冷冻保存对人卵母细胞纺锤体及发育潜能的影响

背景:卵子冷冻技术的发展为人类辅助生殖技术带来重大的突破,但卵子冷冻的效果并不理想.目的:研究冷冻保存对不同成熟时期人卵母细胞纺锤体及发育潜能的影响.设计、时间及地点:随机对照细胞学体外实验,于2005-04/2006-05在重庆市妇幼保健院完成.材料:体外受精-胚胎移植和卵胞浆内单精子显微注射治疗周期中剩余的未成熟卵子(GⅤ期和MⅠ期).方法:将未成熟卵子随机分为对照组、MⅠ/GⅤ卵冷冻组和体外成熟后MⅡ卵冷冻组,用慢冻速融的方法对MⅠ/GⅤ卵和体外成熟的MⅡ卵进行冷冻和解冻,应用Polscope对卵子的纺锤体进行观察,并观察卵子的发育潜能.主要观察指标:不同组卵子的纺锤体可见率,体外成熟情况,冷冻不同时期卵子的复苏情况,及后期的受精、卵裂、可用胚胎情况.结果:对照组纺锤体可见率77.3%,明显高于MⅡ卵冻融组、MⅠ/GV卵冻融组(56.3%,53.8%,P<0.05),冷冻造成了纺锤体的损伤;冷冻后未成熟卵的体外成熟率下降,但无统计学差异;MⅡ期卵、MⅠ期卵和GⅤ期卵复苏率相似;对照组的受精率(81.8%)明显高于MⅡ卵冻融组、MⅠ/GⅤ卵冻融组(62.5%,59.0%,P<0.05),冷冻后的卵子受精能力受到损害;对照组的卵裂率与MⅡ卵冻融组差异无显著性意义(84.4%,72.7%,P>0.05),MⅡ卵冷冻组的卵裂没有受到明显影响;对照组的卵裂率与MⅠ/GⅤ卵冻融组差异有显著性意义(84.4%,52.9%,P<0.05),MⅠ/GⅤ卵冻融后卵裂率明显下降;冷冻组的胚胎质量下降,可用胚胎率明显降低.结论:控制性超排卵周期中剩余的未成熟卵子无论是直接冷冻还是先体外培养成熟后再冷冻,卵子的纺锤体都受到了一定的损伤,对卵子的发育潜能造成了影响.     

不同成熟阶段、不同来源的人类卵子冷冻后发育潜能的比较

目的:探索卵子冷冻的成熟阶段及来源。方法:将153个不同来源的生发卵泡期(GV期)人类卵子分为3组,未冷冻组,体外培养至成熟阶段(MⅡ期),行单精子胞浆内注射(intracytoplasmicsperminjection,ICSI);MⅡ期冷冻组,体外成熟至MⅡ期,然后将MⅡ期卵子进行冷冻,解冻后将存活的卵子行ICSI;GV期冷冻组,将GV期卵子进行冷冻,解冻后体外培养至MⅡ期,然后再行ICSI。观察解冻后卵子存活情况、体外成熟情况、受精情况及胚胎发育情况。结果:(1)冷冻对卵子具有一定程度的损伤,但GV期冷冻组的存活率、受精率显著高于MⅡ期冷冻组。(2)促排周期来源的卵子的体外成熟率高于孕期及自然周期来源的卵子,孕期来源的未成熟卵子冷冻后具有一定的发育潜能。结论:在GV期进行冷冻可降低冷冻对卵子的伤害;孕期来源的未成熟卵子冷冻后具有一定的发育潜能。     

急性髓细胞白血病的克隆性白血病祖细胞对冷冻保存高度敏感:对自体骨髓移植可能有净化作用

作者研究了急性髓细胞白血病祖细胞(AML—CFU)对冷冻保存的内在敏感性.将5例AML患者的骨髓和4例正常人骨髓分别采用6种不同的方法,包括改变冷冻液,冷冻防护液浓度.血清种类,容器内型,冷冻速率和贮存方法进行冷冻保存,冻融后测定每种方法冻存后AML-CFU及粒单系祖细胞(CFU-GM)和红系爆式集落形成单位(BFU-E)的回收率。结果,每种冻存技术的平均祖细胞回收率在不同的冷冻方法间无不匀一的变动和差异(P>0.40),6种研究方法的冻存效果相似.CFU-GM和BFU-E显示类似的冻存敏感性,回收率分别为48.4     

