百日咳杆菌荧光定量PCR检测方法的建立和应用

目的 建立快速、准确、特异的定量检测百日咳杆菌的方法,并进行临床应用研究.方法 根据百日咳杆菌IS481基因序列,设计并合成引物和荧光探针,建立百日咳杆菌荧光定量PCR检测方法,并对方法的特异度、重复性和灵敏度进行评价,检测百日咳疑似患者咽拭子225份和健康者咽拭子30份.结果 该方法的标准曲线显示模板浓度在102～108拷贝/μl线性范围与其循环阈值(Ct)具有较好的线性关系,相关系数(r)为0.998,最小检出量为102拷贝.特异度较好,灵敏度较高,重复性实验结果显示在同一时间检测高低浓度阳性克隆质粒(2×107与3×103拷贝/μ1)10次,连续检测5次,变异系数(CV)为5.78%～16.7%.在不同时间检测高低浓度阳性克隆质粒(2×107与3×103拷贝/μl),连续7次,CV为8.25%～14.9%.经检测,疑似患者的咽拭子有41份样本为阳性,30份健康人咽拭子均为阴性.结论 由于本实验建立的荧光定量PCR方法快速、灵敏度高、特异度好,适合临床实验室进行临床标本的百日咳杆菌的定量检测,有较大的应用前景.     

炭疽芽孢杆菌特异性基因序列双重TaqMan聚合酶链反应快速检测体系的建立

目的 以炭疽芽孢杆菌的主基因和致病毒素基因pagA特异性序列为检测标志，建立高敏感、高特异的荧光双重实时TaqMan聚合酶链反应快速检测体系。方法 根据炭疽杆菌主基因组特异性序列（Gs）和特异的毒力岛pagA基因序列（Pag）设计引物及探针，通过构建目的质粒获得标准模板，利用TaqMan标记探针和便携式Smartcycle实时聚合酶链反应检测平台探讨该检测体系的检测敏感性和特异性。结果该体系炭疽芽孢杆菌的检测敏感度为10^2拷贝每反应体系，与其他蜡样杆菌群细菌未出现非特异性扩增，具有较高的特异性。整个反应在1h内完成，适合于实验室或野外环境下炭疽芽孢杆菌的快速检测。结论 本研究建立的双重TaqMan实时聚合酶链反应检测体系可作为炭疽芽孢杆菌快速、准确、特异、敏感的检测手段。     

嗜肺巴斯德菌TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用研究

目的 建立嗜肺巴斯德菌的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法.方法 针对嗜肺巴斯德菌16SrRNA基因设计特异性引物和探针,建立嗜肺巴斯德菌TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的特异度、敏感度和稳定性.对2008～2011年采集的1 680份样本进行检测.结果 嗜肺巴斯德菌TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法具有高度特异性,对多杀巴斯德菌、产气巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌均无交叉反应,检测灵敏度达22拷贝.标准曲线显示备浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.488,PCR效率为100％.荧光定量PCR检测1 680份样本,检出137份嗜肺巴斯德菌阳性.该方法可直接从样本中特异性地检出嗜肺巴斯德菌.结论 TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法具有灵敏、特异、稳定的特性,适用于嗜肺巴斯德菌的快速检测.     

快速鉴定结核杆菌的双重分子信标检测体系的优化

目的优化双重分子信标的实验体系以快速检测结核杆菌及其耐药菌株。方法选择不同镁离子浓度、退火温度、引物浓度分别进行荧光定量PCR,最终得出最佳反应条件。结果为保证扩增效率且无非特异性扩增,最终选择最佳条件是:Mg~(2+)浓度3.0mmol/L;退火温度60℃;引物浓度0.3mmol/L。结论确立了双重分子信标实验的最优条件,从而保证了分子信标荧光定量PCR检测结核杆菌具有操作简便、快速、灵敏度高(最低可检测1CFU/mL)、特异性强(只能检测包括耐药菌株的结核杆菌复合群)、重复性好(变异系数5%)等优势,为双重分子信标检测结核杆菌提供了必要条件。     

