乳酸脱氢酶同工酶醋纤膜电泳测定中试验条件的探讨

本文对醋酸纤维素膜电泳分离测定乳酸脱氢酶同工酶中的一些试验条件进行了一些探索,主要在几个方面进行改进:①增加了显色剂中NAD、NBT 的浓度,并加入了稳定剂PVP,能增强四唑盐类的呈色,提高显色强度。②采用在pH8.8的基质琼脂上双层薄膜孵育法,延长孵育时间,使酶促反应更充分。③减少了血清用量,能使图谱整齐。④采用了不连续电泳缓冲体系,具有浓缩蛋白作用,分离效果更好,并能缩短电泳时间。实验结果证明,采用这些改良措施,可提高乳酸脱氢酶同工酶的反应灵敏度,区带分离清晰、整齐,可用光密度计扫描定量,结果尚属理想。     

肝素对嗜中性白细胞还原四唑染料的影响

作者以不同浓度的肝素作抗凝剂,用两种四唑染料〔四唑氮兰(NBT)和四唑四硝基兰(TNBT)〕作嗜中性白细胞四唑染料还原试验。其方法是将NBT或TNBT溶解于pH 7.2的0.2M磷酸盐缓冲液中,离心除去沉淀,配成的上清染液可应用1～2天。肝素用磷酸盐缓冲液稀释成不同浓度:100、50、20、10和5国际单位/ml。向微量滴定塑料板的各孔中分别加入上述不同浓度的肝素溶液0.005ml(似应改为0.003ml——译者注),使肝素最后浓度为10、5、2、1和0.5国际单位/ml血液(再设一不加肝素的对照孔)。各孔加入指端血液各0.03ml和四唑染料(NBT或TNBT)0.02ml,轻轻通气使之混匀。塑料板上覆盖以湿润玻板,置37℃孵育30分钟,然     

淀粉样β蛋白（1-40）诱导血管平滑肌细胞损伤与利福平的保护效应

目的:采用淀粉样β蛋白诱导种植在人工基底胶上的血管平滑肌细胞损伤,观察利福平对血管平滑肌细胞的保护作用。方法:实验于2005-09/2006-09在武汉协和医院神经科实验室进行。①实验材料:100～150g清洁级SD大鼠;淀粉样β蛋白(1-40)(北京博奥森生物工程公司);利福平(华北制药厂)。②实验干预及分组:体外培养大鼠颈动脉平滑肌细胞;实验前所有的细胞培养板孔底经人工基底胶预处理。实验分为2组,实验组细胞培养板孔底沉积淀粉样β蛋白(1-40),对照组细胞培养板孔底无淀粉样β蛋白(1-40)沉积,实验组和对照组根据利福平终浓度不同分别分为7组(0,0.1,1,2,5,10,20g/L)。③实验评估:在显微镜下观察给药前后平滑肌细胞的形态学变化,用四甲基偶氮唑盐比色实验检测平滑肌细胞活性,依据乳酸脱氢酶漏出率检测平滑肌细胞膜的损伤程度。结果:①血管平滑肌细胞形态学变化:对照组内不同浓度利福平下细胞形态均基本正常,实验组细胞形态均异常,但经利福平处理后均有改善,并成剂量依赖关系。②细胞活性:对照组内四甲基偶氮唑盐染色吸光值无明显变化,实验组四甲基偶氮唑盐染色吸光值下降但经利福平处理也呈剂量依赖性上升。③乳酸脱氢酶漏出率:对照组中乳酸脱氢酶漏出率在利福平低浓度时无改变,高浓度时有所增加;实验组中乳酸脱氢酶漏出率均增加,在利福平浓度≤2g/L时,随利福平浓度增加,成剂量依赖关系的下降;在利福平浓度>2g/L时,乳酸脱氢酶漏出率又开始增加。结论:利福平在一定浓度范围内对淀粉样β蛋白(1-40)诱导的大鼠血管平滑肌细胞损伤有保护作用。     

四唑氮兰还原试验与碱性磷酸酶染色结果的比较

中性粒细胞碱性磷酸酶(ALP)染色及四唑氮兰还原试验(NBT)对细菌性感染疾病均具有一定的诊断价值,但两者的临床意义尚不完全相同.为此,我们对26例细菌性感染患者和43例非细菌性感染患者进行了NBT 及ALP 染色的对比检查,现将结果报道如下.     