印迹基因Snrpn在人类卵母细胞及植入前胚胎mRNA表达

目的了解印迹基因Snrpn在人类卵母细胞和植入前胚胎的表达,以分析Snrpn基因表达对人类卵母细胞和早期胚胎发育的影响。方法采用单细胞巢式逆转录多聚酶链式反应(Single Cell Nested RT-PCR)方法,检测人类卵子和植入前各个阶段胚胎的印迹基因Snrpn mRNA表达情况。结果Snrpn在人类卵母细胞GV、MI、MII和植入前胚胎2、4、6、8细胞期都有表达,单卵母细胞扩增成功率为87.5%,单个胚胎为75.8%,平均扩增成功率为79.1%。单个卵母细胞和单个卵裂球扩增成功率无显著性差异(P>0.05),但单卵母细胞较单个卵裂球高。结论建立了比较稳定、可靠的单细胞巢式RT-PCR技术检测基因表达。印迹基因Snrpn在人类卵细胞和植入前胚胎的表达对卵子生长和胚胎发育有着重要意义,为早期胚胎阶段该基因表达正常图谱提供实验依据     

小鼠骨髓源性树突状细胞培养与冻存

背景:树突状细胞因其良好的抗原提呈功能及促T细胞增殖功能,成为肿瘤抗原的良好载体.获得大量的树突状细胞,对于肿瘤疫苗的研制具有重要作用.目的:对小鼠骨髓树突状细胞进行诱导、培养、扩增及冻存,并对比冻存后复苏细胞与未冻存细胞的细胞特性,寻找一种能够大量获得树突状细胞及有效储存的方法.方法:取小鼠骨髓细胞,在含重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(10 μg/L)和重组小鼠白细胞介素4(5 μg/L)的完全培养基中对其进行诱导、培养及扩增.培养第6天,对培养获得的树突状细胞在加有冷冻保护剂DMSO的完全培养液中冻存.复苏后,在培养基中加入脂多糖、对细胞诱导,获得大量的成熟树突状细胞,最终获得的树突状细胞与未进行冻存的细胞在细胞活力、形态学、细胞表型、混合淋巴细胞反应等方面对比.结果与结论:复苏后,(82.2±4.73)%细胞存活,存活的细胞经脂多糖诱导后发育为成熟树突状细胞,在形态学、细胞表型及混合淋巴细胞反应等方面与未经冻存的树突状细胞差异无显著性意义.提示小鼠骨髓源性树突状细胞冻存复苏后,细胞生物学特性与未冻存的细胞无明显差别,用冻存的方法储存树突状细胞,能够避免在不同时期应用细胞时反复进行培养,可以获得大量的同质细胞.     

人外周血树突状细胞低温保存的优化研究

目的探寻冻存树突状细胞(DCs)优化的冷冻保护剂组合。方法配制含不同浓度二甲基亚砜(DM-SO)的3种冷冻保护剂组合,A组:5%DMSO+6%羟乙基淀粉(HES)+4%人血清白蛋白(HAS);B组:10%DMSO+40%FCS;C组:12%DMSO+40%FCS,比较3组冷冻保护剂对人外周血CD14+单个核细胞诱导产生的成熟树突状细胞(mDCs)的冻存效果:采用两步法将mDCs冻存于-80℃冰箱过夜后转移至-196℃液氮气相中放置24 h,再将冻存的mDCs复苏后继续培养,并检测、比较冻存前后DC的形态、存活率、细胞表型及其对同种异体T细胞刺激活性的差异。结果 3组不同组合冷冻保护剂冷冻保存的mDCs复苏后其存活的细胞的形态没有发生明显改变,仍保留其成熟表型,并具备对T细胞的刺激活性。结论 3种不同浓度的DMSO冷冻保存mDCs,5%DMSO+6%HES+4%HSA组合更适宜。     

