生长因子可促进自体骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死

背景：生长因子是干细胞强有力的动员剂,可以增加注射细胞的黏附力和增殖力,诱导干细胞向梗死区迁移、增殖分化,参与心肌修复。 目的：观察肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子的联合应用在骨髓间充质干细胞自体移植治疗心肌梗死中的作用。 方法：分离培养兔骨髓间充质干细胞,原代培养后采用红光荧光染料 CM-Dil 标记。结扎冠脉前降支制作兔急性心肌梗死模型,然后随机均分为对照组、骨髓间充质干细胞组、肝细胞生长因子＋胰岛素样生长因子组和肝细胞生长因子＋胰岛素样生长因子＋骨髓间充质干细胞组。于心肌梗死区心肌内分4点共注射不同干预试剂。Masson三色法染色检测存活心肌;免疫荧光检测骨髓间充质干细胞分化;心脏超声评价心功能。 结果与结论：建模后4周,肝细胞生长因子＋胰岛素样生长因子＋骨髓间充质干细胞组 CM-Dil/cTNT＋细胞数量明显多于骨髓间充质干细胞组,其存活心肌最多,左室射血分数改善最明显,左室舒张末径最小。肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子联合应用促进自体移植的骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,增加存活心肌数量,改善心功能,抑制心室重构,可能成为心肌梗死后细胞治疗的有效方法。     

体外心肌梗死微环境下大鼠骨髓间充质干细胞向内皮样细胞的分化

背景：间充质干细胞来源于中胚层,具有多向分化的能力。有研究显示骨髓间充质干细胞有向内皮细胞分化的能力,从而有助于心肌梗死后心脏新生血管的形成和心肌修复。目的：观察骨髓间充质干细胞体外成内皮样细胞分化的特点,以及体外模拟心肌梗死微环境对骨髓间充质干细胞向内皮样细胞分化的影响。方法：骨髓取自 SD 大鼠股骨和胫骨,骨髓分离培养骨髓间充质干细胞,体外扩增,对其形态学、增殖能力及多向分化能力进行鉴定;建立大鼠心肌梗死模型,制备 8 h、3 d、1 周、2 周、4 周梗死后不同时间点心肌组织的匀浆,分别加入到由血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子β、胰岛素样生长因子 1 组成的内皮细胞诱导体系中,共同诱导 2 周后,观察不同时间的心肌组织匀浆对骨髓间充质干细胞增殖和成内皮分化的影响,检测 vWF 特异性抗原及表达的阳性率。结果与结论：通过对培养细胞的形态学及功能鉴定,证明其为骨髓间充质干细胞,并具有成骨、成脂肪细胞、成内皮样细胞分化的能力。加入生长因子诱导体系诱导后的细胞部分表达 vWF,梗死心肌匀浆与生长因子共同作用,能促进骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化,vWF 阳性率提高（P 〈 0.05）。RT-PCR 显示加入梗死 1 周心肌组织匀浆诱导的骨髓间充质干细胞其 vWF 阳性表达率最高。提示骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化能力的有别于造血干细胞的另一种骨髓干细胞。骨髓间充质干细胞具有向内皮分化的能力,且加入梗死心肌组织匀浆的诱导体系在体外可促进骨髓间充质干细胞向内皮细胞的分化。应用骨髓间充质干细胞治疗的最佳时机在 1 周为宜。     

人胎盘间充质干细胞生物学特性和抗凋亡细胞因子的分泌

背景：由于骨髓源性间充质干细胞的提取造成患者的二次损伤,也存在病毒、细菌污染的可能,扩增、分化能力不高,为此,实验从胎盘中提取间充质干细胞进行研究,了解其分泌抗凋亡细胞因子的情况,探讨其代替骨髓间充质干细胞的可能性。目的：体外分离培养、扩增人胎盘源性间充质干细胞,研究其基本生物学特性和抗凋亡细胞因子的分泌水平。方法：提取人胎盘间充质干细胞,显微镜下观察细胞形态;采用流式细胞仪测定细胞周期、凋亡情况及表面标记的表达,研究其增殖和生长特性。ELISA检测血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子的分泌水平。结果与结论：在体外培养条件下,人胎盘间充质干细胞为贴壁生长,为成纤维细胞样,核浆比大,细胞增殖活跃,凋亡率低,可分泌能抑制细胞凋亡的细胞因子如血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子。     

