重组人Ⅱ型胶原蛋白免疫原性多肽表达的研究

目的 构建编码人Ⅱ型胶原蛋白250-270多肽片段（HuCⅡ250-270)的多聚基因，以获得高效表达，高度可溶和便于纯化的重组多肽基因。方法 选用大肠杆菌（E.coli)偏爱密码子优化HuCⅡ250-270的基因组成，通过化学合成和PCR法，获得HuCⅡ250-270的基因，并利用BanHI和BglⅡ同裂酶进行酶切位点串联获得6聚体，对影响重组HuCⅡ250-270表达的各种因素进行系统研究，以获得优化表达的条件，对表达产物进行分离纯化。结果 酶切分析和DNA测序证实，6聚目的基因的构建正确，融合表达的量明显高于非融合表达，在优化条件下，可达30%，表达产物的可溶性明显提高（在90%以上），其相对分子质量（Mr)与预期的相符，纯化后的纯度达90%以上。结论 实现了HuCⅡ250-270的高效表达，为研究类风湿性关节炎的发病机制和治疗提供了实验依据。为在原核细胞中高效表达的胶原蛋白的功能性小片段，提供了可供参考的借鉴。     

重组人Ⅱ型胶原250-270多肽对特异性体液免疫的抑制作用

目的:研究口服重组人Ⅱ型胶原250-270多肽(CⅡ250-270)对胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠特异性体液免疫反应的抑制作用,为应用口服CⅡ250-270治疗类风湿关节炎提供理论依据。方法:ELISA测定加强免疫后小鼠血清中抗原特异性抗体的表达,ELISPOT检测小鼠脾脏淋巴细胞中抗原特异性抗体形成细胞。结果:口服重组人CⅡ250-270小鼠血清中抗CⅡ和抗CⅡ250-270的IgG抗体水平[A值分别为(0.82±0.02)、(0.84±0.04)]比CⅡ免疫对照组[抗CⅡ的IgG抗体水平,A值为(1.01±0.06)]显著降低,而且特异性抗CⅡ250-270的IgG抗体反应在口服多肽组被明显抑制(P<0.01);口服重组人CⅡ250-270小鼠的CⅡ和CⅡ250-270特异性抗体形成脾细胞的增殖频率分别为(158±9计数/孔)、(181±10计数/孔),比CⅡ免疫对照组[CⅡ特异性抗体形成脾细胞的增殖频率为(247±16计数/孔)]也显著减少(P<0.05)。结论:口服重组人CⅡ250-270多肽具有抑制CIA小鼠的特异性体液免疫的作用,可能是此疗法治疗CIA多发性关节炎的重要机制。     

抗B型葡萄球菌肠毒素高亲和力单链抗体的制备

目的 构建针对B型葡萄球菌肠毒素(SEB)的特异性单链抗体(scFv),并进行纯化和鉴定.方法 设计抗SEB高亲和力单克隆抗体(mAb) FMU-SEB-No.2重链和轻链可变区基因片段VH和VL的引物,利用RT-PCR技术,从本室制备的抗SEBmAb FMU-SEB-No.2杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL基因片段;然后通过在轻链引物上设计linker序列,重叠引物延伸法(SOE)将VH和VL基因拼接成scFv基因片段,并将其克隆入原核表达载体PGEX4T-1中;转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,融合蛋白经谷胱甘肽亲和层吸柱纯化.采用SDS-PAGE,Western blot,ELISA等方法对其表达水平和特异性进行分析.结果 成功从1株抗SEB mAb FMU-SEB-No.2杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL可变区基因,并通过linker序列将其拼接成scFv片段,大小约750 bp,编码250个氨基酸.PCR、酶切鉴定和测序结果表明表达载体构建成功.转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后,以可溶形式表达相对分子质量(Mr)约54 000的融合蛋白.经谷胱甘肽亲和层析法纯化融合蛋白,可获得纯度达90％以上的scFv,ELISA和Western blot法检测结果表明,可溶性scFv与抗原SEB有较强的结合活性.结论 成功构建并表达出抗SEB的特异性单链抗体.     

