌细胞增生。通过沉默GPC3 mRNA后可有效抑制肝癌Huh-7细胞生长。     

靶向封闭再生基因Ⅰα对胰腺癌细胞SW1990增殖行为的影响

目的 观察靶向封闭再生基因Ⅰα(REG Ⅰα)对胰腺癌细胞株SW1990增殖行为的影响.方法 设计并体外合成靶向REG Ⅰα的小干扰RNA(siRNA),将其转染到SW1990细胞中,半定量RT-PCR、蛋白质印迹法检测转染前后REG Ⅰα基因表达的变化.采用MTT法检测转染前后细胞增殖能力的改变,流式细胞技术检测细胞周期的变化.结果 REG Ⅰα siRNA转染胰腺癌细胞SW1990后,明显抑制REG Ⅰα基因表达,以200 nmol/L REG Ⅰα siRNA对REG Ⅰα基因表达抑制效果最佳.以该浓度的REG Ⅰα siRNA转染SW1990细胞后,SW1990细胞在siRNA转染后48 hREG Ⅰα mRNA表达抑制率最高,达82%;干扰后SW1990中REG Ⅰα蛋白表达也明显下调.抑制SW1990细胞中REG Ⅰα的表达后,SW1990细胞的增殖能力明显下降,与阴性对照组(转染无关序列的siRNA)及空白对照组(无任何处理)相比,差异有统计学意义(P<0.05).转染细胞的周期分布有明显改变:G1期细胞增加,S期细胞减少.结论 靶向封闭REG Ⅰα基因能明显抑制胰腺癌细胞SW1990在体外的增殖能力,为探索胰腺癌基因治疗提供新的策略.     

miR-499在肝癌发生和发展中的作用机制研究

目的以肝癌细胞系Huh7细胞为模型,研究miR-499在肝癌发生和发展中的作用机制。方法通过TCGA和GEO数据库分析miR-499在肝癌患者及健康人中的表达差异,并通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测肝癌组织及正常癌旁组织中miR-499的表达差异。通过临床病例分析miR-499与肝癌患者临床指标的关系。采用CCK-8试验、集落形成试验检测miR-499对Huh7细胞活性及集落形成的影响。采用流式细胞术检测miR-499对Huh7细胞周期及相对凋亡率的影响。用TargetScan7.1、MicroRNA.org、MiRDB等数据库预测miR-499的下游靶基因。通过RT-qPCR及Western blot试验证明miR-499对RAB5C mRNA及蛋白水平的影响。结果TCGA和GEO数据库数据显示,miR-499在肝癌患者中呈低表达。RT-qPCR结果表明,miR-499在肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织。临床数据整理表格显示,肝癌患者中miR-499高表达的患者普遍肿瘤体积较小、TNM分期较低、淋巴结转移能力较弱且分化良好。miR-499 mimics转染Huh7细胞后,通过CCK8试验和集落形成试验发现,miR-499抑制Huh7细胞增殖及集落形成能力。流式细胞术细胞周期与凋亡试验表明,miR-499抑制Huh7细胞的周期进程,并且促进Huh7细胞的凋亡能力。RT-qPCR及Western blot试验证明,RAB5C确为miR-499的靶基因。结论miR-499通过直接靶定并下调RAB5C的表达,从而抑制肝癌的发生和发展。