山羊骨髓间充质干细胞向纤维软骨分化的形态学改变简

背景：前期初步研究发现,碱性成纤维细胞生长因子可诱导骨髓间充质干细胞向颞下颌关节盘细胞方向分化,且碱性成纤维细胞生长因子10μg/L诱导组合成胶原量明显高于5μg/L诱导组。目的：观察经不同浓度碱性成纤维细胞生长因子诱导后的骨髓间充质干细胞的超微结构变化。方法：原代分离培养山羊骨髓间充质干细胞,选P3,P4细胞,用5,10μg/L碱性成纤维细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞,以未加碱性成纤维细胞生长因子培养的骨髓间充质干细胞做对照。倒置相差显微镜观察细胞生长状况,用第7,14,21天的细胞爬片行蕃红O、天狼猩红和Ⅰ型胶原免疫组织化学染色,并观察第21天细胞的超微结构。结果与结论：经不同浓度碱性成纤维细胞生长因子诱导后,骨髓间充质干细胞可向颞下颌关节盘成纤维细胞样细胞形态分化,10μg/L组细胞更像关节盘成纤维细胞样细胞。提示骨髓间充质干细胞有向颞下颌关节盘细胞方向分化的形态学基础。     

大鼠骨髓间充质干细胞表达心肌基因表型的时间依赖效应

背景:前期实验已经证实30%心肌培养上清是诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的最佳浓度.目的:在前期实验基础上,观察30%心肌培养上清条件下诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的时间依赖效应.设计、时间及地点:对比观察,于2007-08/2008-06在徐州市心血管病研究所完成.材料:健康成年SD大鼠,体质鼍180～220 g.方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞和心肌细胞并在体外培养纯化.以1×108L-1的细胞密度种植心肌细胞,培养72 h后收集上清.将骨髓间充质干细胞的DMEM/F12培养基换为含有30%M199心肌细胞培养上清作为实验组,对照组仍将细胞接种在DMEM/F12培养基上继续培养.主要观察指标:30%心肌细胞培养上清诱导7,14,21d后,应用免疫细胞化学技术检测骨髓间充质干细胞中α-平滑肌肌动蛋白、β-肌动蛋白和心肌特异性肌钙蛋白T的表达.结果:30%心肌细胞培养上清诱导骨髓间充质干细胞后,细胞的形态没有改变,但与对照组相比,α-平滑肌肌动蛋白、β肌动蛋白和心肌特异性肌钙蛋白T的表达均呈阳性,其中以第14天的蛋白表达量最高(P＜0.01).结论:30%心肌细胞培养上清诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的最佳诱导时间是14 d.     

骨髓间充质干细胞及细胞因子在股骨头坏死治疗中的应用与展望

背景：单纯应用骨髓间充质干细胞治疗股骨头坏死的效果较差,若同时加入相关细胞因子可更好的发挥作用。目的：综述相关细胞因子诱导间充质干细胞在股骨头坏死治疗方面的应用。方法：由第一作者检索1989/2009PubMed数据库及万方数据库有关治疗股骨头坏死的新进展、骨髓间充质干细胞治疗骨科相关疾病、可促进间充质干细胞向成骨细胞分化的相关细胞因子及其作用机制等文献报道。结果与结论：骨形态发生蛋白、成骨生长肽、血管内皮生长因子、软骨源性形态发生蛋白1、生长转化因子β、胰岛素样生长因子1、血小板衍生生长因子等细胞因子被证实可诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞、软骨细胞,促进骨痂的愈合。因此临床中将骨髓间充质干细胞与细胞因子诱导技术相结合治疗股骨头坏死可最大程度优化治疗效果。     

