积雪草苷对瘢痕成纤维细胞增殖与磷酸化Smad2和Smad7表达的影响

背景转化生长因子-β(TGF-β)是病理性瘢痕形成的重要因素.Smad蛋白家族是近年来发现的TGF-β受体下游信号蛋白.积雪草苷可抑制成纤维细胞增殖及胶原的合成,使瘢痕内的TGF-β表达减少.目的研究积雪草苷对瘢痕成纤维细胞增殖与磷酸化Smad2和Smad7的作用及机制.设计以细胞为研究对象,对照、观察性研究.单位一所大学医院烧伤整形科. 对象实验于2002-04/2003-03在中山大学外科实验室完成.标本取自因增生瘢痕住院进行整形手术的患者6例,男3例,女3例,年龄1～35岁.增生性瘢痕成纤维细胞由本科实验室经原代培养后传代获得.干预研究分为实验组和对照组,将积雪草苷作用于成纤维细胞为实验组,对照组不加积雪草苷,观察用药前后各指标的改变.主要观察指标①积雪草苷对磷酸化Smad2和Smad7的影响.②积雪草苷对细胞周期和凋亡的影响.结果积雪草苷可抑制瘢痕的成纤维细胞从S期进入M期,减少成纤维细胞中磷酸化Smad2的含量,两组差异无显著性意义(t=1.53,P=0.08),细胞中Smad7的含量实验组为(50.80±22.40)%,对照组(32 18±17.84)%,两组的差异有显著性意义(t=2.17,P=0.024).结论积雪草苷抑制瘢痕可通过Smad通路发挥作用.     

转化生长因子—β1对瘫痕疙瘩成纤维细胞Smad3，7mRNA表达的影响

目的 探讨转化生长因子-β1（TGF-β1）对瘢痕疙瘩成纤维细胞（KFB）Smad3，7mRNA表达的影响，以寸步明确TGF-β1在瘢痕疙瘩的发生、发展过程中的重要作用。方法 用RT-PCR法分别检测TGF-β1不同含量（0，5，50，500pmol/L;Smad3 mRNA 24h,Smad7 mRNA90min）和TGF-β1（500pmol/L）作用不同时间（Smad3 mRNA:1,2,4,24,48h;Smad7 mRNA:0.5,1,1.5,2,4,24h）对Smad3,7mRNA表达的影响。结果 不同含量TGF-β1刺激KFB后，随TGF-β1含量的增加，Smad3 mRNA水平逐渐下降，并呈含量依赖性。与Smad3相反，5pmol/L TGF-β1就能使Smad7 mRNA水平明显升高2.6倍（46&;#177;7，对照组13&;#177;7，t=6.150,P=0.0005），并随TGF-β1剂量加大面略有改变，说明KFB的Smad7 mRNA表达对TGF-β1的刺激非常敏感。用TGF-β1刺激细胞后，Smad3 mRNA水平随作用时间延长而逐渐下降，到作用48h后下降到最低（53&;#177;9，对照组18&;#177;8,t=6.011,P=0.0005），显示出时间依赖性；而Smad7 mRNA在细胞受到TGF-β1刺激后120min即达到对照组的2.5倍（73&;#177;11，对照组53&;#177;9,t=5.215,P=0.003),24h后回幕到正常对照水平。结论 TGF-β1能使KFB细胞Smad3 mRNA发生配体依赖性的下调，而使Smad7 mRNA表达迅速增加。     

