诱骗受体3与肿瘤关系的研究进展

诱骗受体3(DcR3)是新近发现的肿瘤坏死因子受体超家族新成员,是一种可溶性受体,在一些疾病尤其是恶性肿瘤中过表达,与死亡受体3(DR3)相反,DcR3缺乏死亡结构域.过去对于DCR3的研究集中肿瘤,即DcR3可阻断细胞的凋亡进而造成免疫逃逸和化疗耐受,近来对于DcR3的研究多集中于炎症,以及DcR3及其类似物在特定疾病如自身免疫性疾病中的预防和治疗作用,本文综述了DcR3在肿瘤、炎症及其临床应用中的研究进展.     

DcR3在结肠癌患者外周血及癌组织中表达水平的检测

诱骗受体3(decoy receptor 3, DcR3)是新近发现的一种可溶性的肿瘤坏死因子受体(tumour necrosis factor receptor, TNFR)家族成员[1].研究表明它在某些肿瘤、自身免疫病等疾病中高度表达, 其蛋白的表达和基因的扩增与人类多种恶性肿瘤的发生、发展以及肿瘤的免疫逃逸密切相关[2].故我们研究DcR3在结肠癌患者外周血及癌组织中的表达, 阐明其与结肠癌的相关性.     

抗人DcR3单克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的 制备抗DcR3单克隆抗体(mAb),鉴定其生物学特性,并应用于ELISA、Western blot、How cytometry(FCM)检测.方法 以纯化的可溶性DcR3(sDcR3)免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗DcR3 mAb.用Ig亚类EHSA试剂盒鉴定抗DcR3mAb的亚类.用ELISA方法测定抗DcR3 mAb与sDcR3结合的特性,SDS-PAGE鉴定抗DcR3 mAb与SW480细胞上清中DcR3结合的特性,以鉴定mAb的特性.用间接ELISA法检测腹水mAb的效价、亲和常数并进行表位分析.Western blot检测mAb的特异性及应用,并用所获抗DcR3单克隆抗体(mAb)通过流式细胞仪检测肿瘤细胞表面DcR3的表达水平.结果 获得4株可分泌DcR3 mAb的杂交瘤细胞系ZZ-393、ZZ-394、ZZ-151和ZZ-268.其中DcR3 mAb ZZ-268(下文简称为ZZ-268)的Ig亚类为IgGl(k型);腹水效价为1×10-5;亲和常数为1.28×109水平;ZZ-268和ZZ-151可识别与其他2种抗体小同的抗原表位;Westem blot证实,获得的ZZ-268可特异性地识别DcR3;通过流式细胞术可敏感地检测到不同肿瘤细胞表面DcR3的表达水平.结论 获得4株抗DcR3的mAb,其中ZZ-268效价高、特异性强,将此抗体用于膜DcR3与sDcR3的检测分析.     

DcR3 对肝纤维化动物模型的影响

目的:研究DcR3 基因对肝纤维化大鼠的预防性治疗的作用。方法:SPF 级健康雄性Wistar 大鼠30 只,体重范围180 ~220 g,随机分为3 组,每组10 只,分别为正常对照组、DcR3 基因预防性治疗组(1% DMN+DcR3 组)、造模组(1%DMN 组)。采用1%DMN 诱导大鼠肝纤维化模型,腹腔注射DcR3 质粒进行预防性干预。分别采用HE 染色和Masson 染色观察肝组织病理情况;qRT-PCR 和Western blot 法检测DcR3、Fas、FasL、-SMA 和TGF-1 的mRNA 和蛋白表达水平。结果:与模型组相比,DcR3 预防治疗组大鼠肝组织炎性细胞浸润及胶原类物质沉积有所改善;DcR3 基因可显著降低肝纤维化大鼠Fas、FasL、 SMA 和TGF-1 mRNA 和蛋白表达水平,DcR3 基因预防性治疗组与对照组和造模组有显著性差异(P<0.05);同时DcR3 基因预防性治疗组DcR3 mRNA 和蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。结论:DcR3 基因可有效防治大鼠肝纤维化,其作用机制可能是DcR3 通过降低肝脏炎症反应,减少胶原类物质沉积,抑制 SMA 和TGF-1 表达,从而抑制HSC 活化;下调Fas和FasL 表达,抑制Fas/ FasL 途径诱导的肝细胞凋亡。     