两种细胞因子联合诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化简

背景：骨髓间充质干细胞可被定向诱导分化为神经样细胞,理论上骨髓间充质干细胞可作为种子细胞应用于周围神经组织工程。目的：用2种细胞因子联合诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞,进一步探讨其在周围神经损伤方面的应用。方法：从Wistar大鼠胫骨和股骨提取骨髓间充质干细胞,采用差速贴壁法进行培养和纯化,联合应用碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子对细胞进行诱导,观察细胞形态变化,并用免疫组织化学方法检测骨髓间充质干细胞中神经元特异性标志物的表达;并研究终止诱导后骨髓间充质干细胞的形态及免疫组织化学方面的变化。 结果与结论：骨髓间充质干细胞经诱导后呈典型神经细胞样改变,有两个或多个突起,突起之间相互连接成网状,可见细胞核及核仁,免疫组化检测神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白及突触素蛋白表达阳性。撤除诱导条件后大部分细胞逐渐恢复原来的成纤维细胞样形态,上述3种蛋白的表达量明显下降。表明应用神经营养因子可诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞,但其形态及组织学变化仅能维持一段较短的时间。     

体外心肌梗死微环境下大鼠骨髓间充质干细胞向内皮样细胞的分化

背景:间充质干细胞来源于中胚层,具有多向分化的能力。有研究显示骨髓间充质干细胞有向内皮细胞分化的能力,从而有助于心肌梗死后心脏新生血管的形成和心肌修复。目的:观察骨髓间充质干细胞体外成内皮样细胞分化的特点,以及体外模拟心肌梗死微环境对骨髓间充质干细胞向内皮样细胞分化的影响。方法:骨髓取自 SD 大鼠股骨和胫骨,骨髓分离培养骨髓间充质干细胞,体外扩增,对其形态学、增殖能力及多向分化能力进行鉴定;建立大鼠心肌梗死模型,制备 8 h、3 d、1 周、2 周、4 周梗死后不同时间点心肌组织的匀浆,分别加入到由血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子β、胰岛素样生长因子 1 组成的内皮细胞诱导体系中,共同诱导 2 周后,观察不同时间的心肌组织匀浆对骨髓间充质干细胞增殖和成内皮分化的影响,检测 vWF 特异性抗原及表达的阳性率。结果与结论:通过对培养细胞的形态学及功能鉴定,证明其为骨髓间充质干细胞,并具有成骨、成脂肪细胞、成内皮样细胞分化的能力。加入生长因子诱导体系诱导后的细胞部分表达 vWF,梗死心肌匀浆与生长因子共同作用,能促进骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化,vWF 阳性率提高(P < 0.05)。RT-PCR 显示加入梗死 1 周心肌组织匀浆诱导的骨髓间充质干细胞其 vWF 阳性表达率最高。提示骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化能力的有别于造血干细胞的另一种骨髓干细胞。骨髓间充质干细胞具有向内皮分化的能力,且加入梗死心肌组织匀浆的诱导体系在体外可促进骨髓间充质干细胞向内皮细胞的分化。应用骨髓间充质干细胞治疗的最佳时机在 1 周为宜。     

人胎盘间充质干细胞生物学特性和抗凋亡细胞因子的分泌

背景:由于骨髓源性间充质干细胞的提取造成患者的二次损伤,也存在病毒、细菌污染的可能,扩增、分化能力不高,为此,实验从胎盘中提取间充质干细胞进行研究,了解其分泌抗凋亡细胞因子的情况,探讨其代替骨髓间充质干细胞的可能性。目的:体外分离培养、扩增人胎盘源性间充质干细胞,研究其基本生物学特性和抗凋亡细胞因子的分泌水平。方法:提取人胎盘间充质干细胞,显微镜下观察细胞形态;采用流式细胞仪测定细胞周期、凋亡情况及表面标记的表达,研究其增殖和生长特性。ELISA检测血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子的分泌水平。结果与结论:在体外培养条件下,人胎盘间充质干细胞为贴壁生长,为成纤维细胞样,核浆比大,细胞增殖活跃,凋亡率低,可分泌能抑制细胞凋亡的细胞因子如血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子。     

