sea基因定位突变体构建及其重组表达产物生物学活性的研究

目的 构建葡萄球菌肠毒素A（SEA）基因及其突变体原核表达系统，了解突变前后重组表达产物的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长活性的变化。方法采用高保真PCR和TA克隆法，从金黄葡萄球菌ATCC13565株DNA中扩增并克隆了不含信号肽序列的湖基因。采用突变引物PCR构建sea基因定位突变体。建立sea基因及其定位突变体原核表达系统。Ni—NTA亲和层析法提纯表达的目的重组蛋白。采用TCID50。法测定目的重组蛋白对Vero细胞的细胞毒性。采用MTT比色法分别检测不同浓度的目的重组蛋白促小鼠脾细胞增殖及对抑制KB和HL-60癌细胞株生长的作用。结果 所克隆的sea基因核苷酸序列与报道序列的相似性为100％，7种突变体均在既定位置获得预期的密码子突变。rSEA和各突变体重组蛋白表达量约为细菌总蛋白的52％。rSEA对Vero细胞TCID50为4．1μg，其突变体重组蛋白分别为5．8～23．5μg。1和5μg/ml的rSEA及其5种突变体重组蛋白rSEA／H187A、rSEA／H225A、rSEA／D227A、rSEA／H187A／D227A和rSEA／H225A／D227A对小鼠脾细胞均有明显的促增殖作用（P〈0．05），10和20μg/ml的rSEA及上述5种突变体重组蛋白促小鼠脾细胞增殖活性与100μg/ml PHA相似（P〉0．05）。5～20μg/ml的rSEA及上述5种突变体重组蛋白作用的小鼠脾细胞上清及其上清与脾细胞混合物均能有效地抑制KB和HL-60细胞生长（P〈0．05）。结论 本研究成功地构建了sea基因突变体及其高效原核表达系统，其表达产物的细胞毒性均有所降低。由于rSEA／H225A、rSEA／D227A、rSEA／H225A／D227A细胞毒性较低、促脾细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长活性较强，可作为研制升白细胞、抗肿瘤SEA相关药物的候选突变体。     

人截短型凋亡诱导因子的表达对HeLa细胞的促凋亡作用

目的：观察人截短型AIF基因的表达对HeLa细胞的促凋亡作用。方法：用RT-PCR法分段克隆全长人AIF基因，经改造截去其N-端线粒体定位信号及部分Spacer区域（1-120位氨基酸）的编码序列，从而获得人截短型AIF（AIF△1-120）基因。将其克隆入pIRES2-EGFP绿色荧光蛋白（EGFP）共表达载体，用脂质体法转染HeLa细胞，通过荧光显微镜观察。免疫组织化学检测，间接免疫荧光检测，电镜观察等方法。检测目的基因在转染细胞中的表达，以及对转染细胞的形态及生长状况的影响。结果：成功地构建了人截短型AIF（AIF△1-120)基因的真核表达载体。转染HeLa细胞后，可检测到人截短型AIF分子的表达，随着转染后时间的延长，可观察到表达人截短型AIF分子的HeLa细胞呈现典型的凋亡特征。结论：人截短型AIF基因的表达可诱导HeLa细胞凋亡。     

截短型人凋亡诱导因子AIF△1-400对HeLa细胞的促凋亡作用

目的：观察人截短型AIF（AIF△l-400）对HeLa细胞的促凋亡作用。方法：在AIF△l-120基因克隆成功的基础上进一步改造，构建截去AIF基因线粒体定位信号、FAD结合结构域和NADH结合结构域（1～400位氨基酸）编码序列的AIF△l-400基因，将其克隆人pcDNA3真核表达载体，用脂质体法转染HeLa细胞，通过Western blot检测该基因在转染细胞中的表达通过电镜观察截短型分子对肿瘤细胞的具有促凋亡活性。结果：经酶切鉴定与测序证实，AIFAl-400的真核表达载体构建成功。通过Western blot证实截短型基因在HeLa细胞中表达，电镜观察可见转染细胞骨架的破坏和细胞核固缩等凋亡特征。结论：人截短型AIF（AIF△l-400）基因的表达可诱导HeLa细胞凋亡。     