生长激素对卵巢储备功能减低患者卵泡发育的影响

[目的]探讨重组人生长激素(Growth Hormone,GH)对体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗中的卵巢储备功能减低(Decreased Ovarian Reserve,DOR)患者卵泡发育的影响.[方法]收集接受IVF-ET治疗的DOR患者20例,根据患者意愿分为观察组(11例,使用GH)和对照组(9例,未用GH).于取卵日收集两组患者单个优势卵泡(直径≥16 mm)的卵泡液,应用Western Blot方法半定量检测每个卵泡的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、IGF-1受体(IGF-1R)、GH水平,评估其与卵子质量、胚胎质量、妊娠结局的相关性.[结果]两组促性腺激素(Gn)总量、Gn用药天数、优胚率、周期取消率比较差异无统计学意义(P＞0.05);观察组取卵日优势卵泡数、获卵数与MII卵子数明显高于对照组(P＜0.05);GH组临床妊娠率25％,对照组无临床妊娠.两组卵泡液GH水平与IGF-1、IGF-1R水平成正相关(R=0.55与0.58).观察组卵泡液GH水平显著高于对照组(P＜0.05),而IGF-1、IGF-1R水平比较差异无统计学意义(P＞0.05).MII卵泡液IGF-1R、GH水平均高于同组无MII卵泡(P＜0.05),高于对照组MⅡ卵泡(P＜0.05);GH组无MⅡ卵泡液IGF-1、IGF-1R、GH水平与对照组MII卵泡比较差异无统计学意义(P＞0.05),但高于对照组无MII卵泡液水平.[结论]对IVF治疗中的DOR患者添加GH,有利于提高患者卵泡液中IGF1与IGF1R水平,有利于卵泡成熟及提高卵子质量.     

卵母细胞的体外成熟

卵母细胞的体外成熟(in vitro maturation, IVM)是指将GV期或GV前期的卵母细胞在体外培养,达到次级卵母细胞(MII),能够正常受精、发育和着床,包括完整的卵泡培养[1]和单纯的卵丘复合体培养.目前应用于辅助生殖技术的主要限于后者.     

趋化因子受体7基因绿色荧光慢病毒载体构建及在未成熟树突状细胞中的表达

背景:趋化因子受体7(chemokine receptor-7,CCR7)是树突状细胞从外周迁移至淋巴系统发挥作用的最重要的启动和调节者,但未成熟树突状细胞表面不表达CCR7,因此利用携带CCR7基因的未成熟树突状细胞可以更好地诱导免疫耐受。目的:构建携带小鼠CCR7基因的绿色荧光蛋白重组慢病毒载体,观察其在未成熟树突状细胞中的表达。方法:采用RT-PCR扩增小鼠CCR7基因并克隆至pCR-Blunt载体。将CCR7DNA片段及IRES-GFP连入慢病毒转移质粒LV-Lac,生成重组慢病毒质粒LV-CCR7。采用脂质体转染法将慢病毒系统3质粒(重组慢病毒质粒LV-CCR7、包装质粒ΔNRF及包膜质粒pVSVG)共转染包装慢病毒,重组慢病毒感染未成熟树突状细胞,光学显微镜观察细胞状态,流式细胞术鉴定CCR7蛋白的表达。结果与结论:实验成功扩增出小鼠CCR7DNA片段并克隆至pCR-Blunt载体,亚克隆构建慢病毒表达载体LV-CCR7,经3质粒包装系统感染293FT细胞后,24h于荧光显微镜下均观察到绿色荧光蛋白阳性表达,病毒滴度为108U/L以上,获得携带CCR7基因的重组慢病毒。慢病毒颗粒可有效感染未成熟树突状细胞,荧光显微镜可见大量GFP蛋白表达,阳性细胞达50%,流式细胞术检测到CCR7蛋白表达,LV-CCR7基因修饰的未成熟树突状细胞仍保持在未成熟状态。结果证实,实验成功构建携带小鼠CCR7基因绿色荧光慢病毒载体LV-CCR7,并可在未成熟树突状细胞细胞中表达。     