实时荧光定量PCR检测人粪便中空肠弯曲杆菌方法的建立与评价

目的：建立一种快速检测人粪便样本中空肠弯曲杆菌的实时荧光定量 PCR方法。方法根据空肠弯曲杆菌保守序列设计特异引物,建立空肠弯曲杆菌的实时荧光定量 PCR检测法。对该方法的线性范围、抗干扰能力进行考察。同时采用培养法和实时荧光定量 PCR法对150例粪便样本进行检测,以培养法检测结果作为参照标准,对实时荧光定量 PCR方法的灵敏度、特异度、准确度和重复性进行考察。采用 Kappa检验对两种检测方法的结果进行统计学分析。结果建立的实时荧光定量PCR方法标准曲线线性关系良好Y＝-3.51 Log（X）＋37.09,相关系数为0.996,理论检测下限为102 CFU/ml。抗干扰能力强,仅空肠弯曲杆菌出现特异性扩增曲线。与培养法相比,其灵敏度、特异度、准确度分别为92.4％,95.8％和94％;检测结果重复性良好（CV％＜5％）。统计学分析显示两种方法检测结果具有一致性,且一致性强度为极强（Kappa＝0.88,P＜0.05）。结论实时荧光定量PCR法能准确快速检测粪便样品中的空肠弯曲杆菌。     

鲍曼不动杆菌耐药性快速检测方法的建立与评估

目的评估对实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)快速检测鲍曼不动杆菌耐药性方法的效果。方法设计鲍曼不动杆菌(ATCC 19606)外膜蛋白A特异性探针,采用实时荧光定量PCR准确测定63株鲍曼不动杆菌经一定浓度庆大霉素、米诺环素、美罗培南、左氧氟沙星和头孢哌酮/舒巴坦孵育后的生长情况,比较抗菌药物孵育0和6h后鲍曼不动杆菌基因组DNA量,判断鲍曼不动杆菌耐药性,并与微量肉汤稀释法结果进行对比。结果建立的实时荧光定量PCR检测鲍曼不动杆菌耐药性方法与微量肉汤稀释法一致性高,Kappa值为0.879,P0.05。以微量肉汤稀释法为参考方法,实时荧光定量PCR的符合率达93.97%,灵敏度为92.53%,特异性为95.74%,阳性预测值为96.41%,阴性预测值为91.22%,Youden指数为0.88。结论实时荧光定量PCR与微量肉汤稀释法结果有高度一致性,且前者灵敏度高、特异性强、检测速度快,可用于快速检测鲍曼不动杆菌的耐药性。     

新型荧光定量PCR检测孕妇生殖道解脲脲原体方法的建立

目的 探讨建立自身淬灭探针荧光定量PCR方法检测解脲脲屏体（Uu）的可行性及价值。方法 根据Uu UreA基因序列设计合成引物和自身淬灭引物，采用基因克隆技术，将UreA基因片段插入到载体pMD18-T，以此作为标准品。优化PCR条件，建立以自身淬灭引物技术为平台的实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）方法，并对所建立的方法进行初步方法学评价。结果 成功构建了重组质粒pMD18-T-UreA；建立了以自身淬灭探针技术为基础的实时荧光定量PCR方法，其线性检测范围为10^1～10^9copies／μl；灵敏度为10copies／μl；重复性实验批内CV为2．35％，批间CV为3．68％，天间CV为4．92％；特异性好；通过初步临床应用发现，所建立的FQ-PCR方法与经典的培养方法相比，不仅能实时监测反应进程、绝对定量和快速检测，且检出率显著高于培养方法。结论自身淬灭探针荧光定量PCR方法检测Uu具有快捷、敏感、廉价等优点，可在临床诊断中应用。     