硝基四唑氮兰玻片试验的改良法

硝基四唑氮兰(NBT)玻片试验是估计血中中性粒细胞吞噬反应的一种微量快速而简易的方法。这种细胞内NBT还原试验是检测吞噬细胞氧化代谢异常(如慢性肉芽肿病)的一种有用的手段。目前一般采用的Ochs-Igo氏法有缺点,将其改良后可得到较多粘附的粒细胞,且着色明显,形态完整,NBT阳性及阴性细胞容易鉴别。方法:①将含0.05 mg大肠杆菌内毒素(脂多糖B)的溶液充满18mm~2无菌盖玻片,让其干燥一夜。然后将盖玻片放入有湿滤纸及盖玻片支持物的无菌平皿内。②用长75mm肝素化的毛细管自指尖引入血液,滴2～3滴血液于上述涂有内毒素的玻片上。     

荧光法测定微量乳酸的方法探讨

当前,检测各种标本中乳酸浓度的方法已有许多报道1,2,3。但就国内的条件而言,酶法仍然是应用最广、最重要的一种方法。其原理主要是利用乳酸在乳酸脱氢酶（LDH）的催化下生成丙酮酸,且把NAD＋转变为NADH,后者在340nm有最大吸收,进行紫外分光光度法测定。为了能够应用可见光比色,也可利用吩嗪二甲酯硫酸盐（pms）,将NADH的氢传递到碘化硝基四氮唑蓝（INT）或者硝基四氮唑蓝（NBT）,然后分别在550nm和530nm比色4,5。 我们在借鉴以往酶法的基础上,利用NADH的荧光特性直接检测NADH的量来反应乳酸的浓度。方法更…     

构建中国仓鼠肺细胞的过表达葡萄糖调节蛋白75细胞克隆模型并评估其细胞保护作用

目的:以无糖培养12h后再以完全培养基继续培养的方法模拟细胞缺血后再灌注的损伤情况,观察葡萄糖调节蛋白75在缺糖及缺糖再灌注条件下对细胞的保护作用。方法:实验于2002-09/2004-02在复旦大学医学院医学与细胞遗传系实验室完成。以中国仓鼠肺细胞株为材料,置于无糖条件下培养12h后,重换含糖培养基继续培养以建立缺血再灌注体外培养模型,并采用脂质体介导的方法,以葡萄糖调节蛋白75表达载体(pcDNA3/葡萄糖调节蛋白75)转染中国仓鼠肺细胞细胞,获得过表达葡萄糖调节蛋白75的细胞克隆,运用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法,乳酸脱氢酶释放率测定等方法评估细胞损伤程度。结果:①克隆细胞用葡萄糖调节蛋白75抗体对其蛋白质产物进行印迹分析,克隆细胞葡萄糖调节蛋白75蛋白表达量明显高于对照组。②四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法显示,未转染细胞缺糖再灌注的增殖能力比完全培养20h增殖能力明显降低(P<0.05),且低于无糖培养20h(P<0.05);重新灌注后,葡萄糖调节蛋白75过表达的细胞的增殖能力明显高于对照组(P<0.01)。③乳酸脱氢酶释放测定结果显示,转染细胞缺糖再灌注乳酸脱氢酶释放百分比显著高于完全培养20h(P<0.01),与无糖培养20h无明显差别(P>0.05),葡萄糖调节蛋白75过表达的细胞乳酸脱氢酶释放百分比显著低于对照组(P<0.01)。结论:通过建立过表达葡萄糖调节蛋白75的细胞克隆以无糖培养模拟能量代谢应激,观察葡萄糖调节蛋白75对处于能量代谢性应激中细胞的保护作用,以及应激后细胞的恢复情况。发现表达葡萄糖调节蛋白75的细胞较未转染的细胞具有更高的存活率,细胞膜损伤和DNA损伤较轻,说明葡萄糖调节蛋白75在细胞缺糖后再灌注损伤中具有一定的保护作用。     

