建立人肾小管上皮细胞蛋白质组双向电泳的分离体系

背景:双向电泳分离技术是蛋白质组学研究的核心技术之一,但蛋白质样品的分离效果受各种实验条件的影响较大.因此,针对不同来源的蛋白样品进行实验条件的优化可获得具有较高分辨率的双向电泳图谱.目的:拟建立优化的人肾小管上皮细胞株蛋白质组双向电泳分离体系.方法:常规培养人肾小管上皮细胞株HK-2细胞并裂解提取全蛋白,按标准条件对蛋白质进行双向电泳分离,并对各个关键因素进行优化.等电聚焦采用缓慢升压模式,电泳参数根据Bio-Rad公司的预设方案进行调整.改良硝酸银法进行蛋白质斑点染色.采集电泳图谱并分析双向电泳图谱中蛋白斑点的数量、图像分辨率及背景条纹的变化.结果与结论:通过对实验条件的筛选和优化,成功建立了具有较高的分辨率和重复性的人肾小管上皮细胞蛋白质组双向电泳分离体系.其中,优化后的裂解液配方成分为1%TBP,4%CHAPS,0.2%Bio-Lyte,40mmol/L Tris,8mol/L尿素,2 mol/L硫脲:采用pH 4～7的IPG胶条;上样方式选择被动的水化上样.等电聚焦过程中使用预设的缓慢升压模式,充分聚焦后选用合适的电压模式进行SDS-PAGE电泳,然后采用改良硝酸银法进行染色,最终获得了满意的蛋白质组双向电泳图谱.     

成年无精子症男性睾丸活检组织双向电泳分析技术的初步建立及其优化

目的:建立并优化成年无精子症男性睾丸活检组织双向凝胶电泳图谱.方法:采用固相pH梯度等电聚焦为第一向,SDS-PAGE垂直电泳为第二向的双向电泳分离技术进行分离,凝胶经银染显色后,用Melanie 4软件分析双向凝胶电泳技术(2-DE)图谱.对聚焦参数的设置和样品的处理等步骤进行优化.结果:优化后成功地获得了成年无精子症男性睾丸活检组织分辨率高、重复性好的双向电泳图谱.结论:应用2-DE初步建立了成年无精子症男性睾丸活检组织分辨率较高且重复性好双向凝胶电泳图谱,为从睾丸蛋白质组学水平进一步研究无精子症奠定了基础.     

正常和退变腰椎间盘蛋白质的双向电泳和质谱鉴定

背景:近年来对于退变腰椎间盘组织蛋白质成分改变的研究取得了很大进展,但是对于正常和退变腰椎间盘整体蛋白质成分改变的分离和差异鉴定却鲜见报道.目的:建立正常和退变腰椎问盘蛋白质的双向电泳图谱,鉴定差异表达蛋白,探讨腰椎间盘退变的生物学机制.设计、时间及地点:对比观察,于2007-06/2008-12在南方医科大学病理生理实验室完成.材料:由自愿者提供的正常和退变腰椎间盘组织各6例,年龄21～45岁,其中男9例,女3例;取材范围L3-L5.方法:氯化铯梯度离心去除正常和退变腰椎间盘组织蛋白多糖,通过崮相pH梯度(IPG)等电聚焦和梯度聚丙烯酰胺双向电泳分离蛋白质,分析电泳图像,使用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱仪对差异蛋白质点进行分析鉴定.主要观察指标:正常腰椎间盘及退变腰椎间盘组织IPG等电聚焦双向凝胶电泳结果.结果:双向电泳显示正常和退变腰椎间盘蛋白质图谱差异显著,从中选取16个差异明显的位点进行质谱仪分析,确定了6种具有显著性意义的差异蛋白质.结论:双向电泳可有效地分离正常和退变腰椎问盘组织蛋白质,通过质谱仪鉴定可以确定其之间差异蛋白质的性质.     