类风湿关节炎滑膜组织及关节液中DcR3表达的研究

目的:观察研究人诱骗受体3(DcR3)在类风湿关节炎(RA)关节液及滑膜组织中的表达及其与滑膜炎性病变程度的相关性.方法:用免疫组织化学的方法对12例RA患者、6例骨关节炎(OA)患者及4例无关节病变的骨折患者滑膜组织中DcR3的表达进行描述分析,并对DcR3表达情况与RA患者滑膜炎性病变程度相关性进行分析.同时用ELISA的方法检测了26例RA及19例OA患者关节液中DcR3的表达.结果:DcR3在RA滑膜组织主要分布于血管翳周围炎性细胞及部分滑膜细胞中,DcR3阳性细胞数约为72％.OA滑膜组织细胞中DcR3也呈现少量的阳性表达,但与RA比较阳性程度较弱,阳性细胞数量较少:对DcR3表达与RA滑膜炎性程度的相关性分析发现,DcR3与RA滑膜炎性程度呈正相关(r=0.832,P＜0.01),同时发现RA患者关节液中表达也明显高于OA患者.结论:DcR3在RA滑膜组织炎性细胞及滑膜细胞上的异常表达可能是其参与RA滑膜炎及滑膜组织侵袭等病理过程,从而导致滑膜损伤的一个重要机制.     

DcR3重组蛋白对糖尿病大鼠心肌组织凋亡相关分子的表达及细胞凋亡的作用

目的:研究诱骗受体3(DcR3)在正常大鼠、糖尿病(DM)大鼠心肌组织的表达,DcR3重组蛋白对心肌组织凋亡相关分子表达以及心肌细胞凋亡的影响,探讨DcR3对DM大鼠心肌细胞凋亡的作用。方法:一次性腹腔注射链脲佐菌素建立大鼠DM模型,尾静脉注射不同剂量的DcR3重组蛋白[1.2 mg/(鼠·d)、0.8 mg/(鼠·d)、0.4 mg/(鼠·d)]40 d。RTPCR检测心肌组织DcR3 mRNA、Fas mRNA、FasL mRNA的表达。Wester blot分析凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-8的表达。双抗夹心ELISA检测血液中IL-1β、TNF-α及LFN-γ水平的变化,HE染色观察心肌细胞凋亡的百分率。结果:DcR3治疗组大鼠与DM组比较心肌组织DcR3 mRNA高表达,Fas mRNA、FasL mRNA表达下调。Caspase-8蛋白水平下调,Bcl-2蛋白水平上调,以中剂量组的作用最明显。各DcR3治疗组血清IL-1β、TNF-α和IFN-γ水平均有不同程度的降低(P<0.05,P<0.01)。心肌细胞凋亡的百分率下降(P<0.05)。结论:DcR3重组蛋白有抑制DM大鼠心肌细胞凋亡的作用,其机制与竞争Fas,阻断FasL诱导细胞凋亡,心肌细胞表达DcR3,凋亡相关因子Caspase-8下调、Bcl-2上调及细胞因子水平的降低有关。     

抗人DcR3单克隆抗体的研制及其鉴定

目的:制备抗人DcR3单克隆抗体(mAb),并鉴定其特异性.方法:纯化的His-DcR3融合蛋白免疫小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人DcR3 mAb并进行纯化,纯化后的抗体经Western blot和ELISA方法鉴定其特异性、Ig亚型和效价.结果:获得5株稳定分泌抗DcR3 mAb的杂交瘤细胞,均属IgG1亚型,其腹水抗体效价为1×10-5 ～1×10-7,Western blot显示5株细胞分泌的mAb均可识别DcR3蛋白,其中1株(1B1)可与SW480细胞成分反应.结论:成功建立稳定分泌抗人DcR3 mAb的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体特异性强、效价高,为研究DcR3在组织中的表达、分布及研制ELISA试剂盒奠定基础.     