牛奶主要过敏原α_(s1)-酪蛋白全长与片段区基因的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

目的:克隆并表达牛奶中主要过敏原αs1-酪蛋白的全长及N端、C端两个片段区基因,用于筛选与制备牛奶主要过敏原的单克隆抗体。方法:利用RT-PCR技术克隆αs1-酪蛋白基因,测序后将目的片段克隆入原核表达质粒pET载体,转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,获得重组αs1-酪蛋白。用Ni2+亲和层析柱纯化,用Western blot和ELISA检测重组蛋白与牛奶过敏患者血清IgE的结合活性。结果:克隆获得αs1-酪蛋白全长的开放阅读框基因为645bp(含终止密码子),编码214个氨基酸。N、C端片段区基因(含终止密码子)分别为285、294bp,编码94、97个氨基酸。三种重组蛋白均能以可溶性表达形式纯化,经Western blot和ELISA检测都具有较好的免疫原性,而αs1-酪蛋白全长的免疫原性更强。结论:成功地克隆和表达了αs1-酪蛋白全长及N、C端两个片段区基因,为研制牛奶主要过敏原的单克隆抗体,制备牛奶主要过敏原的检测试剂奠定了基础。     

牛IgG2Fc受体(boFcγ2R)胞外区基因原核表达载体的构建及其表达

目的:构建牛Fcγ2R胞外区基因的原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达.方法:提取健康成年牛的白细胞总RNA,经RT-PCR扩增牛Fcγ2R胞外区基因片段,并将其克隆到载体pGEM-T Easy,经限制性内切酶EcoR I和 Not I双酶切鉴定及序列测定后,再将其亚克隆入原核表达载体pET28a中,构建重组质粒pET-2R,转化E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白.结果:获得682 bp的编码牛Fcγ2R胞外区基因片段.以构建的重组质粒pET-2R转化E.coli BL21(DE3)后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量(Mr)约为30 000的重组蛋白.SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coli BL21(DE3)的胞质中,Western blot检测表明该蛋白能和牛IgG2结合.结论:成功地构建了原核表达载体pET-2R,并表达出重组蛋白.为研究牛IgG和受体的相互作用机制及其介导的免疫反应打下了基础.     

鼠源性抗人HAAH mAb可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达

目的:从分泌抗人类天冬氨酰基β-羟化酶(HAAH)单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞G3/F11中,克隆出鼠源an-ti-HAAH mAb重、轻链町变区基因,构建Anti-HAAH的单链抗体(scFv),并进行scFv基因的蛋白表达.方法:提取杂交瘤细胞G3/F11的总RNA,通过RT-PCR扩增出VH和VL基因;再利用重叠延伸PCR(SOE-PCR),通过设计在引物上的linker序列,将VH和VL拼接为完整anti-HAAH scFv基因.将测序正确的scFv基因克隆入pHEN 1载体,并利用E.coli HB2151进行蛋白表达;通过SDS-PAGE,Western blot分析其表达状况,ELISA鉴定其抗原结合活性.结果:测序结果显示,本实验成功地构建出鼠源anti-HAAH VH-linker-VL scFv基因,且VH、VL均具有完整正确的小鼠抗体骨架区和互补决定区结构,所得的scFv基因片段全长744 bp,编码248个氨基酸.SDS-PAGE和Western blot分析表明,pHEN 1-anti-HAAH在E.coli HB2151可表达为Mr约27 000的可溶性scFv蛋白,表达量为7.8%.间接ELISA检测显示,可溶性鼠源anti-HAAH scFv蛋白具有较高的抗原结合活性.结论:成功扩增出的鼠源anti-HAAH mAb VH区和VL区基因,并构建为anti-HAAH scFv基因.然后,利用pHEN 1载体对anti-HAAH scFv基因进行成功表达,为进一步研究其生物活性及应用奠定了基础.     

大肠埃希菌尿液分离株β-内酰胺酶基因、AmpC酶基因和膜孔蛋白ompC基因研究

近年来,国内关于E.coli产β-内酰胺酶和AmpC酶耐β-内酰胺类药物的研究报道已有不少,但所涉及基因种类不够全面.为系统性地了解E.coli尿液分离株β-内酰胺酶基因、AmpC酶基因和膜孔蛋白ompC基因的存在和变异情况,本研究进行了E.coli可能存在的15种β-内酰胺酶基因、6种AmpC酶基因和膜孔蛋白ompC基因检测,结果3类基因均有检出,并发现了3株ompC基因新亚型,已登录美国GenBank(NB015:HQ333474,NB020:GQ501059,NB027:GQ501066).     