大鼠胚胎神经干细胞的低温保存

目的建立大鼠胚胎神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的低温保存方法,探讨经冻存后NSCs的存活及生物学特性变化。方法使用二甲基亚砜(DMSO)做NSCs的冷冻保护剂于液氮中冻存。复苏后用间接免疫荧光染色方法对细胞的存活、形态及分化能力做鉴定。结果不同冻存时间及代数的NSCs复苏后存活率无明显差异(P>0.05),且仍能在体外多次传代,并可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论大鼠NSCs低温冻存、复苏并不影响其原有的形态、增殖及多向分化等生物学特性。     

严重精液异常冻融精子与新鲜精子进行卵胞浆内单精子注射后受精比较

目的了解严重精液异常的冻融精子与新鲜精子进行卵胞浆内单精子注射(ICSI)后受精比较。方法采用甘油-卵黄作为精子保护剂对15份再次取出的精液标本进行冻存。应用ICSI技术治疗,观察其受精、卵裂结果。在电子显微镜下扫描,观察冷冻前后精子的超微结构及其改变。结果冻融精子的受精率为62.7%,卵裂率为93.6%,新鲜精子的受精率为62.2%,卵裂率为94.5%,两者比较无显著性差异(P>0.05)。电镜扫描显示,新鲜精子头部结构完整,质膜、顶体及尾部均未见明显变化。冻融精子的改变,主要局限在其头部的质膜与顶体膜变皱,破裂甚至丢失,中段线粒体肿胀或破坏,基质密度降低等。结论精子冷冻复苏处理不影响ICSI后的受精率和卵裂率。     

严重精液异常冻融精子与新鲜精子进行卵胞浆内单精子注射后受精比较

目的了解严重精液异常的冻融精子与新鲜精子进行卵胞浆内单精子注射(ICSI)后受精比较.方法采用甘油-卵黄作为精子保护剂对15份再次取出的精液标本进行冻存.应用ICSI技术治疗,观察其受精、卵裂结果.在电子显微镜下扫描,观察冷冻前后精子的超微结构及其改变.结果冻融精子的受精率为62.7%,卵裂率为93.6%,新鲜精子的受精率为62.2%,卵裂率为94.5%,两者比较无显著性差异(P＞0.05).电镜扫描显示,新鲜精子头部结构完整,质膜、顶体及尾部均未见明显变化.冻融精子的改变,主要局限在其头部的质膜与顶体膜变皱,破裂甚至丢失,中段线粒体肿胀或破坏,基质密度降低等.结论精子冷冻复苏处理不影响ICSI后的受精率和卵裂率.     

一种不用程控降温在—80℃冷冻保存外周血干细胞的简便方法

通常外周血单个核细胞(PBMCs)经控速降温后在液氮(LN_2)中保存。该方法存在三个问题:(1)如果外周血干细胞(PBSCs)单用二甲基亚砜(DM-SO)冷冻,那么解冻后回输时常常会出现细胞凝块(clumping)。(2)程控降温和液氮保存操作复杂。(3)重复单采大量PBMCs,冷冻保存所需的空间和液氮的需用量增加。为获得简单理想的冷冻保存方法,本文介绍了一种用细胞外冷冻防护剂羟乙基淀粉(HES,它可以降低解冻后细胞的溶解和凝块的形成)和DMSO 作为PBMCs 的冷冻防护液,不经程控降温在—80℃冰箱中保存的方法。在小样品试验中,用7种不同浓度的HES 和DMSO 冻存外周血的回收率分别是92±3.5%,734.8±4.1%和82.2±6.9%,胎盘兰拒染率88.4±3.6%,明显高于单用5%或10%DMSO冻存的结果。样品冻存5—18个月时CFU-GM 保持     

