隐丹参酮诱导猴骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的： 体外培养猴骨髓间质干细胞（MSCs）并定向诱导分化为神经元样细胞。 方法： 体外分离培养猴MSCs，流式细胞仪检测其表面标志，用含隐丹参酮的无血清L-DMEM诱导MSCs分化为神经元样细胞，免疫细胞化学检测单克隆抗体特异性神经元烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。 结果： 体外培养的猴MSCs表达CD29、CD44、CD105、CD166，并且具有正常的二倍体核型，不随传代而发生改变。bFGF预诱导24 h 后，隐丹参酮可以将MSCs诱导为神经元样细胞，免疫细胞化学显示NSE、NF表达阳性，阳性率分别为68.3％±3.5％、70.3％±1.5％，而GFAP表达阴性。 结论： 隐丹参酮可以在体外将猴MSCs诱导分化为神经元样细胞。     

Wnt3a促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

目的:寻找促进骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的Wnt信号分子。方法:首先体外分离培养大鼠MSCs并传代,形态学观察和流式细胞学检测细胞表型CD44、CD9、CD34和CD45。采用bFGF分别联合Wnt3a或Wnt5a的方案诱导分化。免疫组化和RT-PCR的方法比较Wnt3a和Wnt5a对MSCs向神经元样细胞分化的影响。结果:MSCs为长梭形,CD9、CD44高表达,CD34、CD45低表达。Wnt3a诱导组的Nestin和NSE呈阳性,而GFAP无明显表达,诱导后细胞的活力良好。Wnt5a诱导组Nestin呈弱阳性表达,而NSE及GFAP阴性。RT-PCR结果显示Wnt3a诱导组Nestin在诱导前后均有表达,NSE在诱导后5d可见明显的扩增条带,10d后更加明显。GFAP在诱导10d后出现较弱的扩增条带。Wnt5a组、对照组MSCs在诱导后10dNestin有微弱表达,NSE和GFAP几乎无表达。结论:Wnt3a分子能够促进体外培养的MSCs向神经元样细胞分化。     

天然脑活素定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

目的： 探讨天然脑活素（NC）诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的作用。方法: 取6-8周龄SD大鼠,无菌获取胫骨和股骨骨髓,全骨髓贴壁筛选法分离培养并纯化大鼠MSCs,应用天然脑活素诱导MSCs向神经元分化。倒置相差显微镜追踪比较观察分化过程中细胞形态的变化,免疫细胞化学和逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)方法检测神经元特异性标志物：巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶(NSE) 、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。免疫细胞化学检测细胞微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达。结果：经全骨髓贴壁筛选法获得了纯度较高（90%以上）的大鼠MSCs,天然脑活素含药血清诱导分化后的细胞呈现双极、多极和锥形的典型神经元细胞的形态,分别从mRNA和蛋白水平上证实诱导分化后的细胞表达神经元标记物NSE和nestin,不表达神经胶质细胞标记物GFAP。诱导分化后细胞MAP-2的表达明显。结论：天然脑活素可诱导MSCs向神经元样细胞的定向分化。     

丹参诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化及相关基因的表达

目的分析骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化前后相关基因的表达。方法用丹参诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化,诱导后90mins,提取诱导前后的骨髓基质干细胞总RNA,RT-PCR检测ngn-1,mash-1的表达及观察其诱导前后的表达情况,免疫组化检测NSE和GFAP的表达情况。结果未经诱导的骨髓基质干细胞ngn-1,mash-1 mRNA为阴性,诱导后有表达。诱导后的细胞NSE和GFAP呈阳性反应。结论骨髓基质干细胞向神经元样的分化与ngn-1,mash-1可能有关。     

丹参诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化

目的:探讨骨髓间充质干细胞(marrow stromal stem cells,MSCs)向神经细胞分化中神经蛋白分子及相关基因的表达情况。方法:分离提取大鼠的MSCs,体外培养扩增。用含丹参的无血清的L-DMEM培养基进行诱导,并以不含丹参的无血清L-DMEM培养基作为对照。提取两组的MSCs总RNA,RT-PCR检测ngn-1、mash-1的表达。结果:丹参诱导90 min后,细胞发生了明显的形态学变化,大多数细胞转变为类似双极或多极神经元样形态,伸出轴突或树突样突起。免疫细胞化学显示诱导后的MSCs表现为nestin、NSE、GFAP染色阳性,对照组为阴性。未经诱导的MSCs ngn-1,mash-1 mRNA为阴性,诱导后有表达。结论:丹参可诱导大鼠MSCs向神经前体细胞和神经细胞分化。MSCs向神经元样的分化可能与ngn-1,mash-1有关。     