构建中国仓鼠肺细胞的过表达葡萄糖调节蛋白75细胞克隆模型并评估其细胞保护作用料

目的：以无糖培养12h后再以完全培养基继续培养的方法模拟细胞缺血后再灌注的损伤情况，观察葡萄糖调节蛋白75在缺糖及缺糖再灌注条件下对细胞的保护作用。方法：实验于2002—09／2004—02在复旦大学医学院医学与细胞遗传系实验室完成。以中国仓鼠肺细胞株为材料，置于无糖条件下培养12h后，重换含糖培养基继续培养以建立缺血再灌注体外培养模型，并采用脂质体介导的方法，以葡萄糖调节蛋白75表达载体（pcDNA3／葡萄糖调节蛋白75）转染中国仓鼠肺细胞细胞，获得过表达葡萄糖调节蛋白75的细胞克隆，运用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法，乳酸脱氢酶释放率测定等方法评估细胞损伤程度。结果：①克隆细胞用葡萄糖调节蛋白75抗体对其蛋白质产物进行印迹分析，克隆细胞葡萄糖调节蛋白75蛋白表达量明显高于对照组。②四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法显示，未转染细胞缺糖再灌注的增殖能力比完全培养20h增殖能力明显降低（P〈0．05），且低于无糖培养20h（P〈0．05）；重新灌注后，葡萄糖调节蛋白75过表达的细胞的增殖能力明显高于对照组（P〈0．01）。⑧乳酸脱氢酶释放测定结果显示，转染细胞缺糖再灌注乳酸脱氢酶释放百分比显著高于完全培养20h（P〈0．01），与无糖培养20h无明显差别（P〉0．05），葡萄糖调节蛋白75过表达的细胞乳酸脱氢酶释放百分比显著低于对照组（P〈0．01）。结论：通过建立过表达葡萄糖调节蛋白75的细胞克隆以无糖培养模拟能量代谢应激．观察葡萄糖调节蛋白75对处于能量代谢性应激中细胞的保护作用，以及应激后细胞的恢复情况。发现表达葡萄糖调节蛋白75的细胞较未转染的细胞具有更高的存活率，细胞膜损伤和DNA损伤较轻，说明葡萄糖调节蛋白75在细胞缺糖后再灌注损伤中具有一定的保护作用。     

Earle''''s液与MEM培养基对神经元活性的影响

目的 观察Earle's液、新配最小必需培养基(MEM)及原 MEM对神经元活性的影响。方法 神经元培养 10 d后,分别换为Earle's液、新配MEM及原MEM,12 h和 24 h后用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测定细胞的 LDH漏出量,四甲基偶氮唑盐(MTT)微量酶反应比色法测定MTT代谢率。结果 神经元在不同培养介质中孵育 12 h和 24 h后,细胞 LDH的漏出量及 MTT代谢率有非常显著性差异( P <0.01)。结论 不同孵育液对神经元的活性有影响。     

对连苯三酚自氧化法检测SOD活性几个问题的商榷

目前,测定 SOD 活性的方法很多,主要有连苯三酚自氧化法及黄嘌呤氧化酶—NBT 等。这些方法均为利用其抑制某种氧化还原反应能力来间接反映 SOD 活力,困连苯三酚浓度及样品用量的不同,其结果相差数倍。本文对重复用连苯三酚自氧化法检测纯化 SOD 过程中遇到的几个问题进行探讨。     

碱性成纤维细胞生长因子对培养的骨骼肌细胞生长作用的研究

目的观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外培养的新生Wistar大鼠骨骼肌细胞存活、分化及促增殖分裂影响。方法应用无血清培养技术,采用四唑盐(MTT)微量比色法,乳酸脱氢酶(LDH)活性、肌酸磷酸激酶(CK)活性测定及蛋白定量检测。结果bFGF干预组MTT微量比色的ΔOD值、LDH活性、CK活性及蛋白质合成均高于对照组。结论外源性bFGF明显促进细胞的存活、生长及增殖分化。     

辛伐他汀对小鼠静脉内膜增生影响的实验研究

目的研究辛伐他汀对静脉内膜增生的影响。方法将实验小鼠标本分为实验组和对照组，实验组使用辛伐他汀，对照组不使用，用四甲基偶氮唑盐比色法观察血管内皮祖细胞增殖情况。结果四甲基偶氮唑盐比色结果表明各实验组血管内皮祖细胞增殖活力均较对照组增强（P〈0．05）。结论辛伐他汀能够增加静脉内膜的增生。     