IgH重排的实时定量PCR检测及反应参数研究

为了探讨以通用引物应用PCR技术扩增克隆性免疫球蛋白重链基因（IgH）重排的最佳实验条件及SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测该基因的可行性，以通用引物对克隆性IgH重排进行扩增，对影响PCR扩增的退火温度、引物浓度、Taq酶用量、dNTP浓度、镁离子浓度、循环次数等实验因素进行了系统研究，找出最佳反应参数。并以通用引物进行了SYBR greenⅠ实时定量PCR对IgH重排基因的检测，测定了该法检测IgH重排基因的敏感性。结果表明：最佳退火温度为60℃，最佳引物浓度为0．8μmol／L，0．5U的Taq酶量效果满意，最适dNTP浓度为100μmol／L，最适镁离子浓度为3．0mmol／L，最佳循环次数为40次。SYBR GreenⅠ实时定量PCR可以实现对克隆性IgH重排的扩增和荧光信号的检测分析，其对IgH重排基因检测的敏感性为10^4／ml。结论：确定了应用PCR技术检测克隆性IgH重排的最适反应条件，实现了用通用引物对克隆性IgH重排稳定、特异的扩增，初步实现了以通用引物和应用SYBR Green Ⅰ实时定量PCR对IgH重排的检测。     

分子信标荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的反应体系优化方法对比研究

目的建立分子信标荧光定量PCR检测结核分技杆菌的最佳反应体系,探讨影响分子信标荧光定量PCR扩增结果的多个因素。方法利用单因素法和正交实验法,从MgCl2,引物,分子信标探针,dNTP,Taq DNA聚合酶5种因素对分子信标荧光定量PCR反应体系进行优化,并对这两种方法所得的最优体系进行比较。结果单因素法得到的最优反应体系（25μl）为：4mmol／L MgCl2,上、下游引物各0．3μmol／L,分子信标探针0．1μmol／L,200μmol／L dNTP,2U Taq DNA;正交法得到的最优反应体系（25μl）为：6mmol／L MgCl2,上、下游引物各0．2μmol／L,分子信标探针0．1μmol／L,100μmol／L dNTP,3U Taq DNA聚合酶,正交法得到的最优反应体系的荧光定量PCR扩增曲线形状更好,Q值较小,△Rn较大。结论采用正交法得到的荧光定量PCR反应体系优于单因素法,进行实时荧光定量PCR反应体系优化时,正交实验设计是一条科学、可靠、高效、快捷的途径。     

荧光定量PCR定量检测5种假丝酵母菌方法的建立

目的建立并评价从血液标本中检测5种假丝酵母菌的荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法。方法以5种假丝酵母菌共有的高度保守序列为靶序列,设计特异引物和探针进行检测,优化定量PCR体系,并进行方法学评价。结果建立的荧光定量PCR方法,其线性范围为101~109CFU/m L;灵敏度为5 CFU/m L;批内和批间CV值均5%;对19份模拟血液标本进行检测,其中分别含有5种假丝酵母菌的标本均为阳性,而分别含有常见血液感染曲霉菌和细菌的检测结果均为阴性。结论建立的检测血中假丝酵母菌荧光定量PCR方法快速、准确,结果可靠,可对常见的临床血液感染假丝酵母菌进行定量检测。     

A novel semiquantitative fluorescence-based multiplex polymerase chain reaction assay for rapid simultaneous detection of bacterial and parasitic pathogens from blood

A multiplex polymerase chain reaction assay was developed for the rapid simultaneous detection of category A select bacterial agents (Bacillus anthracis and Yersinia pestis) and parasitic pathogens (Leishmania species) in blood using the Cepheid Smart Cycler platform. B. anthracis (Sterne) and Yersinia. pseudotuberculosis were used in the assay for optimization for B. anthracis and Y. pestis, respectively. The specificity of the target amplicons [protective antigen gene of B. anthracis and rRNA genes of other pathogens or human (internal control)] was evaluated by staining the amplicons with SYBR Green I and determining their individual melting temperatures (T(m)). As a novel approach for pathogen semiquantitation, the Tm peak height of the amplicon was correlated with a known standard curve of pathogen-spiked samples. This assay was able to detect DNA in blood spiked with less than 50 target cells/ml for all of the pathogens. The sensitivity of this assay in blood was 100% for the detection of Leishmania donovani from leishmaniasis patients and B. anthracis (Sterne) from symptomatic mice. The time necessary for performing this assay including sample preparation was less than 1.5 hours, making this a potentially useful method for rapidly diagnosing and monitoring the efficacy of drugs or vaccines in infected individuals.     