雌二醇促人乳腺细胞株增殖及其ERβ表达

 目的：观察不同浓度雌二醇（E₂）对HBL-100细胞的增殖作用及ERβ的表达。方法：用MTT法观察不同浓度E₂处理后细胞增殖情况，流式细胞仪分析细胞周期，免疫组化法检测ERβ表达。结果：E₂（0.01-1 μmol/L）可增强HBL-100的增殖活性，G₁、G₂/M期细胞增多，S期细胞减少；ERβ表达从胞质转至胞核。结论：E₂具有促进人乳腺细胞增殖的作用，可能与ERβ重新分布有关。     

P3启动子调控融合基因质粒构建及在肝癌细胞中表达(英文)

目的：构建人胰岛素样生长因子Ⅱ基因（IGF-Ⅱ）P3启动子驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶（tk）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合基因穿梭质粒，观察其在肝癌细胞系HepG2及宫颈癌细胞系HeLa细胞中的表达及其作用。方法：应用基因重组技术，构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动EGFP与tk融合表达穿梭质粒载体，脂质体转染技术将其转入HepG2及HeLa中，48 h后荧光显微镜下观察荧光表达,RT-PCR法检测tk和EGFP mRNA表达，四甲基偶氮唑蓝（MTT）实验检测转染融合蛋白载体后给予不同浓度的GCV对HepG2及HeLa细胞毒作用。结果:酶切鉴定和测序分析证实重组质粒构建成功；转染此穿梭质粒的细胞中仅有HepG2细胞检测到绿色荧光；RT-PCR检测到tk和EGFP的mRNA仅在HepG2细胞中表达；GCV对转染了携此质粒载体的HepG2细胞有选择性细胞毒作用。结论:成功构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体，转染后对人肝癌细胞系HepG2有选择性杀伤作用，为进一步靶向性肝癌腺病毒基因治疗奠定了基础。     

牛蒡子苷诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的实验研究

目的：通过牛蒡子苷对肿瘤细胞的体外实验，探讨牛蒡子苷是否对人肝癌细胞（HepG2）具有生长抑制及诱导凋亡作用。方法：HepG2细胞培养液中加入不同浓度的牛蒡子苷，培养72 h，观查HepG2细胞的增殖率；倒置显微镜及投射电子显微镜观察HepG2细胞的形态变化；流式细胞仪（FCM）检测HepG2细胞周期及凋亡率；TUNEL法检测HepG2细胞凋亡率；免疫细胞化学检测HepG2细胞的增殖凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2)表达。结果： 牛蒡子苷抑制HepG2细胞生长；阻滞HepG2细胞周期于G0/G1期并诱导细胞凋亡(P＜0.05)；通过下调Bcl-2蛋白表达（P＜0.01），上调Bax蛋白表达（P＜0.05）诱导HepG2细胞凋亡。结论： 牛蒡子苷对体外培养的HepG2细胞生长有抑制作用,其作用机制之一是通过诱导细胞凋亡。     

hTERT干扰对HepG2肝癌细胞Smac表达的影响

目的检测RNAi靶向抑制hTERT基因表达促HepG2肝癌细胞凋亡与Smac的关系，探讨hTERT干扰促进细胞凋亡的可能机制。方法收集hTERT基因RNAi真核表达载体稳定转染第20代的HepG2肝癌转染细胞、对照细胞（转染空载体质粒）及未转染细胞，通过Westernblot检测胞内XIAP和caspase-3，以及线粒体和胞浆Smac的表达；采用共聚焦显微镜观察线粒体膜电位变化。结果与未转染细胞和对照细胞相比，转染细胞内XIAP表达明显减少（P〈0．05），caspase-3表达明显增加（P〈0．05），线粒体Smac表达明显减少（P〈0．05），而胞浆Smac表达明显增加（P〈0．05）；转染细胞线粒体膜电位明显降低。结论RNAi靶向抑制hTERT基因表达可能通过降低HepG2肝癌细胞线粒体膜电位，引起Smac从线粒体释放入胞浆，进而抑制XIAP表达，促进caspase-3表达增加诱导细胞凋亡。     

重构型人caspase-8基因的表达及其对HeLa细胞生长的影响

目的 克隆人caspase-8催化结构域基因片段，并将其改建成2种大、小亚基基因次序颠倒的重构型人caspase-8基因，转染HeLa细胞，观察重构型人caspase-8基因的表达及其对HeLa细胞生长的影响。方法 用RT－PCR法，克隆人caspase-8催化结构域基因片段，经重组PCR改造，构建大、小亚基基因次序颠倒的重构型人caspase-8基因。将其克隆入绿色荧光蛋白（GFP）真核表达载体pIRES2-EGFP，转染HeLa细胞，用荧光显微镜和倒置显微镜镜观察细胞的形态和结构。结果 用RT－PCR法，成功地克隆了人caspase-8催化结构域基因片段，构建了3种重构型人caspase-8基因及其真核表达载体。转染HeLa细胞后，重构型人caspase-8基因的表达可导致HeLa细胞死亡。结论 重构型人caspase-8基因在HeLa细胞中的表达可以有效地引起HeLa细胞死亡。     