血小板衍化生长因子与离体人牙周膜细胞增殖

目的 研究了解血小板衍化生长因子-β(Platelet-derived growth factor-β，PDGF-β)对离体人牙周膜细胞(Periodontal ligament cells，PDLCs)增殖的影响。方法 体外培养人PDLCs，用不同浓度的作用，用四唑盐比色法进行观察。结果 PDGF-β作用后PDLCs的增殖较对照组有明显的升高，而且具有浓度效应。结论 PDGF-p可促进离体人PDLCs的增殖。     

三磷酸腺苷保护脊髓损伤神经元的细胞活力

目的:观察核苷酸类神经营养因子三磷酸腺苷对大鼠脊髓神经元损伤后细胞活力的影响。方法:取新生Wistar大鼠20只,切取脊髓,剪碎组织成糜状进行神经细胞培养。将培养的神经细胞分为3组,①无损伤对照组,继续完全培养液培养。②损伤组,培养第7天神经元用微量移液器塑料滴头行机械性划痕损伤后完全培养液培养。③三磷酸腺苷组,培养第7天神经元划痕损伤后加入终浓度为1.0mmol/L的三磷酸腺苷培养液培养。倒置相差显微镜观察细胞生长及不同时期细胞形态变化,各组于处理后10min,1,12,24和48h,细胞损伤程度,以乳酸脱氢酶法检测(乳酸脱氢酶渗漏量比值越大,说明细胞损伤越重)。检测各组细胞活性采用四甲基偶氮唑盐比色法(四甲基偶氮唑盐代谢率吸光度越高,说明细胞活性越高)。结果:①各组细胞损伤程度评估:以培养液中乳酸脱氢酶含量表示。伤后1,12,24和48h,损伤组和三磷酸腺苷组较对照组明显增加(P<0.05);损伤24和48h,三磷酸腺苷组低于损伤组(17.94±0.82,23.05±1.04;18.52±1.12,24.88±1.16;P<0.05)。②体外培养的各组大鼠损伤神经元的变化:以四甲基偶氮唑盐代谢率表示。伤后1,12,24和48h,损伤组和三磷酸腺苷组明显低于对照组(P<0.05),损伤24和48h,三磷酸腺苷组高于损伤组(0.24±0.03,0.18±0.04;0.27±0.03,0.15±0.05;P<0.05)。结论:细胞外三磷酸腺苷可以减轻机械性损伤后的脊髓神经元的损伤程度,增强细胞活力,对受损伤的神经元有一定的保护作用。     

组织工程血管材料体外细胞毒性评价实验研究

目的:为构建组织工程化血管选择支架材料,对材料进行体外细胞毒性评价.方法:以L929为实验细胞,采用四唑盐比色法、琼脂覆盖法对自行合成的4种构建组织工程血管的支架材料进行体外细胞毒性评价实验.结果:以辛酸亚锡为催化剂合成的聚氨酯、聚羟基烷酸酯、聚丁二酸丁二酯,经四唑盐比色法及琼脂覆盖法实验为合格的医用材料,四唑盐比色法中吸光度值与阴性对照材料比较差异无统计学意义(P>0.05).以二月桂酸二丁基锡为催化剂合成的聚氨酯经四唑盐比色法及琼脂覆盖法实验为不合格的医用材料,四唑盐比色法中吸光度值与阴性对照材料比较差异有统计学意义(P<0.05).结论:四唑盐比色法、琼脂覆盖法在评判生物材料毒性方面,是快速、简便、有效的方法.以辛酸亚锡为催化剂合成的聚氨酯、聚羟基烷酸酯、聚丁二酸丁二酯可用于进一步的实验研究.     