同种异体骨移植治疗骨肿瘤的体会

目的采用深低温冷冻同种异体骨移植修复骨肿瘤瘤体切除术后骨缺损,观察其疗效.方法应用深低温冷冻同种异体骨移植修复骨肿瘤瘤体切除术后骨缺损,根据部位不同,选择合适内固定.结果本组28例均获得1～7年随访,平均3.8年.良性肿瘤均无瘤存活,恶性肿瘤无瘤存活13例,带瘤存活3例,死亡2例.结论采用同种异体骨移植治疗骨肿瘤、骨缺损是一种切实可行的有效方法.     

液氮冷冻法治疗皮肤增生性疾病214例分析

目的 研究液氮冷冻法治疗皮肤增生性疾病的疗效.方法 利用棉签蘸取液氮冷冻皮肤增生性病变部位,冷冻范围约超出病变范围1～2 mm,每个疗程冻融3次,两次冻融间隔时间为5 min.治疗后随访3个月观察疗效.结果 在214例皮肤增生性患者中,痊愈170例,好转43例,无效1例,总有效率99.5％.结论 液氮冷冻法治疗皮肤增生性病变疗效良好,是一种不良反应轻微、易于操作和价格低廉的方法.     

支气管镜引导下的腔内CO2冷冻治疗

CO2冷冻是根据焦耳-汤姆逊原理，在冷冻探针的前段形成一定大小的冰球，可分为冻切和冻融两种冷冻方式。对体积较大的病变可采用冻切的方法，将大部分病变粘结取出：而对比较表浅的痫变，可采用冻融的方法，使病变组织慢慢坏死。冷冻治疗的效果及并发症的发生与操作者和麻醉师的技术和经验、患者情况、肿瘤性质等密切相关。但总的来说，冷冻治疗是清除支气管内阻塞性病变的安全有效方法之一。     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及冻存研究

目的:寻求体外培养、冻存、复苏兔骨髓间充质干细胞(mensechymalstemcells,MSCs)的方法,为兔MSCs进一步的实验研究打下基础。方法:取新西兰白兔胫骨穿刺获取骨髓液,以贴壁筛选法分离、纯化、培养和扩增获得MSCs,并行液氮冻存,通过倒置显微镜观察其生物学表现。结果:MSCs为贴壁生长,形态为均匀成纤维细胞样,增殖能力强,传代及冻存后细胞仍然保持其生物学特性。结论:MSCs可采取贴壁筛选法进行较好的纯化和扩增,并可长期保存于液氮中,在一定的条件下可复苏存活。     

传统及改良冻存法对人胎肝细胞保护效果的比较

目的:比较传统及改良冻存法对人胎肝细胞保护效果,建立一种适合于人胎肝细胞冷冻保存的方法。方法:实验于2006-07/11在广州医学院进行。①人胎肝组织取自中期终止妊娠胎儿(20周,经胎儿亲属知情同意及医院伦理委员会批准)。冷冻保护液包括A液(DMEM培养液含1.5mol/L乙二醇 体积分数为0.2胎牛血清);B液(A液 0.1mol/L蔗糖)两部分。②传统冻存法:用0.025%Ⅰ型胶原酶消化胎肝组织,分离、收集消化后的胎肝细胞。胎肝细胞在A液、B液中分别渗透平衡20min后,在冷冻保护B液中经液氮蒸汽冷平衡5min后迅速入液氮冻存,1周后复苏培养观察。③改良冻存法:胎肝组织在A液、B液中分别渗透平衡20min后,在冷冻保护液B液中经液氮蒸汽冷平衡5min后迅速入液氮冻存,1周后复苏,入DMEM培养液37℃孵育1h,胶原酶消化胎肝组织,分离、收集消化后的胎肝细胞培养观察。④新鲜分离的胎肝细胞做为对照组。⑤复苏后分离所得胎肝细胞用锥虫兰染色评估细胞活率,并记录贴壁时间,观察集落生长情况。结果:①锥虫兰染色结果显示传统冻存法复温后的胎肝细胞活率为(73.8±2.2)%,明显低于新鲜分离的胎肝细胞活率(89.2±3.6)%及改良冻存法所得胎肝细胞活率(82.5±4.2)%(P<0.01)。②贴壁情况观察发现新鲜胎肝细胞与改良冻存法胎肝细胞于培养24h开始贴壁,而传统冻存法胎肝细胞贴壁时间滞后48h。③新鲜胎肝细胞及改良冻存法胎肝细胞于第3天出现生长集落(细胞数>10为一个集落),传统冻存法胎肝细胞在第5天出现生长集落,集落的数量低于改良冻存法及对照组(P<0.01)。结论:改良冻存法可避免冻存前损伤,提高细胞对冷冻的耐受性和冻存复温后细胞的活率。     