人Epsilon干扰素在CHO细胞中的表达及生物学活性的研究

目的 为了研究新发现的人epsilon干扰素（hIFN-ε）的生物学活性，我们通过RT-PCR克隆了hIFN-ε基因，并构建pcDNA3．1／myc-his（-）A-hIFN-ε（以下简称pcDNA3-1A-hIFN-ε）的真核表达载体，在CHO细胞中表达，并研究真核细胞重组表达的rhIFN-ε的生物学活性。方法 用TNF-α刺激人宫颈癌HeLa细胞，抽提总RNA，经RT-PCR获得全长cDNA，与pcDNA3．1／myc-his（-）A真核表达载体连接，构建重组体pcDNA3．1A-hIFN-ε并在CHO细胞中进行表达，采用微量细胞病变抑制试验研究表达产物中的rhIFN-ε对多种病毒的抗病毒活性；MTT法检测其对A375、HeLa和A549细胞的生长影响，并通过在Wish、HeLa、A375细胞中诱导MxA抗病毒蛋白的产生研究hIFN-ε的抗病毒机制。结果 经PCR和限制性酶切鉴定以及DNA测序，结果表明已经成功构建了重组体pcDNA3．1A-hIFN-ε，并在CHO细胞中稳定表达了rhIFN-ε蛋白，该蛋白具有抗HSV-I、PolioV、Ad3和VSV病毒的作用，能够抑制HeLa、A375、A549细胞的生长，刺激Wish、HeLa、A375细胞产生MxA蛋白。结论 本研究成功地构建了pcDNA3．1A-hIFN-ε真核表达载体并在CHO细胞中获得稳定表达，证明了ddFN．￡蛋白具有抗病毒和抗增殖活性，其抗病毒效应的分子机理可能与诱导细胞产生MxA抗病毒蛋白有关，为今后研究rhIFN-ε的生物学功能和基因重组药物研制及其开展基因治疗奠定了基础。     

靶向腺病毒载体介导的EGFP基因在甲胎蛋白阳性肝癌细胞的特异表达

目的：建立一种在甲胎蛋白(AFP)阳性的肝癌细胞中靶向表达目的基因的重组腺病毒载体。方法： 基于腺病毒载体Adeno-XTM Expression system,以300 bp AFP特异启动子替换穿梭质粒Pshuttle中CMV启动子，将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为报告基因亚克隆至Pshuttle，HEK293细胞包装腺病毒，收集病毒后分别转染人正常肝脏LO2细胞，人肝癌HepG2细胞及HeLa细胞；通过Northern杂交检测EGFP基因在3种细胞中的转录水平，荧光显微镜下观察3种细胞中绿色荧光蛋白的表达。结果：Northern杂交显示，HepG2细胞中有大量EGFP基因的转录，而正常肝细胞LO2和HeLa细胞中仅能检测到微量基因的转录；荧光显微镜检测发现HepG2细胞内有强绿色荧光表达，而在LO2以及HeLa细胞内见极弱绿色荧光。 结论： 在AFP特异启动子作用下，腺病毒携带的目的基因在AFP阳性的肝癌细胞中得到显著转录和表达，而在非AFP阳性细胞仅微量转录，蛋白表达极弱。该腺病毒载体可作为AFP阳性的肝癌基因靶向治疗的适宜载体。     

重组人CRP的表达纯化及其内化进入HeLa细胞的观察

目的： 构建人C-反应蛋白(CRP)原核表达载体，表达纯化his-EGFP-CRP蛋白，观察其能否内化进入HeLa肿瘤细胞。方法: 利用特异性引物，从p91023/CRP载体上将编码人CRP 的基因序列亚克隆到原核表达载体pET14b/MCS-EGFP-(N)36上；对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定，并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，表达的重组蛋白通过亲和色谱纯化，梯度透析复性，并与HeLa细胞孵育，利用荧光显微镜观察其内化入胞。结果: PCR、双酶切和测序鉴定表明，pET14b/EGFP-hCRP原核表达质粒构建正确；转化实验发现，该质粒在BL21(DE3)中能够被大量诱导表达；蛋白纯化及荧光显微镜观察结果表明，复性后的表达产物可结合于HeLa细胞膜，孵育一定时间后，可定位于胞质及胞核。结论: 成功地构建了带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标签的人CRP原核表达载体，该载体能够在大肠杆菌BL21(DE3)中被诱导表达重组蛋白his-EGFP-CRP，纯化复性后的重组人CRP能与HeLa肿瘤细胞结合，并能内化入胞，移位入核。     