人APL细胞株NB4不同二维电泳条件对电泳结果的影响

本研究探讨不同二维电泳条件对人急性早幼粒细胞性白血病(APL)细胞株NB4二维电泳结果的影响。选用24cm，pH3—10L的固定pH梯度(immobilized pH gradient，IPG)胶条，用IPGphor进行第一相等电聚焦，然后用Ettan Dalt Ⅱ垂直电泳系统进行第二相SDS-PAGE，银染后用Image Master 2D Elite软件进行分析。结果表明：采用低离子强度的缓冲液冲洗收集样品可以提高等电聚焦效果。裂解液中7mol／L尿素、40mmol／L DTT能溶解NB4细胞大部分蛋白质，而水化液中硫脲与尿素合用可以明显增加碱性端中低分子量区可分辨的蛋白质点。NB4细胞用24cm，pH3—10L的IPG胶条进行二维电泳时，100μg左右的上样量、63200V小时左右的等电聚焦时间是恰当的。结论：APL细胞的蛋白质种类繁多，受多种因素影响，正确选择样品制备方法和二维电泳条件十分重要。     

局灶性脑缺血与正常大鼠海马蛋白质双向电泳比较

目的：建立高分辨率的大鼠脑海马蛋白质组双向电泳技术，初步分析正常与局灶性脑缺血模型大鼠脑海马蛋白质表达的差异，探讨局灶性脑缺血性损伤的病理机制。 方法：实验时间为2003—10／2004-07。模型制备及蛋白质的提取在天津中医学院第一附属医院分子生物学实验室完成，双向电泳部分在国家生物医学分析中心完成。Wistar大鼠随机分为正常组、假手术组、局灶性脑缺血模型组，各组又分为6h、24h两个时间段。局灶性脑缺血动物模型参照Longa线栓法并加以改进。各组大鼠在规定时间快速断头取脑，提取脑海马蛋白质，进行双向电泳。（1）第一向固相pH等电聚焦电泳：分别取正常组和模型组的蛋白样品1．2mg，选用pH3～10非线性IPG胶条，采用胶内泡胀的方法，样品和再水化液共350μL。设置聚焦参数：30V。12h；200V，1h；500V，1h；1000V，1h；5000V。1h；8000V，10h。固相pH等电聚焦电泳后，IPG胶条分别在十二烷基磺酸钠平衡液a／b中平衡1次，15min／次。（1）第二向垂直平板SDS-PAGE；将平衡好的胶条转入预先灌制好的130g／LSDS—PAGE胶上，在PROTEIN—Ⅱ（R）XI Cell上进行第二向电泳，参数设置为：恒流20mA，40min；30mA，4h。考马斯亮篮R&;#183;350染色后，扫描至Dell工作站中，Image—Master 2D Elite v3．01软件对2-DE图谱进行蛋白质点匹配率及差异表达分析。 结果：正常组，假手术组6h和24h时间段及局灶性脑缺血性模型组6h和24h时间段分别分离出蛋白质点865个、857个和878个、865个和835个。通过对比发现45个差异表达蛋白质点，其中在局灶性脑缺血性模型组6h新出现2个，表达上调的12个，表达下调的19个；在局灶性脑缺血性模型组24h时间段新出现1个，表达上调的14个，表达下调的25个。 结论：以双向电泳技术得到分辨率较好的电泳图谱，并初步找到脑缺血后差异表达的蛋白质点，为深入研究脑缺血性损伤病理机制奠定基础．     

局灶性脑缺血与正常大鼠海马蛋白质双向电泳比较

目的:建立高分辨率的大鼠脑海马蛋白质组双向电泳技术,初步分析正常与局灶性脑缺血模型大鼠脑海马蛋白质表达的差异,探讨局灶性脑缺血性损伤的病理机制。方法:实验时间为2003-10/2004-07。模型制备及蛋白质的提取在天津中医学院第一附属医院分子生物学实验室完成,双向电泳部分在国家生物医学分析中心完成。Wistar大鼠随机分为正常组、假手术组、局灶性脑缺血模型组,各组又分为6h、24h两个时间段。局灶性脑缺血动物模型参照Longa线栓法并加以改进。各组大鼠在规定时间快速断头取脑,提取脑海马蛋白质,进行双向电泳。①第一向固相pH等电聚焦电泳:分别取正常组和模型组的蛋白样品1.2mg,选用pH3～10非线性IPG胶条,采用胶内泡胀的方法,样品和再水化液共350μL。设置聚焦参数:30V,12h;200V,1h;500V,1h;1000V,1h;5000V,1h;8000V,10h。固相pH等电聚焦电泳后,IPG胶条分别在十二烷基磺酸钠平衡液a/b中平衡1次,15min/次。②第二向垂直平板SDS-PAGE:将平衡好的胶条转入预先灌制好的130g/LSDS-PAGE胶上,在PROTEIN-Ⅱ(R)XICell上进行第二向电泳,参数设置为:恒流20mA,40min;30mA,4h。考马斯亮篮R-350染色后,扫描至Dell工作站中,Image-Master2DElitev3.01软件对2-DE图谱进行蛋白质点匹配率及差异表达分析。结果:正常组、假手术组6h和24h时间段及局灶性脑缺血性模型组6h和24h时间段分别分离出蛋白质点865个、857个和878个、865个和835个。通过对比发现45个差异表达蛋白质点,其中在局灶性脑缺血性模型组6h新出现2个,表达上调的12个,表达下调的19个;在局灶性脑缺血性模型组24h时间段新出现1个,表达上调的14个,表达下调的25个。结论:以双向电泳技术得到分辨率较好的电泳图谱,并初步找到脑缺血后差异表达的蛋白质点,为深入研究脑缺血性损伤病理机制奠定基础。     

