骨髓间充质干细胞-胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统的构建及效应

背景:体内研究已经证实骨髓间充质干细胞能够像神经干细胞一样在脑内迁移和整合,如果骨髓间充质干细胞用于系统途径移植成为可能,将会显著简化移植的步骤.目的:构建含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的重组表达质粒pEGFP-N3-CD,用脂质体Lipofectamine2000转染大鼠骨髓间充质千细胞,体外观察CD基因的表达及BMSCs-CD/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统对C6胶质瘤细胞的杀伤作用.方法:构建pEGFP-N3-CD质粒,酶切、DNA测序鉴定.全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,脂质体Lipofectamine2000介导重组表达质粒pEGFP-N3-CD转染大鼠骨髓间充质干细胞,G418筛选培养获取阳性克隆(BMSCs-CD细胞),免疫细胞化学染色检测BMSCs-CD细胞的CD基因蛋白表达.Transwell小室共培养BMSCs-CD细胞和C6胶质瘤细胞,24 h后加入前体药物5-氟胞嘧啶,72 h后TUNEL、MTT、流式细胞术检测C6胶质瘤细胞的凋亡情况.结果与结论:构建的重组表达质粒pEGFP-N3-CD含完整的CD基因序列,CD基因转染至骨髓间充质干细胞并在基因及蛋白水平有完整表达.BMSCs-CD和C6胶质瘤细胞体外共培养条件下,C6胶质瘤的凋亡率呈剂量依赖性,与对照组相比差异有显著性意义(P<0.01).结果提示体外共培养条件下,BMSCs-CD/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统对C6胶质瘤细胞生长有显著的抑制作用.     

Survivin基因在结直肠癌中的表达及其对预后的判断价值

目的:研究凋亡抑制蛋白Survivin基因在结直肠癌组织和外周血清中的表达及其与临床病理参数的关系,同时评估其对结直肠肿瘤转移预后的意义.方法:应用实时定量RT-PCR方法,检测31例结直肠癌组织及其邻近正常结直肠组织和13例结直肠非肿瘤性组织及外周血清中Survivin mRNA的表达.同时回顾分析其与诸多临床、病理参数问的关系.结果:肿瘤组织中Survivin基因特异性高表达,阳性率为100%,显著高于结直肠非肿瘤性组织中Survivin的表达(P<0.01).而正常结直肠黏膜则不表达.但其与年龄、性别、肿瘤位置、大小及Dukes分期等临床、病理参数无关;有淋巴结及远处转移患者外周血清中Survivin基因高表达,与无转移者有显著差异(P<0.05).结论:Survivin基因特异表达于结直肠肿瘤组织.并通过抑制结直肠癌细胞凋亡促进癌细胞增殖及肿瘤新生血管生成而参与结直肠癌的发生发展;外周血液中Survivin基因检测对筛选结直肠癌高危转移患者和判断预后及有一定参考意义.     

直肠腺瘤和直肠癌中 microRNA 表达谱差异

目的对直肠癌miRNA表达谱进行初步研究,以期发现在直肠癌发生过程中与直肠腺瘤miRNA的差异表达谱,并预测可能受其调控的靶基因。方法选择2011年1～3月于解放军第306医院肠镜检查的直肠癌及直肠腺瘤进行检测,筛选直肠癌、直肠腺瘤组织差异表达的miRNA,并运用生物信息软件分析其靶基因。结果通过miRNAs芯片检测,发现直肠腺癌与直肠腺瘤相比,上调的miRNA 34种,下调8种。预测ZFHX4可能为miR-375的靶基因,预测SMAD2等可能为miR-18a的靶基因。结论与直肠腺瘤相比,直肠腺癌有其特异的miRNA表达谱,miRNA在直肠癌的发生中可能起到重要作用。     

青蒿琥酯对人胃癌SGC-7901细胞生长的影响

目的:研究青蒿琥酯诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡作用及其可能机制.方法:应用流式细胞术(FCM)、透射电镜(TEM)等方法检测不同浓度下青蒿琥酯对人胃癌SGC-7901细胞生长的影响,并应用Western Blot法检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达水平.结果:经青蒿琥酯处理后,人胃癌SGC-7901细胞凋亡率升高,并具有时间浓度依赖性(P＜0.05),癌细胞被阻滞于G0/G1期;电镜观察肿瘤组织中散在凋亡细胞及凋亡小体;Western Blot法检测到凋亡相关基因Bcl-2表达减弱,Bax表达增强(P＜0.05).结论:青蒿琥酯能有效抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能与下调凋亡相关基因Bcl-2、上调Bax表达有关.     

脂联素受体在正常结直肠上皮和结直肠癌的表达及其意义

目的:探讨脂联素受体的表达与结直肠癌间的关系及对结直肠癌的影响.方法:应用免疫组织化学SP法检测46例结直肠腺癌组织和46例结直肠正常黏膜组织中脂联素受体的表达情况,以图像分析软件进行半定量测定.结果:脂联素受体在正常结直肠上皮组织的腺管上皮细胞膜和细胞浆均匀表达,呈棕黄色-棕褐色表达;在结直肠癌细胞的细胞膜和细胞浆中呈浅黄色-棕黄色表达.腺癌组、正常对照组的脂联素受体1阳性率分别为78.3%、96.7%,脂联素受体2阳性率则分别为76.1%、96.7%.脂联素受体在结直肠腺癌组的阳性表达率明显低于正常对照组(P＜0.05或0.01).结论:脂联素可能通过脂联素受体的表达对结直肠癌产生影响,从而促进结直肠癌的发生、发展.     