Nodosin对HepG2细胞株的增殖抑制作用及对Bcl-2和Bax表达的影响

 目的:研究传统中药提取物nodosin对体外培养的人肝癌细胞株HepG2的增殖抑制作用,并探讨其对Bcl-2和Bax表达的影响。方法:将不同浓度组（1.25、2.5、5、10和20 μmol/L）nodosin预作用于HepG2细胞24 h,用倒置显微镜观察nodosin对细胞形态学的影响,采用MTT法检测细胞生长抑制率,用流式细胞术检测细胞凋亡率和Bcl-2、Bax的表达。结果:形态学结果显示,随着nodosin剂量的增加,细胞皱缩和漂浮细胞数量增加,流式细胞术检测结果显示随着nodosin药物浓度的增加,HepG2细胞凋亡率增加。Bax的表达随着nodosin剂量的增加逐渐增加, Bcl-2的表达逐渐减少。结论: Nodosin能抑制HepG2细胞株的增殖,呈明显的剂量依赖性,对HepG2细胞的抑制作用是通过增加Bax的表达以及降低Bcl-2的表达诱导细胞凋亡实现的。     

逆转录病毒介导IL-18基因在大鼠胶质瘤细胞C6中的表达

目的 :建立表达IL 18基因的大鼠胶质瘤细胞C6 /IL 18,并探讨外源性IL 18基因对C6细胞生长的影响。方法 :应用逆转录病毒载体 ,将IL 18基因导入C6细胞。经G4 18筛选后 ,获得表达IL 18分子的细胞克隆C6 /IL 18。用RT PCR法检测目的基因mRNA的表达 ;用流式细胞和免疫细胞化学染色法检测目的蛋白的表达。用ELISA法检测C6 /IL 18细胞培养上清诱导脾细胞分泌IFN γ的能力 ,以确定IL 18的生物学活性。用MTT比色法检测细胞体外增殖的状况 ,用流式细胞技术检测细胞的增殖活性 ,并建立大鼠胶质瘤模型 ,观察C6 /IL 18细胞体内致瘤性的改变。结果 :外源IL 18基因于mRNA水平和蛋白水平可获得稳定表达 ,并可诱生大鼠脾细胞分泌IFN γ。同时 ,该细胞系的体外增殖率及体内致瘤性 ,均较亲代C6胶质瘤细胞明显下降。结论 :外源性IL 18基因能部分地抑制C6细胞的体外增殖率和体内致瘤性。建立了可进一步用于相关肿瘤基因免疫和基因治疗研究的大鼠胶质瘤细胞系C6 /IL 18。     

超抗原SEA的基因克隆、原核表达与鉴定

目的：构建pRSET-SEA重组表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，诱导表达超抗原葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A，SEA)，进行分离、纯化及western bolt鉴定。方法：采用PCR技术，从产SEA的葡萄球菌标准菌株FRI100基因组DNA中获得SEA全长序列，克隆人pUC19中，进行测序，构建pRSET-SEA表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导表达，分离、纯化及western blot鉴定。结果：PCR获得超抗原SEA基因片段，DNA测序结果与文献报道一致；构建了pRSET-SEA表达质粒，并成功地诱导表达出32000u的蛋白；Western blot鉴定所得蛋白能够与SEA单克隆抗体特异性结合。结论：本研究成功地克隆了SEA全长，并进行了原核表达和分离、纯化，获得了SEA蛋白。     