三七总皂甙和维甲酸联合诱导大鼠MSCs分化为神经元样细胞

目的： 体外探讨三七总皂甙、维甲酸对大鼠骨髓间质干细胞（MSCs）分化为神经元样细胞的影响。 方法： 以三七总皂甙和维甲酸为诱导条件诱导大鼠MSCs分化，免疫细胞化学检测分化细胞的神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、乙酰胆碱酯酶（AchE）、γ-氨基丁酸（GABA）、酪氨酸羟化酶（TH）的表达情况。 结果： 免疫细胞化学显示MSCs诱导后具有神经细胞的形态， NSE、AchE、GABA、TH有阳性表达，GFAP表达为阴性。 结论： 三七总皂甙和维甲酸联合应用对大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞及在提高其分化率中起着重要作用。     

体外诱导人脐静脉间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

探讨来源于人脐静脉内皮及内皮下分离的间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的可能性,以期为脐静脉MSCs的神经移植提供理论依据。通过在无菌条件下收集正常足月剖宫产新生儿脐带并对脐静脉进行胶原酶消化,将获取的内皮及内皮下贴壁细胞进行培养。经传代培养及免疫细胞化学鉴定后,取第2代细胞用β-巯基乙醇和二甲基亚砜诱导其向神经元方向分化,并以免疫细胞化学方法对分化细胞进行鉴定。结果表明脐静脉经胶原酶消化后的贴壁细胞主要表现为间充质样细胞和内皮细胞;传2代后,间充质样细胞可得到纯化和扩增。免疫细胞化学染色显示诱导前细胞不表达血管性血友病因子(vWF),诱导后MSCs表达巢蛋白(nestin)和神经元特异性烯醇化酶(NSE),而不表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。以上结果提示,来源于脐静脉内皮及内皮下的MSCs在体外可以培养、扩增,并具备在诱导剂的作用下向神经元样细胞分化的潜能,可作为神经系统疾病细胞移植治疗的备选来源。     

Caveolin-1在大鼠骨髓间质干细胞分化为神经细胞中的作用

目的:探讨caveolin-1在骨髓间质干细胞(MSCs)分化为神经细胞中的作用。方法:实验分为未转染组、转染组(转染Rn-caveolin-1-siRNA)、阳性对照组(转染Rn-MAPK-1control siRNA)及阴性对照组(转染negative control siRNA)4组。采用β-巯基乙醇诱导大鼠MSCs分化为神经细胞。倒置荧光显微镜下观察MSCs转染后荧光表达情况;RT-PCR检测caveolin-1和促分裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)mRNA的表达变化;免疫细胞化学法检测caveolin-1、神经元烯醇化酶(NSE)、神经微丝亚单位(NF-M)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达变化;MTT方法检测细胞存活率。结果:(1)siRNA转染72h,MSCs荧光表达最强,转染率可达(81.5±2.8)%;而且转染组MSCs的caveolin-1mRNA转录下降(P0.05);MTT提示转染组细胞存活率无显著变化(P0.05)。(2)β-巯基乙醇可以诱导MSCs向神经细胞分化,其中以转染组诱导效果最佳,NSE、NF-M的表达率显著高于其它各组(P0.01)。(3)随诱导时间延长,各组caveolin-1表达持续增加,诱导6d达到峰值,与诱导前、诱导6h相比有显著差异(P0.05)。此外,转染组与其它各组同时点的caveolin-1表达均显著降低(P0.01)。结论:以caveolin-1为标记蛋白的脂筏在MSCs诱导分化为神经细胞中可能起到重要的调控作用。     

人脐带间充质干细胞的富集及向神经细胞的诱导分化

目的:寻找一种稳定、高效的分离人脐带间充质干细胞(MSCs)的方法,并探讨脐带MSCs向神经细胞方向分化的可能性。方法:分别采用组织块贴壁法和双酶消化法分离人脐带MSCs,对比其培养成功率;BrdU掺入实验检测脐带MSCs的增殖能力;流式细胞仪检测脐带MSCs表面分子标志;采用丹参联合生长因子的方法诱导其向神经细胞分化,免疫荧光方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:组织块贴壁法获得脐带MSCs成功率高;BrdU阳性标记率达90%以上;流式细胞仪检测显示细胞表达CD29、CD44和CD90,不表达CD34;脐带MSCs经诱导分化,伸出长突起,呈神经元样细胞改变,且表达神经元标志性蛋白NSE、MAP2。神经胶质细胞标志性蛋白GFAP表达较少。结论:成功建立了高效、稳定的脐带MSCs分离培养方法。脐带MSCs经诱导可向神经细胞方向分化,为临床移植治疗神经系统疾病提供了理想的细胞来源。     