抗SEB单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的基因构建和表达

目的 从分泌抗SEB的单克隆抗体(FMU-SEB-No.1)杂交瘤细胞中,克隆出FMU-SEB-No.1重链和轻链可变区(VH和VL)基因,构建FMU-SEB-No.1单链抗体(scFv)的原核表达载体,并进行scFv基因的蛋白表达.方法 从FMU-SEB-No.1杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR扩增出VH和VL基因;通过在引物上设计linker序列,拼接VH和VL为完整FMU-SEB-No.1的scFv基因(FMU-SEB-scFv).将测序正确的scFv基因克隆入PGEX4T-1载体,转化入E.coli BL21(DE3)进行蛋白表达.通过SDS-PAGE,Western blot法分析其表达水平和特异性,酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定其抗原结合活性.结果 测序结果显示,本实验成功克隆出FMU-SEB-No.1重链及轻链可变区基因,并成功构建FMU-SEB-scFv基因,所得的基因全长为750 bp,编码250个氨基酸.SDS-PAGE和Western blot分析表明,PGEX4T1-FMU-SEB-scFv在E.coli BL21(DE3)可表达为Mr约54 000的可溶型scFv/GST融合蛋白.间接ELISA检测结果表明,可溶型scFv/GST融合蛋白与SEB具有较高的抗原结合活性.结论 制备并鉴定了针对SEB的基因工程抗体,为开发出针对SEB的治疗性抗体奠定了实验基础.     

1981年中美分子生物学联合招生(CUSBEMA)试题

双链环状赫黼辫耘删双链环状的鳞耐拯潮缝蠹爵蓉墙跑确蝌癜渔}通《■成.当甩8懈漭.卿盼黼谴雨劫璃棼。莉.蹰就s篙咧.删时,经凝胶电袜;擦如下。,, ‘. .焉 (b电备爱斑E黼蝌决葬黼廊餐绫棼彳一tl ’(2)E I的结果与E I类似. 1. Ⅻ (3)E I将SV40DNA裂解成3个片段..二^. 。。 片段A(为基因组长的60%) ‘ 。。。、· 、-～.、 .一 片段B(为基因组长的30%) 片段C(为基}目组长的lo%7 E I和EⅡ特异裂解SV40基因组的位点经,定位和制刚.分圳盯o.f{70.70处.双消化作用(即用(上接封四)......口~侧..口.... 实验DNA,一竺兰--翌.童一壹一_HPa 1 …     

致癌物质优先与p53突变热点中的甲基化CpG岛结合

人类癌症的主要突变热点位于p53基因的CpG序列,一般认为这些位点的大多数突变源于甲基化咆嘧啶的内源性脱氨基,其中较多地发生在一些密码子部位,而致癌物质则优先与这些位点结合。 从含有p53的质粒中分离出包含第5、7、8外显子的p53基因片段,质粒pAT153p53p来自E.coli,为了标记含第8外显子序列的DNA片段,质粒DNA先用AvaⅡ消化使之成为线状,再用~(32)P在5＇端际记。然后用Ⅱ型限制酶Ssp Ⅰ消化已标记的DNA片段,产生单链末端标记片段。为了标记含第7外显子序列的DNA片段,由AvrⅡ将质粒DNA     

致肾盂肾炎大肠杆菌132特异性基因的筛选

目的通过抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,比较致肾盂肾炎大肠杆菌132(UPEC132)与非致病性E.coli K-12 MG1655之间基因组的差异,筛选UPEC132特有的基因片段。方法应用SSH技术构建UPEC132(tester)与非致病性E.coli K-12 MG1655(driver)菌株差异DNA消减文库,经PCR和斑点印迹法筛选鉴定阳性克隆,并进行测序及生物信息学分析。结果获得约1600个重组菌的UPEC132消减文库,随机挑取其中的300个克隆,有37个含有UPEC132特异的DNA序列。特异性片段测序后进行生物信息学分析,发现与其相关的37个基因为UPEC132所特有,其中1个为新发现的DNA片段,9个为与致病相关基因,7个为与代谢和物质转运相关基因,2个为与外膜蛋白相关基因,3个为与调节相关基因,10个为未知功能蛋白的基因,其他5个为功能未分类的基因。结论SSH技术是筛选病原菌特异基因的有效方法,已确定了37个UPEC132的特异基因,为进一步阐明其致病分子机制打下了基础。     