转化生长因子-β3对增生性瘢痕成纤维细胞的生物学作用

背景：哺乳类动物有3种TGF-β异构体即TGF-β1，β2，β3，这3种异构体各自具有独特而不同的生物学作用，TGF-β1是明显的促瘢痕形成因子，而TGF-β3可减少TGF-β1，β2的产生，从而减少细胞外基质(ECM)合成，因此，TGF-β3有可能是人体内天然的抗瘢痕形成因子。目的：通过外源性TGF-β3对增生性瘢痕成纤维细胞(HSFB)生长增殖及Ⅰ，Ⅲ型胶原及TGF-β1蛋白表达的影响，了解其生物学行为，为临床治疗提供理论依据。设计：随机对照实验研究。地点和对象：汕头大学医学院第二附属医院整形烧伤外科完成，对象为新鲜无菌增生性瘢痕组织，来源于本科收治及门诊手术的增生性瘢痕患者6例，男3例，女3例；年龄5～45岁。干预：6例增生性瘢痕成纤维细胞体外培养，分为4组，实验组又分为5，10，50mg／L组分别加TGF-β3 5，10及50mg／L，对照组加入FBM 1．5mL，采用MTT比色法测定TGF-β3对HSFB增殖活性的影响，^3H-脯氨酸掺入法测定其胶原合成，免疫组化检测Ⅰ，Ⅲ型胶原及TGF-β1蛋白表达情况。主要观察指标：TGF-β3，对HSFB体外增殖，HSFB I，Ⅲ型胶原及TGF-β1蛋白表达的影响，TGF-β3作用后HSFB胶原合成情况。结果：转化生长因子胁可抑制HSFB细胞增殖，作用120h后实验组细胞密度分别为(6．34&;#177;0．51)，(6．01&;#177;0．38)，(5．24&;#177;0．65)&;#215;10^5／瓶，明显低于对照组(10．69&;#177;0．76)&;#215;10^5／瓶(F=102．432～163．024．P&;lt;0．01)；转化生长因子β3可抑制胶原蛋白合成，实验组(10，50mg／L组)脯氨酸含量分别为(164．01&;#177;70．27)，(151．02&;#177;49．85)min^-1明显低于对照组9231．56&;#177;67．83)min^-1(q=32．124，31．021，P&;lt;0．01)；下调TGFβ1蛋白及Ⅰ型胶原蛋白表达；而对Ⅲ型胶原影响较小。结论：TGF-β1可抑制HSFB细胞增殖，下调TGF-β1蛋白表达，减少胶原合成，显示其具有抗组织纤维化的作用，具有临床应用价值。     

肥厚性瘢痕形态学观察与细胞增殖活性的研究

目的：探讨肥厚性瘢痕的形态学特点及其成纤维细胞增殖活性与其发生的关系。方法：应用光镜和免疫组化染色对61例肥厚性瘢痕、8例正常皮肤进行形态学观察、成纤维细胞平均密度计数和增殖细胞核抗原表达检测。结果：肥厚性瘢痕按其形态改变可分为增厚期、成熟期和消退期，其成纤维细胞平均密度分别为289．45&;#177;40．53、217．75&;#177;30．15、68．23&;#177;24．44，统计处理差异非常显著(F=181．9，P&;lt;0．01)；肥厚性瘢痕增厚期、成熟期、消退期和正常对照组间PCNA标记指数接近(12&;#177;7—17&;#177;8)，各组间均无差异显著性(P&;gt;0．05)。结论：肥厚性瘢痕发展经历了增厚期-成熟期-消退期的病理过程，其成纤维细胞数的多少与细胞增殖活性无关，肥厚性瘢痕的形成并非成纤维细胞增生所致。     