趋化因子受体7基因绿色荧光慢病毒载体构建及在未成熟树突状细胞中的表达

背景：趋化因子受体7（chemokine receptor-7,CCR7）是树突状细胞从外周迁移至淋巴系统发挥作用的最重要的启动和调节者,但未成熟树突状细胞表面不表达CCR7,因此利用携带CCR7基因的未成熟树突状细胞可以更好地诱导免疫耐受。目的：构建携带小鼠CCR7基因的绿色荧光蛋白重组慢病毒载体,观察其在未成熟树突状细胞中的表达。方法：采用RT-PCR扩增小鼠CCR7基因并克隆至pCR-Blunt载体。将CCR7DNA片段及IRES-GFP连入慢病毒转移质粒LV-Lac,生成重组慢病毒质粒LV-CCR7。采用脂质体转染法将慢病毒系统3质粒（重组慢病毒质粒LV-CCR7、包装质粒ΔNRF及包膜质粒pVSVG）共转染包装慢病毒,重组慢病毒感染未成熟树突状细胞,光学显微镜观察细胞状态,流式细胞术鉴定CCR7蛋白的表达。结果与结论：实验成功扩增出小鼠CCR7DNA片段并克隆至pCR-Blunt载体,亚克隆构建慢病毒表达载体LV-CCR7,经3质粒包装系统感染293FT细胞后,24h于荧光显微镜下均观察到绿色荧光蛋白阳性表达,病毒滴度为108U/L以上,获得携带CCR7基因的重组慢病毒。慢病毒颗粒可有效感染未成熟树突状细胞,荧光显微镜可见大量GFP蛋白表达,阳性细胞达50%,流式细胞术检测到CCR7蛋白表达,LV-CCR7基因修饰的未成熟树突状细胞仍保持在未成熟状态。结果证实,实验成功构建携带小鼠CCR7基因绿色荧光慢病毒载体LV-CCR7,并可在未成熟树突状细胞细胞中表达。     

氩气刀联合二氧化碳冷冻在肺部罕见良性肿瘤治疗中的价值

目的探讨经支气管镜氩气刀(APC)联合冷冻介入治疗气道罕见良性肿瘤的价值。方法回顾性分析2014年5月-2015年12月4例该科经支气管镜下APC联合冷冻治疗的气道罕少良性肿瘤临床特征及文献复习。结果男3例,女1例,发病年龄23~80岁,平均56岁。4例患者分别诊断为:左主支气管平滑肌瘤、气管多形性腺瘤、气管嗜酸性细胞腺瘤、右肺上叶开口脂肪瘤。麻醉方式以局麻为主,气管多形性腺瘤首次治疗在全麻喉罩通气下完成。介入方式:APC热消融、止血,二氧化碳CO2冷冻冻取瘤组织及术后冻融治疗,术后1周清除冻融后坏死组织。治疗时间平均20 min。4例患者共进行10次介入治疗,术中未出现大出血、气道着火及穿孔。4例患者随访至今局部无复发。结论 APC联合冷冻治疗气道罕少良性肿瘤安全有效,值得推广。