Real-time PCR system targeting a chromosomal marker specific for Bacillus anthracis

Specific identification of Bacillus anthracis and differentiation from closely related Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains is still a major diagnostic problem. Commercially available diagnostic kits targeting plasmid-markers cannot differentiate between B. anthracis, non-anthracis Bacillus species harbouring anthrax-specific virulence plasmids, and plasmidless B. anthracis strains. A TaqMan PCR assay was designed targeting sequences of gene locus BA_5345 of the B. anthracis strain Ames. Specificity was determined by using a panel of 328 Bacillus strains; sensitivity was determined by probit analysis. All B. anthracis isolates (n=92) were specifically detected by using the genomic TaqMan PCR assay whereas 236 strains belonging to 19 Bacillus species other than B. anthracis were PCR negative. The detection limit was determined to be 12.7 copies per reaction (95% confidence interval 10.2-17.5 copies). Here we present an extensively evaluated and - to our current knowledge - specific TaqMan PCR assay for the detection of B. anthracis based on a chromosomal marker.     

空肠弯曲菌 TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量 PCR快速检测

目的　开发一种特异、灵敏的TaqMan MGB 双重探针实时荧光定量PCR 方法,用于空肠弯曲菌的快速定量检 测。方法　针对空肠弯曲菌鞭毛蛋白A 和马尿酸酶基因设计特异性引物和探针,建立一种新型TaqMan-MGB 双重探针 实时荧光定量PCR 检测空肠弯曲菌方法,对该方法的定量检测线性范围、特异度、灵敏度、重复性、稳定性进行评价, 应用该方法对临床标本中的空肠弯曲菌进行检测,同时用细菌培养、普通PCR、基因克隆和测序鉴定。结果　建立的 空肠弯曲菌TaqMan MGB 双重探针实时荧光定量PCR 检测方法专属性强,能准确检出空肠弯曲菌,而与其他细菌无交 叉反应,特异度为100%。该技术灵敏度高,能精确定量检测空肠弯曲菌DNA 线性范围达10 个数量级,最低检测限为 4 个菌落形成单位。重复性和稳定性良好,组内和组间相对标准偏差均小于1%。应用该方法成功从78 例临床标本中定 量检出28 例空肠弯曲菌阳性标本,用普通PCR 和基因克隆测序分析确认,细菌培养方法仅获得6 株存活的空肠弯曲菌。 结论　TaqMan MGB 双重探针实时荧光定量PCR 具有快速简便、可靠稳定、特异灵敏的优点,可用于临床标本中空肠 弯曲菌定量检测,值得推广应用。     

应用噬菌体进行炭疽疫苗纯菌检查方法的建立

目的 建立应用噬菌体进行炭疽活疫苗纯菌检查的方法,并与现用纯菌检查方法进行比较.方法 使用噬菌体对与炭疽芽孢杆菌分类学上接近以及常见污染细菌进行裂解观察,确定噬菌体特异性.选取具有代表性的可能污染菌定量掺入炭疽疫苗中,制备模拟污染疫苗,进行噬菌体裂解纯菌检查方法的灵敏度研究,同时与现用的直接接种纯菌检查方法进行比较.结果 炭疽噬菌体能特异地裂解炭疽芽孢杆菌,对与炭疽芽孢杆菌分类学上接近以及常见污染细菌无裂解作用.噬菌体裂解法对掺入炭疽疫苗中蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌及大肠埃希菌的检出限均为1 CFU/人份,而现用纯菌检查方法的检出限分别为5、5及50 CFU/人份.结论 噬菌体裂解法检测炭疽活疫苗中污染菌有较好的特异性和灵敏度,该方法的应用对疫苗质量控制具有重要意义.     