异搏定对人皮肤成纤维细胞增殖的影响

目的：探讨钙离子通道阻滞剂异搏定对人皮肤正常成纤维细胞增殖的作用，为钙离子通道阻滞剂治疗瘢痕过度增生提供依据。方法：实验皮肤标本来源于2002—07／2003—07北京大学第三医院整形外科5例美容手术或植皮手术患者，取冗余全层皮肤组织，患者知情同意。体外培养3～8代的人皮肤正常成纤维细胞，实验分为异搏定组：包括1&;#215;10^-3, 1&;#215;10^-4, 1&;#215;10^-5, 1&;#215;10^-6, 1&;#215;10^-7, 1&;#215;10^-8,1&;#215;10^-9,1&;#215;10^-10mol／L组，分别在细胞培养孔中加入2mL相应浓度异搏定的培养液；氢化可的松组：在细胞培养孔中加入2mL浓度为1&;#215;10^-7mol／L氢化可的松的培养液；对照组：在细胞培养孔中加入2mL体积分数为0．005的新生牛血清的Dulbecco＇s改良的Eade＇s培养基。检测细胞活力采用锥虫蓝染色；细胞增殖状况测定应用^3氚标记的胸腺嘧啶掺入法；观察细胞增殖抑制率[抑制率（1％）=（阴性对照组每分钟脉冲数值-实验组每分钟脉冲数值）／阴性对照每分钟脉冲数值]，取各例样本的平均值。结果：①人皮肤正常成纤维细胞的增殖动力学结果：对照组人皮肤正常成纤维细胞在接种12h开始增殖，24h达到高峰，48h又逐渐降低。②异搏定对人皮肤正常成纤维细胞增殖抑制的浓度效应：各浓度的异搏定对人皮肤成纤维细胞的增殖均有抑制作用，其中1&;#215;10^-6mol／L异搏定与1&;#215;10^-7mol／L氢化可的松对成纤维细胞增殖的抑制率无显著性差异（t=0．135,P=0．896〉0．05）。③浓度为1&;#215;10^-6mol/异搏定对人皮肤正常成纤维细胞增殖抑制的时间效应：氢化可的松在24h时对人皮肤正常成纤维细胞的增殖抑制作用显著高于6，12,48h时[（60．67&;#177;18．94）％比（-19．69&;#177;21．26）％，（10．89&;#177;11．61）％，（37．03&;#177;12．17）％，q=10．867．6．732，3．197；P〈0．051；异搏定在24h时对人皮肤正常成纤维细胞的增殖抑制作用显著高于6，12，48h时[（51．42&;#177;15．30）％比（-16．83&;#177;16．90）％．（1．09&;#177;11．62）％，（17．41&;#177;13．41）％，q=10．566，7．791，5．265，〈0．051；在药物作用48时异搏定对人皮肤正常成纤维细胞的抑制作用低于氢化可的松（t=2．423,P=0．042〈0．05）。结论：不同浓度的异搏定对体外培养人正常皮肤成纤维细胞增殖有抑制作用，异搏定可能通过抑制成纤维细胞的增殖达到治疗瘢痕过度增生的作用。     

结缔组织生长因子反义寡核苷酸对人增生性瘢痕成纤维细胞结缔组织生长因子表达及胶原合成的作用

目的：观察结缔组织生长因子反义寡核苷酸对转化生长因子β1诱导的人增生性瘢痕成纤维细胞结缔组织生长因子mRNA、蛋白的表达和胶原合成的影响。 方法：实验于2005—03／12在哈尔滨医科大学免疫教研室完成。选取哈尔滨医科大学附属第二医院整形美容中心手术标本，包括正常皮肤和增生性瘢痕。将手术中切下的正常皮肤、增生性瘢痕组织在无菌条件下去除表皮后采用组织块贴壁法培养于含体积分数为0．1的胎牛血清的RPM11640培养液中，置37℃，体积分数为0．05的CO2条件下原代培养。经2．5g/L胰蛋白酶消化传代，传代至3～5代时进行实验。实验分4组：①正常皮肤成纤维细胞组。②增生性瘢痕成纤维细胞组。③增生性瘢痕成纤维细胞＋5，0mg／L转化生长因子β1组（简称转化生长因子β1组）。④增生性瘢痕成纤维细胞＋5．0mg／L转化生长因子β1＋结缔组织生长因子反义寡核苷酸组（简称反义寡核苷酸组）。用5．0mg／L转化生长因子β1刺激增生性瘢痕成纤维细胞后，以脂质体介导方法将结缔组织生长因子反义寡核苷酸转染增生性瘢痕成纤维细胞中，用反转录一聚合酶链反应方法和Western Blot方法检测细胞中结缔组织生长因子mRNA和蛋白质的表达；采用^3H-脯氨酸掺入法检测细胞的胶原合成量。 结果：①反转录-聚合酶链反应结果：结缔组织生长因子mRNA在正常皮肤成纤维细胞中无表达，在增生性瘢痕成纤维细胞中表达增强，转化生长因子β1刺激后表达量0．64&;#177;0．32明显高于增生性瘢痕成纤维细胞0．31&;#177;0．14，差异显著（P〈0．01）；反义寡核苷酸组可以大部分抑制结缔组织生长因子mRNA的表达，表达量0．12&;#177;0．62明显低于增生性瘢痕成纤维细胞组和转化生长因子β1组，差异显著（P〈0．01）。②Western印迹结果：蛋白水平趋势与mRNA水平相一致。结缔组织生长因子蛋白在正常皮肤成纤维细胞中无表达，在增生性瘢痕成纤维细胞中表达增强84．63&;#177;11．49，转化生长因子β1刺激后表达量102．89&;#177;14．35明显高于增生性瘢痕成纤维细胞组，差异显著（P〈0．01）；反义寡核苷酸组可以大部分抑制转化生长因子β1的作用，结缔组织生长因子蛋白表达量41．75&;#177;10．56低于增生性瘢痕成纤维细胞组和转化生长因子β1组（P〈0．01）。③结缔组织生长因子反义寡核苷酸对增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成的作用：增生性瘢痕成纤维细胞组、转化生长因子β1组、反义寡核苷酸组的^3H-脯氨酸掺入率分别为5381&;#177;185．8273&;#177;357．2475&;#177;859，转化生长因子β1可以显著增加成纤维细胞胶原的合成（P〈0．01）；而结缔组织生长因子反义寡核苷酸对转化生长因子β1刺激后的成纤维细胞胶原合成有明显抑制作用，差异显著（P〈0．01）。 结论：结缔组织生长因子反义寡核苷酸能够抑制转化生长因子β1引起的结缔组织生长因子mRNA、蛋白质表达的增高和胶原合成的增多，表明阻断结缔组织生长因子可能是延缓瘢痕纤维化的有效手段。     