蛋白质组学技术分离及鉴定人脑氧化蛋白质

背景：氧化修饰蛋白质在脑老化及阿尔茨海默病等老年变性神经病的发病机制中扮演着重要角色。蛋白质组学技术可以发现氧化修饰蛋白质,为相关疾病的药物治疗选择新的靶标。目的：建立以双向电泳结合Westernblot及生物质谱技术分离、鉴定人腩氧化修饰蛋白质的方法。方法：取3个无神经系统疾患的男性脑组织蛋白,第一向等电聚焦电泳后,吲相pH梯度胶条同二硝基苯肼反应,然后行第二向SDS-PAGE电泳。2张相同凝胶中的1张行考马斯亮蓝染色,另1张凝胶显示免疫荧光盟色。同PVDF膜上显色点相对应的考染凝胶上的蛋白质点即为氧化修饰蛋白质。凝胶蛋白胶内酶解,基质辅助激光解析飞行时间串联质谱签定氧化修饰蛋白质。结果与结论：从提取的脑组织中鉴定出β-肌动蛋白、天冬氨酸氨基转移酶、粜糖二磷酸醛缩酶、磷酸甘油酸激酶、1,3一磷酸甘油醛脱氢酶、碳酰还原酶1、磷酸丙糖异构酶、转酮醇酶、丙酬酸激酶、血清白蛋白前体、二氢嘧啶酶相关蛋白质2、热休克蛋白60为氧化修饰蛋白质。说明实验成功建立了删蛋白质组学技术分离及鉴定人脑氧化蛋白质的方法。     

蛋白质组学技术分离及鉴定人脑氧化蛋白质

背景:氧化修饰蛋白质在脑老化及阿尔茨海默病等老年变性神经病的发病机制中扮演着重要角色。蛋白质组学技术可以发现氧化修饰蛋白质,为相关疾病的药物治疗选择新的靶标。目的:建立以双向电泳结合Western blot及生物质谱技术分离、鉴定人脑氧化修饰蛋白质的方法。方法:取3个无神经系统疾患的男性脑组织蛋白,第一向等电聚焦电泳后,固相pH梯度胶条同二硝基苯肼反应,然后行第二向SDS-PAGE电泳。2张相同凝胶中的1张行考马斯亮蓝染色,另1张凝胶上免疫荧光显色。同PVDF膜上显色点相对应的考染凝胶上的蛋白质点即为氧化修饰蛋白质。凝胶蛋白胶内酶解,基质辅助激光解析飞行时间串联质谱鉴定氧化修饰蛋白质。结果与结论:从提取的脑组织中鉴定出β-肌动蛋白、天冬氨酸氨基转移酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸甘油酸激酶、1,3-磷酸甘油醛脱氢酶、碳酰还原酶1、磷酸丙糖异构酶、转酮醇酶、丙酮酸激酶、血清白蛋白前体、二氢嘧啶酶相关蛋白质2、热休克蛋白60为氧化修饰蛋白质。说明实验成功建立了用蛋白质组学技术分离及鉴定人脑氧化蛋白质的方法。     

窄范围pH梯度干胶条可提高胃癌细胞蛋白质组表达谱分辨率

目的探讨不同pH梯度干胶条在提高胃癌细胞蛋白质表达谱分辨率中的作用,为深入研究胃癌的蛋白质组学奠定基础。方法提取胃低分化腺癌细胞MGC-803的蛋白质,分别采用pH 3~10和pH 4~7不同pH梯度干胶条建立胃低分化腺癌细胞MGC-803蛋白质双向凝胶电泳图谱,与相对应pH区域的蛋白质斑点进行比较。结果成功地构建出两种不同pH梯度MGC-803细胞的双向凝胶电泳图谱,经比较两种图谱蛋白质斑点结果显示,运用窄范围pH 4~7干胶条可更有效分辨出pH 3~10部分区域内聚积的蛋白质斑点。结论采用窄范围pH的干胶条可提高双向电泳图谱分辨率,优化了胃癌细胞蛋白质组学研究的技术体系,可有效获取待测靶蛋白。     