TaqMan实时荧光定量PCR检测艰难梭菌

目的 建立特异敏感的实时荧光定量PCR方法,用于艰难梭菌的快速检测;评价基于纯培养艰难梭菌和粪便中艰难梭菌的2种标准曲线;并应用该荧光定量PCR法对急性艰难梭菌感染（CDI）的小鼠进行粪便含菌量检测评价。方法 针对艰难梭菌基因组中16S rRNA序列设计特异性引物和探针,建立一套快速检测艰难梭菌含量的实时荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、灵敏性;绘制艰难梭菌纯菌浓度梯度稀释标准曲线和粪便中同浓度梯度艰难梭菌的标准曲线,比较两者的差异;用艰难梭菌高毒株NAP1/027感染用抗生素处理的C57BL/6小鼠,建立CDI小鼠模型,同时应用该荧光定量PCR和活菌培养法定量检测小鼠粪便中的艰难梭菌含量变化。结果 建立的TaqMan实时荧光定量PCR具有较高的灵敏性和特异性,生成标准曲线的相关系数为0.999 8,斜率为-3.400 4;用纯培养艰难梭菌和粪便中艰难梭菌分别制备标准曲线,结果表明2种标准曲线定量检测结果差异无统计学意义。建立CDI小鼠模型,应用该荧光PCR能有效、准确的检测出粪便中艰难梭菌的含量,可替代费时费力的活菌培养计数法。结论 用纯培养艰难梭菌来制备标准曲线不影响对含菌粪便标本的准确定量检测,荧光定量PCR能准确快捷地检测CDI小鼠粪便中的艰难梭菌含量,比活菌计数更快速和方便,可用于艰难梭菌感染小鼠模型中小鼠肠道内艰难梭菌定植的定量检测。     

Identification of Bacillus anthracis by multiprobe microarray hybridization

We have developed a rapid assay based on microarray analysis of amplified genetic markers for reliable identification of Bacillus anthracis and its discrimination from other closely related bacterial species of the Bacillus cereus group. By combining polymerase chain reaction (PCR) amplification of six B. anthracis-specific genes (plasmid-associated genes encoding virulence factors (cyaA, pagA, lef, and capA, capB, capC) and one chromosomal marker BA-5449) with analysis of amplicons by microarray hybridization, we were able to unambiguously identify and discriminate B. anthracis among other closely related species. Bacillus identification relied on hybridization with multiple individual microarray oligonucleotide probes (oligoprobes) specific to each target B. anthracis gene. Evaluation of the assay was conducted using several B. anthracis strains (with or without pXO1 and pXO2 plasmids) as well as over 50 other species phylogenetically related to B. anthracis, including B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides, and B. subtilis. The developed microarray analysis of amplified genetic markers protocol provides an efficient method for (i) unambiguous identification and discrimination of B. anthracis from other Bacillus species and (ii) distinguishing between plasmid-containing and plasmid-free Bacillus anthracis strains.     

一起疑似炭疽疫苗菌株毒力恢复事件中炭疽芽孢杆菌的毒力鉴定与分析

目的 对某校疑似炭疽疫苗菌株毒力恢复事件（事件）中,教学实验使用的炭疽芽孢杆菌毒力及其环境污染情况进行鉴定和调查,为合理处理该事件提供参考依据。 方法 调查事件发生的情况、采集实验用培养物、冻存菌株和实验室环境样本。 对实验用培养物进行噬菌体裂解和青霉素敏感试验鉴定;选取炭疽芽孢杆菌的rpoB基因和毒力相关的pagA和capC基因,应用TaqMan荧光探针法对采集样本进行检测。 结果 实验用培养物的噬菌体裂解试验显示有明显的噬菌斑,青霉素敏感试验显示在青霉素纸片周围有明显的抑菌环,并且培养物和冻存菌株rpoB和pagA基因检测为阳性,capC基因检测为阴性;教学场所的环境样本rpoB、pagA和capC基因检测均为阴性。 结论 该事件中实验用培养物和冻存菌株均为缺少capC基因的减毒炭疽芽孢杆菌,未发现毒力恢复情况;教学场所中无炭疽芽孢杆菌的污染。      

The development and testing of a molecular biological test system for DNA detection of anthrax pathogen by real-time polymerase chain reaction assay

The paper presents the results of the development and testing of a molecular biological test system for DNA detection of anthrax pathogen (Bacillus anthracis) by real-time polymerase chain reaction assay. The test system has shown high sensitivity, specificity, and reproducibility of results of analysis, as exemplified by aqueous suspensions of daily agar cultures of Bacillus anthracis strains, related and heterologous species of microorganisms, and clinical materials of experimental animals. There is evidence for the persistence of the basic characteristics of the test system when stored at 22 +/- 2 degrees C for 12 months.