几丁糖对不同来源成纤维细胞分泌细胞因子的影响

目的 观察几丁糖对增生性瘢痕和瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞分泌转化生长因子β1(TGF-β1)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，白细胞介素8(IL-8)的影响，探讨几丁糖对异常瘢痕成纤维细胞生物学活性的作用。方法 以瘢痕疙瘩及增生性瘢痕成纤维细胞为研究对象，正常皮肤成纤维细胞为对照，用组织块法进行不同标本成纤维细胞体外培养。用定量酶联检测试剂盒测定TGF-β1、bFGF、IL-8等。结果 几丁糖对不同来源成纤维细胞分泌TGF-β1、bFGF、IL-8的能力作用不同。不同含量几丁糖作用后,TGF-β1、bFGF分泌量逐渐减少，IL-8分泌量逐渐增加。无几丁糖和相同含量下，TGF-β1、bFGF分泌量，瘢痕疙瘩组与增生性瘢痕组无显著差别(t=0．7，P&;gt;0．05)，两组与正常皮肤组差别显著(t=2．8，P&;lt;0．05)，3组的减少率无显著差异(t=0．5，P&;gt;0．05)。IL-8的分泌量，无几丁糖时3组无显著差异(t=1．2，P&;gt;0．05)；不同含量几丁糖作用下，IL-8分泌量逐渐增加率无显著差异(t=0．8，P&;gt;0．05)。结论 几丁糖可抑制瘢痕疙瘩和增生性瘢痕成纤维细胞分泌TGF-β1、bFGF，促进其分泌IL-8，进而调节成纤维细胞的生长、增殖、合成及分泌胶原的功能。     