腺病毒转染法构建表达乙型肝炎病毒核心蛋白小鼠肝癌细胞系及其在乙肝疫苗评价中的应用

目的 构建一种可高效表达乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)核心蛋白(HBc)C57BL/6小鼠来源肝癌细胞系,并以其作为靶细胞评价乙肝基因疫苗在C57BL/6小鼠体内所引起的HBc特异性细胞毒性T细胞(CTL)的活性.方法 以HBV全基因组为模板,采用PCR方法扩增HBc基因,插入AdEasy腺病毒穿梭载体,构建携带HBc蛋白的腺病毒穿梭载体AD-HBc,电转携带有腺病毒骨架质粒(Ad-Easy)的E.coli BJ5183感受态细胞,获得重组腺病毒质粒AD-CMV-HBc,经PmeⅠ线性化处理后转染HEK293细胞进行包装得到相关的重组腺病毒,再感染C57BL/6小鼠来源肝癌细胞系Hepa1-6.结果 成功构建表达HBc蛋白的重组腺病毒,在体外对Hepa1-6细胞的感染率几乎为100％,并且HBc蛋白得到高效表达.以此为靶细胞用于pVAX1-HBc基因疫苗免疫C57BL/6小鼠产生的CTL活性的体外检测.结论 我们成功构建HBc蛋白表达的靶细胞系,对研究乙肝病毒核心抗原(HBcAg)所引起的细胞免疫反应及乙肝发病机理等方面有重要意义.     

HLA-DRB1结合性变构肽对T细胞活化的竞争性抑制作用

目的：研究去除T细胞受体（TCR）识别表位的HLA-DRB1结合性Ⅱ型胶原（CⅡ）变构肽对T细胞活化的抑制作用。方法：将人CⅡ的抗原性片段（CⅡ263-272）中与T细胞识别有关的268—270位氨基酸分别用丙氨酸和甘氨酸替换，形成CⅡ变构肽S268-270，并将该多肽与表达HLA-DR1的抗原呈递细胞（APC）及抗原性原型CⅡ263-272多肽共同孵育，研究变构肽S268-270在竞争性抑制CⅡ263-272与HLA-DR1分子结合中的作用；利用HLA-DR1转基因APC及其特异性T细胞，研究S268-270对抗原性CⅡ263-272及流感病毒血凝素（HA）306—318诱导的T细胞活化的抑制作用。结果：CⅡ变构肽S268-270可结合APC表面的HLA—DR1分子，并可抑制CⅡ263-272及HA306-318两种不同抗原诱导的HLA-DR1限制性T细胞活化。结论：替换CⅡ263-272中与TCR识别有关的氨基酸所形成的CⅡ变构肽S268-270可与APC表面的HLA-DR1分子结合，并可抑制HLA-DR1结合性抗原肽CⅡ263-272及HA306-318诱导的T细胞活化。CⅡ变构肽S268-270可能对类风湿关节炎患者的HLA-DR1限制性T细胞异常活化具有抑制作用。     

胰高血糖素衍生物在大肠杆菌的克隆表达和纯化

 目的 通过基因工程途径获得胰高血糖素衍生物。 方法 根据胰高血糖素基因及凝血酶酶切位点序列，分段合成引物行 PCR 扩增，以 PCR 扩增得到的胰高血糖素-甘氨酸基因序列和 pET-30a 质粒转化 E.coli DH5α，获得重组质粒 pET-G。将重组质粒 pET-G 转化至 E.coli BL21(DE3)，重组菌株命名为 E.coli BL21[pET-G]。以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，对表达产物进行SDS-Tricine- PAGE[十二烷基硫酸钠-三（羟甲基）甲基甘氨酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳]分析和蛋白质印迹分析。对表达产物行Ni2+-NTA亲和层析纯化、凝血酶酶切和高效液相色谱（HPLC）纯化后，行 SDS-Tricine-PAGE分析和飞行质谱分析，并以 ELISA 方法检测其免疫活性。 结果 PCR 扩增获得的条带与预期的DNA表达片段大小一致，重组质粒 pET-G 测序结果与预期完全一致。SDS- Tricine-PAGE 和蛋白质印迹分析显示 E.coli BL21（DE3）的表达产物相对分子质量与预期相符。经亲和层析纯化、凝血酶酶切和 HPLC 纯化后得到了完整的重组胰高血糖素-甘氨酸衍生物，SDS-Tricine-PAGE 分析显示其相对分子质量约为 3500，飞行质谱分析相对分子质量为 3531，二者基本一致。ELISA 检测表明重组胰高血糖素-甘氨酸衍生物具有胰高血糖素免疫活性。 结论 采用基因工程技术在大肠杆菌中成功表达了胰高血糖素-甘氨酸衍生物，为通过体外酰胺化途径研制酰胺化胰高血糖素奠定了基础。     