甘氨双唑钠和塞来昔布联合应用对宫颈癌Hela细胞同步放化疗的影响

目的:探讨甘氨双唑钠和塞来昔布联合应用对宫颈癌Hela细胞同步放化疗(顺铂10μg/mL+放疗2 Gy)的影响,为将两药联合作为同步放化疗增敏剂应用于临床上中晚期及复发宫颈癌的治疗提供实验依据。方法:用不同浓度的甘氨双唑钠及塞来昔布分别处理Hela细胞24 h后,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞的增殖活性,并求出无毒浓度;用两药的无毒浓度分别及同时联合同步放化疗处理Hela细胞24 h后,MTT法检测细胞的增殖活性,倒置显微镜及透射电镜观察细胞形态的改变。结果:联合组对细胞增殖的抑制作用比同步放化疗组更显著,且两药联合组的抑制作用强于单药联合组及同步放化疗组;倒置显微镜及透射电镜下两药联合组细胞呈现出凋亡形态。结论:甘氨双唑钠和塞来昔布对Hela细胞同步放化疗有增敏作用,且两药与同步放化疗联合应用有一定的协同增敏效应。     

透明质酸对人骨关节炎软骨细胞保护机制的探讨

目的:探讨透明质酸对人骨关节炎软骨细胞的作用机制。方法:应用细胞培养、四唑盐比色实验检测细胞线粒体活性,流式细胞术检测线粒体膜电位、细胞凋亡百分率和细胞内游离钙离子浓度。结果:透明质酸能明显提高人骨关节炎软骨细胞线粒体活性,抬高线粒体膜电位,降低细胞凋亡率和胞内游离钙浓度。结论:透明质酸可抑制人骨关节炎软骨细胞线粒体膜电位的降低,从而具有稳定线粒体膜电位的作用,抑制细胞凋亡的发生,这种作用可能与其能抑制软骨细胞内钙超载有关。     

碱性成纤维细胞生长因子对培养的骨骼肌细胞生长作用的研究

目的：观察碱性成纤维细胞因子（bFGF)对体外培养的新生Wistar大鼠骨骼肌细胞存活、分化及促增殖分裂影响。方法：应用无血清培养技术，采用四唑盐（MTT）微量比色法，乳酸脱氢酶（LDH）活性、肌酸磷酸激酶（CK）活性测定及蛋白定量检测。结果：bFGF干预组MTT微量比色的ΔOD值、LDH活性、CK活性及蛋白质合成均高于对照组。结论：外源性bFGF明显促进细胞的存活、生长及增殖分化。     

无机砷及其代谢物诱导人成纤维细胞凋亡的实验研究

目的体外培养人成纤维细胞,用无机砷及其代谢物进行染毒,观察染毒后细胞凋亡的影响。方法从8例7~11岁的健康儿童志愿者中,取包皮组织分离,培养成纤维细胞,将无机砷及其代谢物作用于培养至第10代的人成纤维细胞后,通过四唑盐比色法、流式细胞仪观察无机砷及其代谢物能否诱导人成纤维细胞凋亡。结果四唑盐比色法证实,当无机砷及其代谢物为0~10μmol/L时,对人成纤维细胞有明显的增殖作用,凋亡不明显;而10~25μmol/L浓度时产生明显的毒性作用,对人成纤维细胞的凋亡率呈浓度依赖性。结论无机砷及其代谢物对人成纤维细胞有一定的毒性作用,而低浓度对人皮肤成纤维细胞有增殖效应。     

不同浓度钙对人腹膜间皮细胞影响的实验研究

[目的]观察不同浓度钙对体外培养的人腹膜间皮细胞（human peritoneal mesothelial cells,HPMCs）及细胞外基质的影响.[方法]采用人腹膜间皮细胞株体外培养,用乳酸脱氢酶（LDH）和四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）评估细胞的活力和增殖能力;采用免疫细胞化学法来检测纤维连接蛋白（FN）的表达.[结果]不同浓度钙均可促进HPMCs增殖（P〈0.01）,而以1.25 mmol/L及1.0 mmol/L钙作用最明显,且呈时间依赖关系.不同浓度钙组与对照组相比均可明显升高LDH水平,其中以1.25 mmol/L钙的LDH水平最低（P〈0.01）,且呈时间依赖关系.2.0 mmol/L和1.75 mmol/L钙可明显上调FN的表达（P〈0.01）.[结论]高钙可明显损伤HPMCs及促进FN合成,其在腹膜纤维化的发生中可能起了一定作用;而浓度为1.25 mmol/L钙可保护腹膜,并在一定程度上有预防腹膜纤维化的作用.