诱骗受体DcR3的基因构建、表达及特异性鉴定

目的:构建适于原核表达的人诱骗受体DcR3基因,并进行重组蛋白的表达纯化及特异性鉴定。方法:查得人DcR3cDNA全序列,将其分段设计引物,通过重叠PCR获得DcR3基因。构建pET-22b( )/DcR3表达载体,转化大肠杆菌Rosseta-gami,IPTG诱导表达,Ni柱纯化。采用ELISA进行特异性鉴定。结果:通过重叠PCR获得了编码正确氨基酸序列的目的基因。目的蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上。纯化后,蛋白纯度达95%以上。ELISA结果表明所纯化的蛋白可与抗DcR3抗体发生特异结合。结论:诱骗受体DcR3基因的成功构建、表达及纯化,为进一步的功能研究奠定了基础。     

肝癌发展中FasL及其受体Fas/DcR3的表达分析

目的研究小鼠肿瘤发生早期肿瘤坏死因子超家族成员FasL及其受体的表达特点,及其与免疫调节相关分子表达的时空关系,探讨其在诱导肿瘤免疫耐受中的作用。方法建立小鼠实体瘤模型,采用RT-PCR方法检测肿瘤组织中可溶型FasL、Fas及DcR3、TGF-β、IL-10在肿瘤发生不同时相的表达,同时,应用ELISA方法定量检测血清中TGF-β、IL-10的表达。结果在早期的肿瘤组织中,Fas的表达先于DcR3,其后DcR3大量表达,而Fas的表达则下调直至丢失,DcR3、FasL同时表达并上调,TGF-β和IL-10也随肿瘤的表达而上调。TGF-β同DcR3的表达具有空间位置的一致性。FasL、DcR3、TGF-β和IL-10的表达水平同肿瘤的生长呈正相关。结论随着肿瘤不断的生长,肿瘤局部的免疫应答逐渐趋向于负调节,FasL、DcR3在诱导肿瘤免疫耐受的过程中可能发挥着重要作用。     

人DcR3融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的:制备DcR3融合蛋白及其多克隆抗体,并鉴定其特异性。方法:将亚克隆构建的pET28a( )/DcR3重组表达质粒转化入大肠杆菌(E.coli)BL21菌株,IPTG诱导表达,镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE及Western blot分析蛋白产物,将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对其进行纯化及鉴定。结果:pET28a( )/DcR3重组表达质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为33000的目的蛋白,表达量约占菌体蛋白总量的38%,纯化后的目的蛋白纯度达98%。Western blot显示纯化蛋白与抗DcR3单克隆抗体(mAb)具有良好的反应性。纯化后多克隆抗体效价达1.28×10-6。结论:DcR3蛋白在E.coli中得到高效表达,成功制备高纯度DcR3蛋白及高效价抗DcR3多克隆抗体,为研究DcR3在组织中的表达、分布,研制ELISA试剂盒以检测恶性肿瘤及自身免疫性疾病等患者血清DcR3表达水平提供实验基础。     

重组人DcR3腺相关病毒的构建和表达

目的克隆人DcR3基因于腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)载体pAAV-IRES-hrGFP中,以获得高感染滴度及纯度的重组人DcR3腺相关病毒,为将其用于感染移植肝,研究其对大鼠移植肝的保护作用打下基础。方法用基因重组的方法构建含全长人DcR3基因的重组腺相关病毒骨架质粒,利用脂质体法将腺相关病毒载体系统共转染入病毒包装细胞AAV-293细胞中,合成重组DcR3腺相关病毒,经PEG/氯仿纯化,用SDS-PAGE鉴定其纯度,扫描电镜观察病毒颗粒形态,倍比稀释法测定重组病毒的感染滴度。并用重组病毒感染COS-7细胞鉴定DcR3的表达。结果正确构建组装重组人DcR3腺相关病毒,纯化后病毒感染滴度为1.1×1010U/mL。在重组DcR3腺相关病毒感染的COS-7细胞上清液中检测到了DcR3的表达。结论成功构建了重组人DcR3腺相关病毒,为下一步研究DcR3对大鼠移植肝的保护作用打下基础。     