中国人家族性腺瘤性患肉病患者结肠腺瘤性患肉病基因的胚系突变

目的 探讨中国人家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis,FAr)患者的结肠腺瘤性息肉病(adenomatous polyposis coli,APC)基因的胚系突变类型.方法 对9个FAP家系18名成员进行多重连接依赖性探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)检测APC基因有无大片段缺失.再应用PCR扩增APC基因的15个外显子区域,经变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)对每个扩增片段进行筛查,流出峰异常的片段,经DNA测序验证小片段的改变.结果 9个家系中有3个家系发现有APC基因的胚系突变:家系2为c.3184-3187 del CAhA,家系4为c.5432C＞T,家系9为c.3925-3929 del AAAAG.3种突变中c.5432C＞T在数据库中未见报道.结论 中国人不同的APC基因的胚系突变可引起FAP;无APC胚系突变的FAP患者的发病可能存在其他的机制.     

E.coli DNA抗肿瘤免疫的实验研究

目的探讨 E.coli DNA抗肿瘤免疫的效果及免疫作用机制。方法纯化提取大肠埃希菌染色体 DNA(E.coliDNA)进行抗肿瘤治疗及免疫学指标测定。结果 E.coli DNA体内多种途径给药均可抑制肿瘤生长 ,增强正常小鼠 NK细胞杀伤活性 ,在荷瘤小鼠亦测出 NK/ MΦ 细胞的杀伤活性增强 ,对荷瘤所致的 NK细胞功能下降有提高作用 ,还可诱生荷瘤小鼠体内 γ- IFN,调节其 TNF- α水平。结论 E.coli DNA具有抗肿瘤免疫特性 ,为微生物 DNA制剂开发应用于抗肿瘤治疗提供了科学依据。     

人Cyclin E原核表达载体的构建及表达

目的：构建人Cyclin E基因原核表达载体,并在E.coli BL21中表达并纯化。方法：PCR扩增人Cyclin E基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET32a（＋）中,构建重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E。经限制性内切酶EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果：获得全长约为1200bp的人的Cyclin E基因片段。以构建的重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E转化E.coli BL21后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约60000的融合蛋白。经SDS-PAGE、Western blot分析显示,诱导表达的蛋白为Cyclin E。结论：成功地构建了表达载体pET32a（＋）-Cyclin E,并表达出重组蛋白His-Cyclin E,为进一步筛选在体内外能与Cyclin E和CDK2结合的新蛋白奠定了基础。     

幽门螺杆菌Lpp20重组蛋白的表达、纯化及其免疫活性初步研究

目的表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)脂蛋白Lpp20基因的重组蛋白,并检测其免疫活性。方法应用PCR技术从H.pylori标准株26695染色体DNA中扩增出Lpp20的编码基因片段,将其克隆至表达载体pGEX-6P-2上,在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21中表达并进行GST亲和层析纯化,用Western blot方法检测纯化产物重组Lpp20(recombinantLpp20,rLpp20)的免疫反应性。免疫C57BL/6小鼠后,以rLpp20为包被抗原建立间接ELISA法对免疫小鼠血清进行特异性抗体检测;ELISA双抗体夹心法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL-2、IL-4水平;MTT比色法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应等指标以分析rLpp20的免疫活性。结果扩增的lpp20全长528 bp,与GenBank上公布的H.pylori 26695株lpp20序列作BLAST比较,结果完全一致;成功构建了pGEX-6P-2/Lpp20重组质粒,表达的rLpp20 M_r 43 000,纯化产物可被鼠抗H.pylori抗体识别;以...     

HBV/HEV融合二价抗原原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的:构建一个能够表达出乙/戊型肝炎二价抗原的重组原核表达载体,并在E. coli BL21(DE3)中表达.方法:采用PCR方法扩增出HBV的S基因和HEV的ORF2编码区的羧基末端中的414～606 aa的基因片段,将两片段连接后克隆入T载体,得到融合基因,将融合基因克隆入含有Ω增强子的pTΩ-TE高效的原核表达载体中,构建重组质粒pTΩ-TTSE.将pTΩ-T7SE转化E. coli BL21(DE3),经IPTG诱导后用Western blot鉴定融合蛋白.结果:获得全长为1 284 bp的融合的HBV/HEV的基因片段.已构建的重组质粒pTΩ-T7SE转化E.coli BL21(DE3)后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量(Mr)约为50 000重组蛋白.SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于胞质中,表达量约占全菌蛋白的30.52%.Western blot结果表明在Mr为50 000处可见特异性着色带.结论:成功构建了原核表达载体pTΩ-T7SE,并表达出目的蛋白,为研制预防乙型和戊型肝炎双价疫苗提供了实验技术基础.