骨髓间充质干细胞分化神经元后多巴胺D2受体的表达

目的:检测骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化为神经元后多巴胺D2受体(dopamine receptor D2,DRD2)的表达,探讨体外分化神经元的基本功能。方法:采用密度梯度离心法和贴壁培养的方法分离纯化MSCs,流式细胞仪检测MSCs表面标志,DMSO/BHA/FSK作为诱导剂来诱导分化;硝酸银染色法检测神经纤维丝,RT-PCR和免疫细胞化学法检测NSE、DRD2 mRNA及蛋白的表达情况。结果:分离纯化的MSCs经流式细胞仪检测显示CD34、CD45表达阴性;间充质干细胞相对特异性标志CD44强阳性表达;加入诱导剂后,MSCs形成多极神经元的形态。银染色法显示神经纤维丝阳性表达,RT-PCR显示诱导后细胞表达NSE、DRD2 mRNA,免疫组化显示NSE、DRD2蛋白表达阳性。结论:MSCs分化为神经元后可以表达神经受体DRD2。     

骨髓基质干细胞诱导成神经元样细胞分化相关基因的表达

目的:分析骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化前后相关基因的表达。方法:用β-巯基乙醇诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化,诱导后8 h,提取诱导前后的骨髓基质干细胞mRNA,进行微管相关蛋白-2(MAP-2)、生长相关蛋白43(GAP-43)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、中间丝nestin和神经丝(NF)基因的RT-PCR,观察其诱导前后的表达。结果:NSE在诱导前后均有表达, MAP-2、GAP-43、nestin和NF诱导前无表达, 诱导后有表达。结论: 骨髓基质干细胞向神经元样细胞的分化与MAP-2、GAP-43、nestin和NF可能有关。     

大鼠MSCs体外诱导分化为神经元样细胞过程中发生细胞凋亡的机制研究

目的： 探讨体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化过程中凋亡发生的机制。方法：分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,随机分为3组：对照组为单纯β-巯基乙醇诱导分化组; NEK1/2抑制剂1,4-二氨基-2,3-氰基-1,4-双［2-氨基苯基硫代］丁二烯（U0126）组为自预诱导开始在加入β-巯基乙醇的同时加入10 μmol/L U0126;蛋白激酶PKC激动剂氟波酯(PMA)组为自预诱导开始在加入β-巯基乙醇的同时分别加入30 nmol/L、120 nmol/L与300 nmol/L PMA。诱导5 h后终止反应,MTT法检测细胞活性,免疫细胞化学检测神经元特异性巢蛋白nestin及凋亡相关蛋白caspase、Bcl-2、Bax的表达情况,TUNEL法检测细胞凋亡指数。结果： 诱导后5 h与对照组相比,U0126组神经元样细胞的活性、nestin的表达、Bcl-2蛋白阳性表达率均出现增强或升高(P<0.05),细胞凋亡指数降低(P<0.05);300 nmol/L PMA组则显著抑制神经元样细胞的活性和nestin的表达(P<0.05),增强Bax并降低Bcl-2的表达(P<0.05),细胞凋亡指数明显升高(P<0.05)。结论： 大鼠MSCs诱导分化为神经元样细胞过程中发生凋亡机制涉及MAPK及PKC信号途径。     

黄连素诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的:黄连素体外定向诱导SD大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。方法:用全骨髓细胞悬液体外扩增和纯化骨髓间质干细胞。选用第5代以后骨髓间质干细胞进行诱导分化,用含10 μg/L碱性细胞生长因子(bFGF)的完全培养液预诱导24 h,后更换含黄连素的无血清DMEM诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。免疫组化鉴定神经元烯醇酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:大鼠骨髓间质干细胞体外扩增第5代后细胞形态达到均一,成梭形。加黄连素诱导1h-8 h,间质干细胞胞体逐渐增大并伸出细长突起,形似神经细胞。免疫组化显示诱导的神经元样细胞NSE、NF表达阳性,GFAP阴性。结论:黄连素可诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

骨髓间质干细胞定向分化的实验研究

为了探讨体外定向诱导人骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的机制,本研究将分离的人MSC进行体外扩增培养,并观察脑心舒定向诱导MSC分化为类神经元样细胞的效应。在光镜下观察细胞形态,用免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志。结果显示人MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。脑心舒诱导120min后大部分MSC转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE、nestin呈阳性和GFAP阴性。上述结果提示人骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

神经生长因子转染骨髓间充质干细胞诱导分化成神经样细胞

目的探讨神经生长因子(NGF)转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)后的表达及其对MSCs分化成神经样细胞的影响。方法在体外低密度扩增大鼠骨髓MSCs。应用基因重组技术,构建pEGFP-NGF真核表达质粒,并将其转染至MSCs中。免疫荧光标记法检测中间神经丝蛋白(NF-M)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。在荧光显微镜下观察MSCs阳性荧光的表达率、细胞的形态变化和类型。结果MSCs阳性荧光的表达率约为30%。转染后,MSCs呈现多突起,且几个突起之间互相连接成网状,似神经元样的形态。免疫荧光标记法鉴定其中一部分细胞表达NF-M,另一部分细胞表达GFAP。结论转染的MSCs可表达NGF并在含有NGF的微环境中分化成神经样细胞。