海洛因对大鼠C6胶质瘤细胞的双向电泳图谱比较

目的 比较海洛因对大鼠C6胶质瘤细胞的双向电泳图谱差异,从蛋白质水平初步探索阿片类毒物-海洛因的作用机制。方法 提取对照组与海洛因组C6胶质瘤细胞的蛋白质,以固相pH梯度等电聚焦为第一向,SDS-PAGE垂直电泳为第二向进行2-DE。以图像分析软件ImageMaster V 5.0分析电泳图谱。结果 将对照组与海洛因组C6胶质瘤细胞的2-DE图谱匹配后,检测到570个蛋白点,差异大于1.5倍的斑点有29个,其中20个下调,9个上调。结论 初步建立了大鼠C6胶质瘤细胞的蛋白质组学分析方法;差异点的发现为深入理解海洛因的分子机制提供了线索。     

蛋白质组学技术鉴定吉兰-巴雷综合征患者血清急性期反应蛋白的表达

背景：吉兰-巴雷综合征患者血液中存在与发病有关的抗体、补体和细胞因子,以蛋白质组学技术分离鉴定这些标志蛋白,可为寻找新的药物靶标提供依据。目的：以蛋白质组技术比较吉兰-巴雷综合征患者与正常对照组血清的差异表达蛋白。方法：采集确诊的吉兰-巴雷综合征患者和正常者血清各30例,提取血清蛋白质以固相pH梯度等电聚焦为第一向,SDS-PAGE垂直电泳为第二向进行双向电泳,图象分析软件Imagemaster 2D分析电泳图谱,MALDI-TOF/TOF串联质谱鉴定差异表达蛋白。结果与结论：在吉兰-巴雷综合征患者与正常者中24种蛋白质的表达量显著不同,其中α-2-巨球蛋白,血浆铜蓝蛋白,血清淀粉样P物质,丛生蛋白,抗糜蛋白酶,触珠蛋白,血红素蛋白,α-1-抗胰蛋白酶,血清转铁蛋白等9种蛋白质被鉴定为急性期反应蛋白。结果说明吉兰-巴雷综合征患者血清中急性期反应蛋白表达量发生了明显变化,加深了对吉兰-巴雷综合征发病分子机制的理解。     

基于荧光差异二维电泳技术的临床尿液蛋白质组学研究方法探讨

目的探讨尿液蛋白质组学研究中样本留取、尿样储存、蛋白浓缩、荧光标记以及二维电泳过程中的关键问题和具体方法,以期为临床开展相关研究奠定方法学基础。方法选取尿蛋白〈0.15g/24h的糖尿病和高血压男性患者,床边留取新鲜尿液。尿液混合后根据是否添加蛋白酶抑制剂、长期保存温度、蛋白除盐方法和一向固相PH梯度等电聚焦胶条的不同,分为7组,所有样本都进行了双向电泳分析比较,部分标本进行了荧光差异电泳分析。结果从双向电泳结果可以明显看出加入蛋白酶抑制剂、-80℃冰箱保存、反复超滤离心所得到的尿液蛋白点数最多;胶条以11cm,PH4-7和PH3-1024cm的非线性胶条比较合适尿液二维电泳分析。通过不同Cydye荧光染料标记后,尿液荧光差异二维电泳（2D-DIGE）分析可以得到重复性好、便于临床和实验室开展的结果。结论基于2D-DIGE的临床尿液蛋白质组学研究方法具有可行性,采取合适的方法可以得到良好的研究结果。     

宫颈永生化细胞和癌细胞的亚细胞蛋白质组学初步研究

目的通过蛋白质双向凝胶电泳方法（2-DE）建立人类乳头状瘤病毒．16阳性的宫颈上皮永生化细胞（H8细胞株）和宫颈癌细胞（Caski细胞株）亚细胞（细胞质、细胞膜、细胞核）蛋白电泳图谱,进行差异蛋白质组学研究筛选差异蛋白点。方法分别对H8和Caski细胞提取细胞质、细胞膜和细胞核蛋白,通过2-DE筛选出差异点进行基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-MS／MS）分析。结果对H8细胞和Caski细胞亚细胞蛋白双向电泳图谱比较,初步比较筛选了6种细胞质差异蛋白点、3种细胞膜差异蛋白点和9种细胞核差异蛋白点。结论通过对HPV-16阳性的宫颈癌前和癌变的亚细胞结构差异蛋白进行分析,为寻找宫颈癌特异性肿瘤标志物和靶向治疗提供实验依据。     