骨髓间充质干细胞向肝样细胞的诱导及分化

背景：研究表明,在体外提供肝细胞及成纤维细胞生长因子等多种因子可诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化,但对其诱导的最佳环境还处于摸索阶段。目的：观察体外应用肝细胞生长因子和成纤维生长因子 4 等多种因子联合诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化能力。方法：采用全骨髓贴壁培养法分离、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,培养第 3 代时用肝细胞生长因子、成纤维生长因子 4、胰岛素铁硒传递蛋白及地塞米松等联合诱导其向肝样细胞的分化。于诱导 7,14,21 d 后观察细胞形态变化,RT-PCR 检测细胞白蛋白、甲胎蛋白、细胞角蛋白的 mRNA 表达;于诱导 14,21 d 行 PAS 糖原染色检测,并采用免疫细胞荧光法检测细胞白蛋白表达。结果与结论：随着诱导时间的延长,骨髓间充质干细胞表现为肝细胞样,并呈集落生长,肝细胞特异性标志物逐渐出现和成熟。细胞诱导至 7 d 出现甲胎蛋白 mRNA 表达,14 d 表达增高,21 d 时表达下降;14 d 时细胞角蛋白 18、白蛋白 mRNA和糖原出现表达,并随时间延长表达逐渐增加。细胞诱导 14 d 时,胞浆白蛋白出现表达,至 21 d 时表达增强。证实骨髓间充质干细胞在肝细胞生长因子、成纤维生长因子 4 等多种因子诱导作用下,具有强大的向肝细胞分化能力。     

骨髓间充质干细胞在多发性骨髓瘤活动与缓解期具有不同的促血管生成能力

背景：活动期和缓解期多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞的血管生成能力有无差异目前尚不清楚。目的：观察多发性骨髓瘤活动期及缓解期骨髓间充质干细胞促血管生成能力的差异。方法：抽取13例多发性骨髓瘤患者治疗前和4个周期治疗后的骨髓,分离培养出骨髓间充质干细胞,采用ELISA 方法测定骨髓间充质干细胞培养上清液中血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的浓度;MTT检测骨髓间充质干细胞培养上清液对脐静脉内皮细胞增殖能力的影响;通过Transwel 小室观察骨髓间充质干细胞培养上清液对脐静脉内皮细胞运动能力的影响;通过人工基底膜实验观察骨髓间充质干细胞体外促血管生成和成管能力。结果与结论：活动期多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞培养上清中血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子浓度明显高于缓解期（P〈0.05）;骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞上清对脐静脉内皮细胞增殖作用呈剂量依赖性,活动期明显强于缓解期（P〈0.05）;活动期骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞上清对脐静脉内皮细胞迁移作用明显高于缓解期（P〈0.05）;骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞体外具有明显成血管作用,活动期明显强于缓解期（P〈0.05）。结果提示多发性骨髓瘤活动期骨髓间充质干细胞促血管生成能力明显大于缓解期。     

骨髓中一类新细胞群--神经组织定向干细胞的确立

背景：骨髓间充质干细胞和造血干细胞具有分化为神经类细胞的潜能己得到共识。另有研究者认为骨髓中除骨髓间充质干细胞和造血干细胞以外，还寄居着CXCR4阳性的组织定向干细胞，包括骨骼肌、心、肝及神经组织定向干细胞。 目的：实验拟进一步证实神经组织定向干细胞寄居于骨髓，并寻求确立神经组织定向干细胞分离、培养的新方法。 设计：开放性实验。 单位：解放军第二军医大学解剖学教研室。 材料：所用成年清洁级SD大鼠由解放军第二军医大学动物中心提供。DMEM/F12,B27，N2均购自Invitrogen公司；bFGF源于CytoLab Ltd;EGF源于Invitrogen公司；Nestin、CXCR4,β-Tublin Ⅲ，神经胶质纤维酸性蛋白等一抗为Santa Cruz公司兔抗鼠多克隆抗体；MAP2ab（Clonell—5B），CNPase（Clone AP20）为NeoMarkers公司小鼠抗大鼠单克隆抗体；荧光（FITC，Cy3）标记试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；免疫组化试剂盒购自Vector Laboratories公司。NycoPrep^TM分离液（1．077A）购自Axis-Shield公司。 方法：实验于2004-01／2006-12在解放军第二军医大学组织工程研究所完成。取SD大鼠双侧股骨及胫骨，冲洗骨髓腔，经NycoPrep^TM分离液分离单核细胞层，DMEM／F12（1：1）无血清神经干细胞培养液（内含2％B27，1％N2，20μg/L碱性成纤维细胞生长因子，20μg／L表皮生长因子，1×10^5U/L青霉素，100mg／L链霉素），通过先贴壁、后悬浮的方法从骨髓中分离、培养单克隆生长的神经组织定向干细胞。 主要观察指标：通过免疫细胞化学法检测神经组织定向干细胞细胞球CXCR4和nesfin蛋白，以及细胞球自然分化后神经元以及神经胶质细胞的标志蛋白。 结果：①神经组织定向干细胞细胞球表达神经干细胞标志蛋白nesfin和组织定向干细胞标志蛋白CXCR4。②神经组织定向干细胞细胞球在含15％胎牛血清的     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞

背景:自体软骨细胞来源困难是束缚软骨细胞移植和软骨工程学发展的主要问题之一。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,在不同诱导条件下,骨髓间充质干细胞能分化形成多种组织细胞,如软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞及神经细胞等。胰岛素样生长因子-I是一种对肢体和软骨的形成及发育起重要调控作用的生长因子。目的:观察胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液是否能在体外诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。设计:开放性实验。单位:中山大学附属第二医院骨科和医学研究中心。材料:实验于2003-03/11在中山大学附属第二医院医学研究中心完成。人骨髓间充质干细胞取自因健康原因需终止妊娠的4～6月龄水囊引产的胚胎。方法:采用Percoll分离液分离培养人胚骨髓间充质干细胞,体外扩增,用流式细胞仪测定骨髓间充质干细胞的CD44,CD71,CD34,CD45表达;在第4代骨髓间充质干细胞的培养基中加入100μg/L胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液,采用倒置显微镜观察、Ⅱ型胶原免疫组织化学、细胞内蛋白多糖含量测定等方法判断诱导细胞的形态变化和表达软骨基质的能力。主要观察指标:通过检测细胞CD34,CD44,CD45的表达,进行骨髓间充质干细胞表型鉴定。通过观测诱导后细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学及细胞分泌蛋白多糖能力的变化判断其是否向软骨细胞分化。结果:①倒置显微镜观察结果:体外培养的骨髓间充质干细胞呈现成纤维细胞形态。②骨髓间充质干细胞表面抗原鉴定:流式细胞仪结果显示细胞均一性较好,第4代骨髓间充质干细胞阳性表达CD44,阴性表达CD34,CD45,说明分离获得的细胞符合骨髓间充质干细胞的特点。③光镜下观察骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞的形态变化:加入软骨细胞条件培养液和胰岛素样生长因子-I共培养,在培养过程中见骨髓间充质干细胞逐渐变圆,15d后可见部分细胞呈短梭形或多角形,突起短,呈现软骨细胞的特征。④Ⅱ型胶原免疫组织化学染色:胰岛素样生长因子组细胞在培养后第15天约72.5%的细胞可见棕黄色的颗粒分布于胞浆内,呈弱阳性或较强阳性。对照组骨髓间充质干细胞第15天的Ⅱ型胶原免疫组织化学为阴性。⑤蛋白多糖含量测定:胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液共培养组培养15d后,细胞内蛋白多糖含量为(8.92±0.91)μg/L,高于单纯骨髓间充质干细胞培养组[(2.56±0.26)μg/L,P<0.05],但低于软骨细胞组[(13.69±1.51)μg/L,P<0.05]。结论:胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液能诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。     