HTLV-1病毒Tax蛋白对T淋巴细胞DcR3基因表达的影响

目的 探讨HTLV-1病毒Tax蛋白对T淋巴细胞DcR3基因表达的影响.方法 构建pGL3-DcR3-luc( -1010 bp- +114 bp)荧光素酶报告基因;利用脂质体介导的方法将pGL3 -DcR3 -luc转染到MT-2、TaxP、Jurkat细胞中,48h后检测DcR3荧光素酶报告基因的活性;利用脂质体介导的方法将梯度剂量的pCMV -Tax转染入Jurkat细胞,48 h后提RNA逆转录,real-time PCR检测DcR3 mRNA 的表达的变化;选用流式细胞技术检测MT-2、TaxP、Jurkat细胞表面DcR3蛋白的表达.结果 成功构建DcR3基因调控序列荧光素酶报告基因pGL3-DcR3-luc;荧光素酶活性的检测显示,与对照组相比,MT2细胞荧光素酶活性升高了32.07± 12.43倍,TaxP细胞荧光素酶活性升高了13.27±4.04倍,Jurkat细胞荧光素酶活性升高了1.26±0.49倍.与Jurkat细胞相比,MT2细胞和TaxP细胞的相对荧光素酶活性明显升高(P＜0.01);Real-time PCR结果显示,4组Ct内参/Ct目的基因的值依次是0.40±0.02、0.44±0.01、0.47±0.02、0.53±0.02; DcR3 mRNA的表达与转染pCMV-Tax存在着剂量依赖性(P＜0.05).流式细胞技术检测,MT2和TaxP细胞实验组DcR3蛋白的表达较对照组Jurkat细胞表达的高(P＜0.05).MT2细胞的结果是33.1 ±9.9,TaxP细胞的结果是35.1 ±4.8,Jurkat细胞的结果是16.9±2.3.结论 Tax蛋白能够促进DcR3基因在T细胞中的表达.     

反义DcR3 RNA转染诱导肝癌细胞凋亡的作用

目的研究DcR3反义mRNA在肝癌细胞凋亡中的作用。方法构建pVAXⅠ-as-DcR3反义表达载体，转染肝癌细胞，Western blot法观察DcR3蛋白合成有无降低，流式细胞术、TUNEL等方法观察凋亡变化。结果Western blot证实反义重组体可有效阻滞DcR3表达，同时转染了pVAXⅠ-as-DcR3的肝癌细胞凋亡较对照组增多。结论DcR3反义RNA可使肝癌细胞凋亡增多。     

诱骗受体3对肺纤维化动物模型早期的作用

目的:探讨诱骗受体3(DcR3)对肺纤维化动物模型早期的作用。方法:博莱霉素(BL)气管内灌注复制大鼠肺纤维化模型,ELISA检测支气管肺泡上清中的TGF-β的含量,HE和MASSON染色观察大鼠模型肺组织病理变化。结果:BL+DcR3组TGF-β的含量与对照组比较无统计学差异(P0.05),与BL组比较有统计学意义(P0.05)。BL+DcR3组2周的炎症程度和4周的肺纤维化程度明显低于BL组。结论:DcR3早期应用可抑制肺纤维化动物模型TGF-β的产生,从而延缓或阻止肺纤维化的发生。     

人DcR3 表达载体的构建及验证

目的:构建人DcR3 表达载体并验证其在体外细胞表达情况。方法:从人血液组织中扩增出DcR3 中长度915 bp 的CDS 区,将其克隆到带有红色荧光的真核表达载体pEF1a-IRES-DsRed-Express2 上,用FuGene HD 转染法转染到肝星状细胞(LX-2)中,用RT-PCR 以及Western blot 检测其mRNA 表达量和蛋白表达量。结果:通过RT-PCR 和Western blot 检测显示转染DcR3 表达载体质粒的肝星状细胞中DcR3 的转录和翻译水平均显著性提高。结论:成功构建出人DcR3 表达载体并在LX-2 细胞中高效表达。     