超抗原SEA活化淋巴细胞抗肿瘤活性的实验研究

纯化SEA在 10 -12 ～ 10 -5g/ml浓度范围对体外培养的BALB/c鼠脾细胞表现了细胞增殖诱导能力 ,并呈剂量依赖关系 ,其中 10 -7～ 10 -5g/mlSEA的作用强于最适量 ( 2 5 μg/ml)PHA。在E/T为 5∶1～ 2 0∶1条件下 ,10 -5g/mlSEA活化 48h的BALB/c鼠脾细胞对YAC 1细胞的杀伤活性高于NK细胞 ,但SEA未能增强BALB/c鼠脾细胞对B16细胞的杀伤活性。 5 μg和5 0 μgSEA体内用药对L615白血病无治疗作用 ,但转输经SEA活化的同系小鼠脾细胞对L615白血病有一定疗效。实验结果提示 ,SEA活化淋巴细胞对NK敏感的淋巴瘤、白血病有杀伤及治疗作用 ,这种作用依赖于较大数量级SEA活化淋巴细胞的存在 ,并且与SEA活化T细胞分泌的细胞因子有关     

rhTGF-β1及转染TGF-β1基因对兔角膜内皮细胞增殖的影响

目的： 探讨不同浓度的重组人转化生长因子-β₁(rhTGF-β₁)及TGF-β₁基因转染对体外培养兔角膜内皮细胞增殖的影响。方法: 用MTT法检测不同浓度rhTGF-β₁作用下角膜内皮细胞的增殖。用脂质体介导转染方法，将TGF-β₁基因转移入培养的兔角膜内皮细胞，HE染色法观察细胞组织形态学变化；ELISA法检测转染细胞培养上清中TGF-β₁表达量；流式细胞仪检测细胞生长周期变化；DNA电泳法检测转染细胞凋亡情况。结果: MTT检测示5-20 μg/L rhTGF-β1抑制角膜内皮细胞增殖；0.5-1 μg/L组对增殖无影响；0.05~0.1 μg/L组促进细胞增殖。TGF-β₁基因转染细胞形态无明显异常，细胞培养上清中TGF-β₁的浓度约为(98±3)ng/L。流式细胞仪检测示，基因转染组S期和G₂/M期细胞比例减少、PI值降低，但加入EGF后细胞生长基本正常。DNA电泳检测示基因转染组未见凋亡带。结论: rhTGF-β₁对角膜内皮细胞增殖的影响具有剂量依赖性；TGF-β₁基因转染影响角膜内皮细胞增殖、但不诱发凋亡，其抑制作用可被外源性EGF拮抗。     

人源性抗HBc单链抗体真核表达载体的构建及其细胞内表达

目的：构建人源性抗HBc单链抗体的真核表达载体并在细胞内表达。方法： 采用DNA重组技术将特异性人源性抗HBc单链抗体基因插入真核表达载体pEGFP-c1；转染HepG2细胞，经G418筛选细胞，荧光倒置显微镜观察细胞内抗HBc单链抗体与绿色荧光蛋白融合表达情况，并用ELISA法检测HBc单链抗体基因的细胞内表达。结果： 成功地构建了人源性抗HBc单链抗体的真核表达载体。转染HepG2细胞并筛选后，经荧光倒置显微镜观察，细胞内有绿色荧光蛋白表达；ELISA检测细胞内表达的单链抗体片段具有HBcAg结合活性。结论： 人源性抗HBc单链抗体的真核表达载体的构建并在细胞内成功表达，为胞内抗HBc单链抗体的进一步研究奠定了基础。     

重组腺病毒载体介导共刺激分子B7.1基因对儿童肝母细胞瘤体外淋巴细胞增值的影响

目的研究含hB7-1基因的重组腺病毒载体对儿童肝母细胞瘤体外淋巴细胞增值的影响。方法以腺病毒为载体,将hB7-1基因转入HepG2细胞,以FCM检测HepG2和HepG2/hB7-1细胞表面B7-1分子的表达情况。观察HepG2和HepG2/hB7-1细胞的生长曲线。用混合淋巴细胞培养法检测瘤苗对T淋巴细胞增殖的影响。结果HepG2细胞表面B7-1分子表达水平低,其阳性率为1.1%。而HepG2/hB7-1的B7-1分子表达阳性率达到18.5%,B7-1基因的表达水平提高16.8倍。HepG2和HepG2/BB-102的生长曲线相比,后者生长曲线上升减缓,生长速度减慢。B7-1分子的表达促进了淋巴细胞的增殖,较对照组有显著性差异(P<0.05)。结论1.HepG2表面B7-1分子低水平表达是其弱免疫原性的主要原因。2.含hB7-1基因的重组腺病毒载体转染HepG2可以获得B7-1分子高表达的细胞株。3.重组腺病毒载体的转染可以降低肝母细胞瘤细胞的恶性表征。4.转染含hB7-1基因的瘤苗可以促进T淋巴细胞的增殖。