血管内皮生长因子基因转染促进骨髓间质干细胞增殖的实验

目的：以基因转染为平台，利用脂质体将血管内皮生长因子基因转入骨髓间质干细胞，使其可以在作为种子细胞的同时。作为基因治疗的载体将血管内皮生长因子基因导人缺血组织，从而为探索一种更加有效的缺血性心脏病治疗方法提供实验室基础。 方法：实验于2004—07／2005-03在解放军第二军医大学医学遗传实验室及上海交通大学附属第一人民医院心内科实验室完成。①分离、培养、鉴定大鼠骨髓间质干细胞。②试验组用构建好的PcDNA3．1-VEGF进行基因转染，阳性对照组用PcDNA3．1空质粒进行转染，阴性对照组只加入培养液。③收集各组第1，3，5，7，9，11天的上清液，用ELISA法测定培养上清液中血管内皮生长因子的浓度；提取阳性克隆的细胞蛋白；进行Western blot分析；用四甲基偶氮唑盐法检测转染后血管内皮生长因子的表达对骨髓间质于细胞增殖的影响。 结果：①免疫组织化学示所培养细胞CD106^＋，CD34^-。②ELISA方法示质粒转染细胞后第2天，上清液中即可出现血管内皮生长因子浓度的增高，第5天时达到高峰，以后逐渐降低，10d后趋于稳定，但其浓度仍高于对照组。③Westem blot示转染组血管内皮生长因子蛋白浓度明显高于空质粒转染组和未转染组。④四甲基偶氯唑盐示转染后血管内皮生长因子的表达可以促进骨髓间质干细胞的增殖。 结论：血管内皮生长因子成功转染骨髓间质干细胞，血管内皮生长因子的表达促进了骨髓间质干细胞的增殖，从而可以将促血管生长因子治疗和干细胞移植有效的结合起来。     

联合应用生长因子促骨髓间充质干细胞向韧带样细胞分化

背景：利用生长因子诱导骨髓间充质干细胞定向分化成韧带样细胞并促其分泌胶原蛋白是构建组织工程化韧带的关键。生长因子碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子β1在细胞定向分化过程中都起着十分重要的作用。目的：采用转化生长因子β1和碱性成纤维细胞生长因子诱导体外培养的兔骨髓间质干细胞,转化为韧带样细胞,并研究此种韧带样细胞的生物特性。方法：自幼兔四肢骨抽取骨髓分离纯化骨髓间充质干细胞并培养、增殖。采用10μg/L转化生长因子β1和25μg/L碱性成纤维细胞生长因子对骨髓间质干细胞进行诱导分化,分为空白组、转化生长因子β1组、碱性成纤维细胞生长因子组、转化生长因子β1＋碱性成纤维细胞生长因子组。观察生长因子对骨髓间质干细胞生长、形态的影响,使用MTT法绘制细胞生长曲线,使用天狼腥红染色法定量对比骨髓间质干细胞分泌胶原蛋白量。把转化生长因子β1＋碱性成纤维细胞生长因子联合诱导的骨髓间质干细胞使用BrdU荧光染色标记,然后移植到脱细胞真皮基质上,观察细胞增殖分布情况,并与空白组对照。结果与结论：转化生长因子β1＋碱性成纤维细胞生长因子联合组,细胞形态优于空白组及单一因子组,细胞增殖率、胶原分泌量也较高。脱细胞真皮基质上,转化生长因子β1＋碱性成纤维细胞生长因子组细胞增殖分布情况明显优于空白组。提示联合使用生长因子转化生长因子β1和碱性成纤维细胞生长因子刺激兔骨髓间质干细胞,能够促使兔骨髓间质干细胞定向转化为韧带样细胞,对组织工程前交叉韧带的构建具有积极意义。     

自体激活富血小板血浆干预兔骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的研究

背景：自体富血小板血浆激活后可释放多种生长因子,可以促进骨髓间充质干细胞的增殖与分化。目的：观察自体激活富血小板血浆对体外培养的兔骨髓间充质干细胞向成软骨细胞分化的影响。方法：取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞;取第3代骨髓间充质干细胞,分别应用体积分数10%自体激活富血小板血浆和体积分数10%胎牛血清培养液进行体外培养,观察其向成软骨细胞分化情况。结果与结论：分离培养的兔骨髓间充质干细胞呈长梭形,传代后细胞生长迅速。流式细胞仪检测发现第3代细胞高表达CD29、CD44,而低表达CD45。免疫荧光细胞化学染色显示经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞表达Ⅱ型胶原;实时荧光定量PCR检测发现经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原α1链基因和聚集蛋白聚糖基因表达明显高于经胎牛血清诱导的骨髓间充质干细胞（P〈0.01）。可见自体激活富血小板血浆具有促进兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化的潜能。     

骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质组合生长因子诱导向软骨细胞分化

背景：用组织工程学方法高质量修复关节软骨缺损并达到很好的远期疗效目前尚无定论。鉴于此,课题组提出＂同种异体骨髓间充质干细胞关节腔内定向培养组织工程软骨＂的实验设技。目的：同种异体脱钙骨基质组合转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的能力,同时探索其在关节腔内培养促进向关节软骨定向分化的方法。方法：分离兔骨髓间充质干细胞并行体外培养,分为两组：实验组DMEM培养液中加入转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ,对照组中未加入诱导因子。比较两组细胞的增殖情况和成软骨分化情况。制备同种异体脱钙骨基质支架材料,实验组骨髓间充质干细胞负载到同种异体脱钙骨基质中,构建组织工程软骨复合体,取另2只兔的腰背筋膜包裹后缝合固定到30只兔膝关节腔内行腔内培养。分别于植入后4,8,12周各取10只标本进行组织学切片观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学观测,并对结果进行分析。结果与结论：实验组中骨髓间充质干细胞集落形成效率明显高于对照组（u=3.326,P〈0.01）。实验组细胞爬片做Ⅱ型胶原免疫组化检测呈阳性,对照组未见阳性细胞。组织工程复合体在腔内培养12周后,苏木精-伊红染色见大量软骨细胞增生,胞核染色呈蓝色;甲苯胺蓝染色见软骨细胞成串排列,大量软骨陷窝形成,周围大量基质包绕;Ⅱ型胶原免疫组织化学反应见细胞外基质中出现大量棕黄色颗粒,Ⅱ型胶原染色强阳性。提示转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ可显著促进骨髓间充质干细胞增殖和成软骨分化,骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质结合后可在关节腔内成功培养出组织工程软骨。同种异体脱钙骨基质符合组织工程软骨支架材料的基本要求。     

不同来源骨髓间充质干细胞对CD34~＋细胞增殖的影响

背景：作者前期研究显示,银屑病患者与正常人骨髓间充质干细胞的生物学特性、免疫学反应及抗原提呈功能有明显差异,而与流产胎儿骨髓间充质干细胞无明显差异。目的：观察不同来源骨髓间充质干细胞对正常人骨髓CD34^＋细胞增殖的影响。方法：密度梯度离心法分离银屑病患者和流产胎儿骨髓单一核细胞并培养、传代,传至第2代72h后收集培养上清液,流式细胞仪鉴定骨髓CD34^＋细胞及骨髓间充质干细胞纯度。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状态,细胞磁珠分选仪分选出的正常人骨髓CD34^＋细胞加入骨髓间充质干细胞培养上清液培养24h后,四甲基偶氮唑盐比色法检测骨髓CD34^＋细胞的增殖活性。结果与结论：CD34^＋细胞加入银屑病患者和流产胎儿骨髓间充质干细胞培养上清培养24h后,细胞形态无差别。银屑病患者和流产胎儿骨髓间充质干细胞培养上清液对正常人骨髓CD34^＋细胞增殖的影响差异无显著性意义（P〉0.05）。     

全骨髓细胞贴壁法分离与培养大鼠骨髓间充质干细胞的多向分化能力

背景：分离培养纯度较高的骨髓间充质干细胞是对其进行深入研究的前提。目的：观察全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征。方法：选取体质量为80-100g雄性SD大鼠,采用全骨髓细胞贴壁培养法获取骨髓间充质干细胞。在取材过程中需严格掌握大鼠处死至将细胞悬液放入培养箱内的时间,一般控制在40min以内。使用基础培养基冲洗骨髓腔时力度适中且在骨髓腔内旋转数次,可使骨髓细胞充分脱落,保证骨髓细胞的获得量。结果与结论：原代骨髓间充质干细胞为贴壁生长的成纤维样细胞,传代后的细胞形态均一,呈漩涡状排列;第3代骨髓间充质干细胞的生长曲线呈S形,经历3个生长时期：潜伏期、对数生长期和停滞期;流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面抗原结果示：CD29＋99.45%、CD34＋1.45%、CD44＋99.52%、CD45＋1.41%;成骨、成脂诱导分化后,矿化结节被茜素红染成橘红色,脂滴被油红O染成红色。说明骨髓间充质干细胞能向成骨、成脂分化,具有多向分化潜能,符合国际细胞治疗学会间充质及组织干细胞委员会提出的鉴定动物来源骨髓间充质干细胞的最低标准。