DcR3与自身免疫及肿瘤免疫

最近发现的TNFR家族成员—DcR3 TR6 ,在某些肿瘤和自身免疫病中高度表达 ,它能竞争性地与LIGHT及FasL结合 ,并抑制了疱疹病毒侵入介体配体 (LIGHT)及FasL介导的凋亡 ,可能与肿瘤的免疫逃逸和自身免疫病的发病有关。本文拟就有关内容作一综述。     

DcR3及其配体的研究进展

DcR3/TR6是最近发现的可溶性TNFR超家族成员,在归类上属于第三类,其配体具有多样性。它可竞争性地与FasL、LIGHT及,TL1A结合,在肿瘤免疫、移植免疫、自身免疫及抗感染免疫中都发挥着重要的作用。本文拟就DcR3及其配体的研究进展作一综述。     

肝细胞癌中DcR3表达与癌细胞凋亡的关系研究

目的探讨诱捕受体3（decoy receptor 3,DcR3）蛋白在原发性肝细胞癌（HCC）中的表达及其与癌细胞凋亡和HCC预后的关系。方法应用免疫组织化学（EnVision法）及和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）技术检测43例HCC,16例非癌肝组织（单纯性肝硬化及肝血管瘤周围正常肝组织）中DcR3蛋白的表达及凋亡情况,并分析其与临床病理参数的关系。结果DcR3明确定位于肝细胞胞质内;HCC组织中的DcR3蛋白的阳性率为74．42％（32／43）,明显高于非癌肝组织43．75％（7／16,P〈0．05）;HCC中有转移癌组DcR3阳性率为100％（22／22）,明显高于无转移组52．94％（9／17,P〈0．01）;DcR3蛋白的表达与AFP水平（r=0．444,P〈0．01）、门静脉癌栓（r=0．414,P〈0．01）有关,与年龄、性别、有无肝硬化、包膜浸润、肿瘤结节数及分化程度无关（P〉0．05）。HCC中细胞凋亡指数[AI（0．78±0．64）％]明显低于非癌肝组织[（3．32±1,81）％,P〈0．01];HCC临床TNM分期Ⅰ、Ⅱ期AI（1．03±0．69）％高于Ⅲ、Ⅳ期[（0．52±0．48）％,P〈0．01];HCC无转移组AI（1．10±0．72）％高于转移组[（0．44±0．27）％,P〈0．01];AI与AFP水平（r=-0．468,P〈0．01）、门静脉癌栓（r=-0．434,P〈0．01）、包膜浸润（r=-0,331,P〈0．05）有关,与年龄、性别、有无肝硬化、肿瘤结节数及分化程度无关（P〉0．05）。在HCC和非癌肝组织中,DcR3阳性者的AI均分别低于阴性者的AI（均P〈0．01）。结论DcR3表达可影响凋亡并在HCC的发生发展中起重要作用;检测DcR3蛋白与AI有助于判断HCC患者预后。     

DcR3及其配体的研究进展

DcR3／TR6是最近发现的可溶性TNFR超家族成员，在归类上属于第三类。其配体具有多样性。它可竞争性地与FasL、LIGHT及TLIA结合，在肿瘤免疫、移植免疫、自身免疫及抗感染免疫中都发挥着重要的作用。本文拟就DcR3及其配体的研究进展作一综述。     

慢性乙肝患者外周血单个核细胞TRAIL受体表达及其临床意义

目的探索慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMC)肿瘤细胞坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)受体在PBMC凋亡中的作用,及其与机体肝脏损伤的相关性。方法用RT-PCR和流式细胞术检测55例慢性乙肝患者(包括轻度、中度、重度)外周血单个核细胞TRAIL各受体(DR4、DR5、DcR1和DcR2)表达水平,同时检测肝功能相关指标,并进行相关性分析。以30例正常人作为对照。结果诱骗受体DcR1在慢性乙肝患者中的表达显著低于对照组(P<0.05)。DcR1的表达随慢性乙肝病情的加重而逐渐降低。慢性乙肝患者的DcR1表达与转氨酶(ALT)呈显著负相关,与血清白蛋白成显著正相关。结论慢性乙肝患者外周血单个核细胞DcR1表达下调可能是其细胞凋亡增加的机制之一,且DcR1表达情况可从一定程度上反映肝脏的损伤程度。