反相高效液相色谱法测定大鼠脑组织中4种氨基酸类神经递质

目的:建立一种高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)荧光分析技术,用于测定大鼠脑组织中天门冬氨酸(aspartate,Asp)、谷氨酸(glutamate,Glu)、牛磺酸(taurine,Tau)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,γ-GA-BA)。方法:色谱柱为Dikma Inertsil ODS(250mm×4.6mm,3.5μm),预柱为Dikma C18柱,4.0mm×3.0mm;流动相为磷酸二氢钾缓冲液(0.1mol/L,pH 6.0):甲醇:乙腈为6∶3∶1;流速为1mL/min。结果:4种氨基酸在15min内完全分离,其在0.1～2μmol/L浓度范围内与峰面积有良好的线性关系,提取回收良好。结论:此种HPLC荧光分析法快速、准确、灵敏度高,适用于大鼠脑组织中氨基酸类神经递质含量的测定。     

三种大鼠骨髓间充质干细胞双向电泳样品制备方法的比较

背景：骨髓间充质干细胞双向电泳样品制备方法很多,但目前尚未有统一标准。目的：通过对比确定合适的大鼠骨髓间充质干细胞双向电泳样品制备方法。方法：充分裂解体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞,所得蛋白样品分为3组：未进一步处理组、丙酮沉淀法处理组、2-D clear-up kit处理组,Bradford法测定蛋白质浓度后分别进行双向电泳,对比分析3组所得电泳图谱。结果与结论：2-D Clean-up kit处理组所得双向电泳图谱在背景,图像清晰度,分辨率,重复性上比丙酮沉淀法处理组和未进一步处理组要好,说明经2-D Clean-up kit处理的样品制备方法更适合用于大鼠骨髓间充质干细胞双向电泳样品的制备。     

小鼠心肌蛋白质组双向电泳技术的建立及其优化

背景:双向电泳对蛋白质混合物的分离和分析精确而有效,已成为研究蛋白质组最有价值的核心技术之一;以小鼠模型为研究对象,模拟人体疾病状态,是研究心血管疾病的重要手段之一。建立并优化小鼠心肌蛋白质组双向电泳技术将为以后的心脏疾病研究奠定基础。目的:建立并优化小鼠心肌蛋白质组双向电泳技术。设计:以小鼠为研究对象,观察对比研究。单位:南方医科大学附属南方医院病理科。材料:实验于2004-02/09在南方医科大学附属南方医院病理科完成。选取4～5周龄雄性无特殊病原体级BABL/c小鼠12只,体质量12～15g,由南方医科大学动物中心提供。方法:在麻醉状态下脱臼处死小鼠,取心脏,对不同的蛋白提取方法、上样缓冲液、范围的固相pH胶条、蛋白上样量、染色方法等进行对比分析,扫描并数字化,再进行图像分析。建立并优化实验中的各个环节。主要观察指标:蛋白分离的效果和实验的可重复性。结果:心肌特异的裂解方案能在pH4～7胶条上分离约910个蛋白点;银染上样量200μg,考染1000μg较为适宜;正常小鼠心肌组织在17cmpH3～10L的胶上可分离约(920±30)个蛋白点,pH4～7L的胶条上,可分离(880±30)个左右蛋白点;蛋白点平均匹配率为86.9%。结论:实验结果显示,对小鼠心肌组织蛋白质双向电泳各方面条件进行调整和优化,建立了相对稳定的心肌蛋白分离方法。     

高效液相色谱法同时测定人血清中卡马西平及地尔硫浓度

目的建立反相高效液相色谱（HPLC）法,以安定为内标,同时测定血清中卡马西平（CBZ）和地尔硫（DZ）的浓度。方法采用Waters产μBondapak C18柱,甲醇-磷酸盐缓冲液（内含0.04%二乙胺,pH 6.82）=70∶30为流动相,紫外检测波长为237 nm。结果CBZ两种浓度（5、10 mg/L）的平均回收率及其日内精密度RSD分别为101.6%、100.1%及0.8%、1.0%。DZ两种浓度（100、200μg/mL）的平均回收率及其日内精密度RSD分别为99.6%、101.1%及2.7%、3.0%。结论HPLC法较灵敏、准确、简便。可用于两药合用时血药浓度及药动学变化的研究。