叉头蛋白O1在黄连素抗人肺腺癌A549细胞中作用机制研究

目的探讨黄连素(BBR)抗肺腺癌A549细胞及叉头蛋白O1(FKHR)在其中的作用机制。方法实验分为对照组、BBR 25μM组、BBR 50μM组、BBR 75μM组,分别检测各组A549细胞活性、凋亡率以及FKHR和凋亡相关蛋白含量的变化。FKHR siRNA特异性抑制FKHR表达后,BBR(0、50μM)处理细胞24 h,重复上述检测。构建裸鼠移植瘤模型,腹腔注射BBR(10 mg/kg、20 mg/kg),对照组注射等体积磷酸盐缓冲液(PBS)。检测细胞活力和细胞凋亡率,Western-blot检测FKHR及凋亡相关蛋白的表达。结果 BBR有效降低A549细胞活力并促进细胞凋亡(P0.05);Western-blot检测结果显示BBR上调FKHR和Bax的含量(P0.05),抑制Bcl2的表达(P0.05);FKHR siRNA转染显著抑制其表达,同时抑制BBR抗肺腺癌作用(P0.05)。结论黄连素可有效抑制肺腺癌A549细胞增殖、促进细胞凋亡,此作用可能与激活FKHR有关。     

地西他滨对白血病细胞DKK1基因去甲基化的实验研究

目的:探讨地西他滨对急性髓系白血病细胞株HL-60中DKK1的表达及其下游Wnt信号通路的影响。方法:采用流式细胞术(FCM)和DNA Ladder分析检测不同浓度地西他滨对HL-60细胞凋亡的影响,甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)检测DKK1基因甲基化状态,qRT-PCR方法检测mRNA表达水平,Western-blot方法检测蛋白的表达变化。结果:FCM检测结果表明,不同浓度地西他滨作用于HL-60细胞48 h后,地西他滨组的早期凋亡细胞数明显增多(P0.05);DNA梯度检测结果发现,地西他滨组出现明显的细胞凋亡特异性梯度条带;MSPCR检测发现,DKK1基因发生去甲基化,RT-PCR和Wertern blot检测显示mRNA表达水平增高,DKK1蛋白表达增加,β-catenin及C-MYC蛋白表达降低。结论:地西他滨可以通过DKK1基因去甲基化及抑制Wnt通路的作用,促进HL-60细胞凋亡。     

茅莓总皂苷体外抗肿瘤作用研究

茅莓（Rubus parviflolius L．），别名天青地白草、红梅消、三月泡，为蔷薇科悬钩子植物，具有活血化瘀，清热解毒等作用。本研究选择了HR8348直肠腺癌细胞、A375黑色素瘤细胞、Hut-78人皮肤T细胞淋巴瘤细胞和A431人表皮癌细胞为癌细胞株，用茅莓总皂苷对它们进行体外抗肿瘤试验，同时检测了茅莓总皂苷对HR8348直肠腺癌周期的影响，结果显示对前三种肿瘤有良好的抗肿瘤活性，通过将细胞周期阻滞在S期在而发挥抗肿瘤作用。     

嵌合抗原受体设计的NK细胞在多发性骨髓瘤中的应用研究

目的:通过建立CAR(CD138-CD28-CD3ζ)-NK细胞,探讨CAR(CD138-CD28-CD3ζ)-NK细胞对多发性骨髓瘤的抗肿瘤作用。方法:把抗CD138scFv-CD28-CD3连接到pc DNA3.1质粒,使用三质粒慢病毒包装系统转染293T细胞,收集病毒后感染NK92MI细胞系,应用嘌呤霉素筛选阳性细胞株;通过RT-PCR及Western blot检测CAR在NK92MI细胞系的表达,流式细胞术检测NK92MI细胞分泌细胞因子cd107a的能力。结果:经过基因工程技术,体外构建了CAR基因片段,基因测序验证基因序列正确。通过病毒包装技术,获得表达该片段的病毒株。经过病毒转染实验,获得表达CAR融合蛋白的稳转NK细胞株。PCR及Western blot证实,CAR融合蛋白在NK细胞表达。细胞杀伤实验证实CARNK细胞分泌细胞因子cd107a的能力明显优于对照组,具有明显的杀伤多发性骨髓瘤细胞的效应。结论:CAR能在体外构建并在NK92细胞表面表达,CARNK细胞能杀伤表达CD138抗原的多发性骨髓瘤细胞株,从而发挥抗骨髓瘤效应。     

全反式维A酸增强双自杀基因系统对乳腺癌旁观者效应的观察

目的:观察全反式维A酸(ATRA)对腺病毒为载体的双自杀基因系统治疗乳腺癌旁观者效应的增强作用及与Cx43表达的关系.方法:MTT法观察ATRA对双自杀基因系统治疗乳腺癌旁观者效应的影响;RT-PCR和FCM法检测ATRA作用前后乳腺癌MCF-7细胞内连接蛋白Cx43基因和蛋白的表达情况.结果:以不同比例混合MCF-7和MCF-7/CDTK细胞在前药作用下细胞存活率ATRA组较对照组明显降低(P＜0.05).RT-PCR和FCM分析结果表明,经ATRA处理的MCF-7细胞,其Cx43基因和蛋白的表达明显提高.结论:乳腺癌MCF-7细胞中,ATRA具有明显增强CD/TK双自杀基因系统旁观者效应的作用,细胞内Cx43的表达增强可能是旁观者效应增强的机制之一.