维药异常黑胆质成熟剂对增生性瘢痕及转化生长因子β/Smad信号通路的影响

背景：近年来,研究发现异常黑胆质成熟剂具有良好的减轻瘢痕增生的作用,但具体机制尚未清楚,考虑异常黑胆质成熟剂是否是通过影响转化生长因子β/ Smad信号通路的表达来抑制瘢痕增生的。目的：验证维药异常黑胆质成熟剂对体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞增殖及对转化生长因子β/Smad 信号通路的影响。方法：用组织块法培养人增生性瘢痕成纤维细胞,将成纤维细胞分为6组：①空白对照组：加入等体积的培养液。②异常黑胆质成熟剂处理组：分成5组,分别加入质量浓度为0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 g/L的异常黑胆质成熟剂。对各组细胞采用相应药物进行干预,采用MTT、流式细胞术、免疫细胞化学方法检测其在正常状况和应用维药异常黑胆质成熟剂后细胞增殖与转化生长因子β/Smad信号通路的改变。结果与结论：与空白对照组相比,异常黑胆质成熟剂对增生性瘢痕来源成纤维细胞的增殖有抑制作用,且在0.2-0.8 g/L质量浓度范围之间,随着质量浓度增加,抑制作用呈增强趋势。细胞免疫化学结果测定表明,异常黑胆质成熟剂干预后减少了成纤维细胞中转化生长因子β1的含量,增加了细胞中Smad7的含量。提示异常黑胆质成熟剂抑制瘢痕的作用可能是通过转化生长因子β/Smad 通路,使成纤维细胞增殖受阻而发挥作用的。     

体内外不同环境下成纤维细胞丝裂素原激活蛋白激酶的变化

目的：观察脱离体内环境因素时成纤维细胞中信号蛋白表达及细胞生物学特性的变化。方法：瘢痕疙瘩和正常皮肤（作为阴性对照）均来自北京大学第三医院成形科手术患者各6例。取小块瘢痕疙瘩和正常皮肤组织，用组织块接种法进行成纤维细胞原代培养后，进行细胞传代。试验所用为第5-8代细胞。①评价信号蛋白的含量，用体外培养的瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中p44／42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶的积分吸光度值。②评价信号蛋白的活化强度，用体外培养的瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中p44／42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶的平均积分吸光度值。③评价信号蛋白的活化程度用活化率值（磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶积分吸光度值&;#247;p44／42丝裂原活化蛋白激酶积分吸光度值）。结果：①p44／42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶平均积分吸光度值比较：瘢痕疙瘩成纤维细胞均低于正常皮肤成纤维细胞（0．023&;#177;0．005和0．025&;#177;0．005，0．030&;#177;0．000和0．042&;#177;0．004，P〈0．05）。②p44／42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶积分吸光度值比较：瘢痕疙瘩成纤维细胞p44／42丝裂原活化蛋白激酶高于正常皮肤成纤维细胞（6048．7&;#177;1576．2，3006．3&;#177;174．4，P〈0．05），瘢痕疙瘩成纤维细胞磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶与正常皮肤成纤维细胞无差异（4876．0&;#177;895．8，3966．5&;#177;533．1，P〉0．05）。③p44／42丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶活化率比较：瘢痕疙瘩成纤维细胞低于正常皮肤成纤维细胞（0．830&;#177;0．134，1．319&;#177;0．156，P〈0．05）。结论：成纤维细胞在脱离生物体内环境后，其生物学特性发生改变。体外细胞培养中，磷酸化的p44／42丝裂原活化蛋白激酶的表达水平在瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞间无明显差别，而p44／42丝裂原活化蛋白激酶的活化程度和活化强度在正常皮肤成纤维细胞明显高于瘢痕疙瘩成纤维细胞。     

青蒿琥酯对人肺成纤维细胞TGF-β1/smad通路的影响

目的:研究青蒿琥酯对人肺成纤维细胞(HFL-I)的TGF-β1/smad通路及其对细胞增殖的影响。方法:使用青蒿琥酯和重组人TGF-β1刺激因子的干预下对HFL-I在体外培养,然后Western bloting(WB)检测TGF-β1、Smad3和Smad7蛋白的表达;并使用流式细胞仪检测细胞周期。结果:青蒿琥酯可抑制TGF-β1及Smad3蛋白的表达(P<0.05),刺激Smad7的磷酸化蛋白的表达(P<0.05);对Smad3非磷酸化蛋白无影响;对青蒿琥酯处理的HELF细胞使用重组人TGF-β1刺激因子可使TGF-β1蛋白的表达升高(P<0.05),磷酸化的Smad3蛋白的表达升高(P<0.05)。HELF细胞经过青蒿琥酯处理后细胞主要停滞于G1期,经过重组人TGF-β1刺激因子处理的细胞主要分布于S期。结论:青蒿琥酯可以通过TGF-β1/smad通路对HFL-I有抑制的作用,抑制的细胞停滞在细胞周期的G1期。